本發(fā)明屬于扇貝雜交育種的后裔鑒定技術(shù)，尤其是涉及紫扇貝、海灣扇貝與雜交后代母本來源的鑒定方法。

背景技術(shù)：

海灣扇貝(Argopecten irradians)自1982年從美國引進(jìn)以來,產(chǎn)量逐年增加，已成為中國最重要的養(yǎng)殖貝類之一，但是近年來出現(xiàn)的種質(zhì)退化問題成為制約中國扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。

紫扇貝(Argopecten purpuratus)是南美洲太平洋海岸的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)貝類，大小中等，廣泛養(yǎng)殖于智利和秘魯，并使智利成為僅次于中國的扇貝養(yǎng)殖大國。為了改善海灣扇貝的種質(zhì)，提高扇貝養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，王春德等于2008年從秘魯引進(jìn)紫扇貝并與海灣扇貝成功雜交，培育出生長優(yōu)勢極其顯著的兩種雜交子一代，即紫海雜交扇貝(紫扇貝卵子×海灣扇貝精子)和海紫雜交扇貝(海灣扇貝卵子×紫扇貝精子)(王春德等，2009；Wang et al,2011)。但紫扇貝和海灣扇貝均為雌雄同體的動物，在繁育時(shí)兩種扇貝均同時(shí)排放精子和卵子，在育種實(shí)踐中存在著精子或卵子污染的問題，為確保育種進(jìn)程的順利進(jìn)行并確證后代的譜系，經(jīng)常需要確定某一后代是否為真正的雜交后代及其父母本來源，因此需要建立一種方法來快速鑒定其親本來源尤其是母本來源。

利用來自核基因組的分子標(biāo)記(如微衛(wèi)星標(biāo)記)鑒定方法雖然也可以用來鑒定雜交后代是否為真正的雜交種，但是無法辨別其父母本來源，導(dǎo)致雜交后代譜系混亂、難以對優(yōu)良的品系進(jìn)行篩選等問題，而且在雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用作雜交的母體不同，其雜交子一代性狀的表現(xiàn)也不同，有的甚至完全表現(xiàn)為母體的性狀，因此快速鑒定雜交扇貝的母本來源是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種紫扇貝、海灣扇貝與雜交后代母本來源的鑒定方法，該方法是基于線粒體DNA序列的差異性而設(shè)計(jì)的標(biāo)記引物，并利用該標(biāo)記引物序列鑒定紫扇貝、海灣扇貝與雜交后代母本的來源，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

研究已發(fā)現(xiàn)，線粒體基因組嚴(yán)格遵循母系遺傳規(guī)律，且缺少基因重組，雜交后代的線粒體必定來自其母本，因此通過鑒定其線粒體DNA的來源就可以確定雜交種的母本來源。本發(fā)明根據(jù)海灣扇貝和紫扇貝線粒體基因組差異性特點(diǎn)，專門設(shè)計(jì)了一對特異性引物，以便通過PCR方法鑒定雜交后代線粒體基因的類型，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒定雜交扇貝的母本來源。

本發(fā)明基于以下構(gòu)思：已有研究表明，扇貝的線粒體基因組遵循嚴(yán)格的母系遺傳，即后代的線粒體基因與其母本線粒體基因型完全相同，而與父本的線粒體基因型無關(guān)；具體到海灣扇貝和紫扇貝均為Argopecten屬的近緣種，雖然其線粒體基因組序列相似性高達(dá)82.34％，但仍可以根據(jù)兩者線粒體基因序列的少許差異設(shè)計(jì)出特異的引物，從而區(qū)分雜交后代線粒體基因的來源，為育種工作的順利進(jìn)行提供技術(shù)支持或保障。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：紫扇貝、海灣扇貝與雜交后代母本來源的鑒定方法，所用標(biāo)記引物為mtDNA-Z，分別由左端引物序列mtDNA-Z-F：5’-TATGAGGTGTCCCCCAAGTC-3’和右端引物序列mtDNA-Z-R：5’-ACTGGCAGACAAACAAATCGT-3’組成。

本發(fā)明利用上述標(biāo)記引物對紫扇貝、海灣扇貝及其雜交后代母本來源進(jìn)行鑒定的方法如下：

(1)分別取待鑒定的紫扇貝、海灣扇貝及雜交后代紫海雜交扇貝、海紫雜交扇貝的閉殼肌，直接用常規(guī)的方法提取上述扇貝的全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終濃度100ng/μL保存在-20℃?zhèn)溆茫?/p>

(2)分別以提取的上述扇貝的DNA為模板，用上述引物mtDNA-Z對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan),1×PCR buffer(含1.5mM MgCl₂)和0.2mM dNTP mix,上下游引物各1μM,50ngDNA模板；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察；對于紫扇貝和海灣扇貝，如果在近460bp處有PCR特異性條帶出現(xiàn)，則證明此扇貝為紫扇貝，如果在近460bp處沒有PCR特異性條帶出現(xiàn)，則證明此扇貝為海灣扇貝；對于紫海雜交扇貝和海紫雜交扇貝，如果在近460bp處有PCR特異性條帶出現(xiàn)，則確定其母本為紫扇貝，如果在近460bp處沒有PCR特異性條帶出現(xiàn)，則確定其母本為海灣扇貝。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明基于線粒體DNA序列的引物設(shè)計(jì)排除了核基因組DNA的影響，因此不需要單獨(dú)提取線粒體DNA來進(jìn)行鑒定，利用常規(guī)提取的全基因組中的少量線粒體DNA，即可用標(biāo)記引物mtDNA-Z進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后就能夠得到鑒定結(jié)果，因此周期時(shí)間短，方法簡便，可大批量進(jìn)行，快速高效。

(2)本發(fā)明基于線粒體DNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物能夠快速簡便地鑒別出兩個(gè)雜交后代及其兩個(gè)親本。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中所用標(biāo)記引物mtDNA-Z PCR擴(kuò)增紫扇貝、海灣扇貝產(chǎn)物的電泳圖，其中1-6：海灣扇貝，7-12:紫扇貝，M:DL 2000。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中所用標(biāo)記引物mtDNA-Z PCR擴(kuò)增雜交后代紫海扇貝、海紫扇貝產(chǎn)物的電泳圖，其中1-8：海紫扇貝，9-16：紫海扇貝，M:Marker。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1以紫扇貝、海灣扇貝為例，進(jìn)行鑒定的結(jié)果。

(1)分別取6個(gè)紫扇貝和6個(gè)海灣扇貝的閉殼肌，直接用天根DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終濃度100ng/μL保存在-20℃?zhèn)溆?，然后?jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察以確保提取的全基因組DNA的純度和質(zhì)量符合要求。

(2)以上述提取的紫扇貝和海灣扇貝的DNA為模板，用上述引物mtDNA-Z對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan)，含1.5mM MgCl₂的1×PCR buffer,0.2mM dNTP mix，上下游引物各1μM，50ngDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察電泳結(jié)果。

(3)電泳結(jié)果鑒別表明，在所有的海灣扇貝中均未擴(kuò)增出條帶(見圖1)，而在所有的紫扇貝均在460bp附近擴(kuò)增出明顯的條帶，大小與預(yù)期的463bp相符。將上述紫扇貝中的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序結(jié)果大小為460bp，與紫扇貝的線粒體DNA序列進(jìn)行DNAMAN比對，測得序列與紫扇貝線粒體DNA的片段相似度為97.81％(見表1),從而排除了mtDNA-Z引物受核基因組的影響，確定為以紫扇貝線粒體DNA作為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。顯然本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能夠鑒定出紫扇貝與海灣扇貝。

表1測序結(jié)果比對表

實(shí)施例2以紫海雜交扇貝、海紫雜交扇貝為例進(jìn)行鑒定的結(jié)果。

(1)分別取紫海雜交扇貝(紫扇貝(卵)×海灣扇貝(精))和海紫雜交扇貝(海灣扇貝(卵)×紫扇貝(精))各8個(gè)的扇貝閉殼肌，用天根DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)分別提取全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終濃度100ng/μL保存在-20℃?zhèn)溆?，提取的全基因組DNA經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察以確保提取的全基因組DNA的純度和質(zhì)量符合要求。

(2)以上述提取的紫海雜交扇貝和海紫雜交扇貝的DNA為模板，用上述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan)，1×PCR buffer(含1.5mM MgCl₂),0.2mM dNTP mix，上下游引物各1μM，50ngDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察電泳結(jié)果。

(3)電泳結(jié)果鑒別表明，所有的紫海雜交扇貝均在460bp附近擴(kuò)增出明顯的條帶，大小與預(yù)期的463bp相符，而在所有的海紫雜交扇貝中均未擴(kuò)增出條帶(見圖2)，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對鑒定紫扇貝與海灣扇貝雜交后代的母本來源是無誤的。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 紫扇貝、海灣扇貝與雜交后代母本來源的鑒定方法

<160> 1

<210> 1

<211> 463

<212> DNA

<213> 紫扇貝（Argopecten purpuratus）

<220>

<221> misc_feature

<400> 1

tatgaggtgt cccccaagtc ttgggttttt gggggaggtt ataataggga tagggatttg 60

tagaattttt ccacaaggct atattttttg ttttattcta ctattctttt tcggtggtgc 120

aagaataatg gtgctttaca ccagggtaat acacggaagg ttttcgactg ccctggttcc 180

tggggggtct ggaattacga agtgtagtta tcttggtctt ttccatgggg tgccgttaat 240

tattttgttt tttttacctg cgttcttgtc tttgcgggct cttcggagcg gtctttaaga 300

agtagggcta aagcccacgc actgttgaca gagtaggaga ggaggaagta gaaaaccaga 360

ttaaatgggt ggcgagagcg atgagattgt acaagacccg ggataaaggc taagagaagg 420

ggtctcccga tcgaattagg gtacgatttg tttgtctgcc agt 463