本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)乙型腦炎病毒ns1蛋白的保護(hù)性單克隆抗體及其對(duì)應(yīng)抗原位點(diǎn)的應(yīng)用

背景技術(shù)：

乙型腦炎病毒不僅引起人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，還可引起豬的繁殖障礙性疾病，是一種重要的人畜共患傳染病病原。乙型腦炎病毒主要侵入神經(jīng)系統(tǒng)，包括丘腦，基底神經(jīng)節(jié)，腦干，小腦，大腦皮層和脊髓，導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如脊髓灰質(zhì)炎樣嚴(yán)重癱瘓，無菌性腦膜炎和腦炎，71％的患者都是基底神經(jīng)節(jié)和丘腦損傷，嚴(yán)重出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，43％患者腦干損傷，經(jīng)常出現(xiàn)急性呼吸衰竭癥狀，甚至死亡。患者的病死率與臨床癥狀高達(dá)10％～50％，而且大約一半乙型腦炎病毒感染幸存者都有嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。在亞洲每年大約50,000乙腦病例中就有15,000例死亡。2006年7月山西發(fā)生日本乙型腦炎流行，共60多人發(fā)病，其中19人死亡，造成了較大的社會(huì)影響。

目前已應(yīng)用的乙型腦炎病毒疫苗為弱毒疫苗和滅活疫苗。其中滅活疫苗是世界衛(wèi)生組織推薦的在全球應(yīng)用的疫苗，雖然該疫苗具有較高的安全性，但是在免疫保護(hù)力上卻不夠理想，經(jīng)常出現(xiàn)免疫失敗的報(bào)道。乙型腦炎病毒弱毒疫苗由我國(guó)自行研制，該疫苗具有較高的免疫保護(hù)效率，但是由于安全性不夠高，目前僅在我國(guó)使用，同時(shí)兒童是我國(guó)乙型腦炎病毒的主要免疫人群，考慮到安全性問題，兒童使用的疫苗仍以滅活疫苗為主。因此開發(fā)兼具高保護(hù)力和高安全性的乙型腦炎疫苗具有重要的意義。更為重要的是，目前尚沒有針對(duì)乙型腦炎病毒的治療技術(shù)，導(dǎo)致了該病的死亡率高，即使康復(fù)造成的后遺癥也高。

乙型腦炎病毒編碼兩個(gè)重要的免疫保護(hù)蛋白，分別為囊膜蛋白(e)和非結(jié)構(gòu)蛋白1(ns1)。e蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白，免疫后可以誘生中和抗體，為機(jī)體提供保護(hù)作用。ns1蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白，在體內(nèi)也具有很高的抗原性，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體在細(xì)胞中沒有中和活性，但是在動(dòng)物體內(nèi)卻具有比結(jié)構(gòu)蛋白e更高的免疫保護(hù)效率。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)e蛋白的中和抗體可在體內(nèi)起到治療作用，然而針對(duì)乙型腦炎病毒ns1蛋白開發(fā)的治療技術(shù)尚未有報(bào)道。通過篩選針對(duì)ns1蛋白的保護(hù)性單克隆抗體，應(yīng)用于乙型腦炎的治療，則具有較高的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其目的之一是提供一種能夠?qū)σ倚湍X炎病毒有特異性的單克隆抗體。

本發(fā)明的目的之二是提供一種能夠?qū)σ倚湍X炎病毒起到保護(hù)作用的氨基酸序列。

本發(fā)明通過篩選得到了一株在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)乙型腦炎病毒具有免疫保護(hù)功能的單克隆抗體，并對(duì)抗原位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，得到一個(gè)具有較好免疫保護(hù)活性的抗原位點(diǎn)，具有較高的應(yīng)用前景。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

申請(qǐng)人通過制備得到一株分泌乙型腦炎病毒ns1蛋白具有保護(hù)性作用單克隆抗體的jevns1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2b8，于2016年5月16日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號(hào)為cctccno：201699。

將所述的單克隆抗體的通過靜脈注射小白鼠后，可起到很好的治療效果。

所述的單克隆抗體能識(shí)別ns1蛋白中的²²⁵wpethtlwgd²³⁴氨基酸片段，該片段的氨基酸序列如序列表seqidno：1所示。

本發(fā)明中所述具有保護(hù)作用的多肽序列為wpethtlwgd(其氨基酸序列見序列表seqidno:1所示)，經(jīng)過鑒定其中的t、h、l、w氨基酸為關(guān)鍵氨基酸。

本發(fā)明得到具有保護(hù)作用的多肽序列，可用于多肽疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗以及基因工程多價(jià)疫苗的開發(fā)。

本發(fā)明的多肽序列可通過合成產(chǎn)生，也可以通過基因工程表達(dá)獲得。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明將ns1的單克隆抗體用于乙型腦炎病毒的治療，目前仍未有基于乙型腦炎病毒ns1治療的方法，本發(fā)明為乙型腦炎的治療提供了一種新方法。

2.本發(fā)明制備的單克隆抗體可通過雜交瘤細(xì)胞分泌，也可以通過基因工程改造成人源或者豬源基因工程抗體，具有很強(qiáng)的適用性。

3.本發(fā)明的保護(hù)性抗原表位可用于多種疫苗的開發(fā)，針對(duì)性強(qiáng)，可構(gòu)建具有更高免疫保護(hù)效果的疫苗。

4.ns1蛋白在乙型腦炎病毒中提供的保護(hù)力達(dá)到100％，且針對(duì)ns1的抗體不會(huì)產(chǎn)生抗體依賴性增強(qiáng)作用，針對(duì)ns1的治療效果比針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白效果更理想。

附圖說明：

序列表seqidno：1是本發(fā)明制備的多肽序列；序列長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸。

圖1：是本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。

圖2：本發(fā)明中ns1基因的pcr擴(kuò)增得到的跑膠圖。附圖標(biāo)記說明：圖2中的lane1是ns1基因的pcr產(chǎn)物，圖2中的lane2為dnamarker。

圖3：本發(fā)明中使用的原核表達(dá)載體pet28a質(zhì)粒圖譜。

圖4.本發(fā)明中表達(dá)并純化的乙型腦炎病毒ns1蛋白。附圖標(biāo)記說明：lane1為表達(dá)純化的ns1蛋白，lane2為蛋白質(zhì)marker。

圖5.本發(fā)明制備的單克隆抗體2b8與乙型腦炎病毒反應(yīng)的間接免疫熒光鑒定。附圖標(biāo)記說明：圖5a是用乙型腦炎病毒感染的細(xì)胞，可發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)明亮的陽性反應(yīng)；圖5b是未用乙型腦炎病毒感染的對(duì)照，呈陰性結(jié)果。

圖6：本發(fā)明制備的單克隆抗體2b8與乙型腦炎病毒ns1蛋白的westernblot鑒定。附圖標(biāo)記說明：lane1顯示單克隆抗體2b8可與ns1蛋白形成明顯的雜交斑點(diǎn)，lane2為對(duì)照組與2b8單抗無反應(yīng)，說明抗體特異性良好。

圖7：ns1的分段表達(dá)策略。附圖標(biāo)記說明：圖7中左邊一列a-i的字母代表對(duì)不同ns1片段的命名，右邊一列的數(shù)字代表該片段在ns1蛋白中的位置。

圖8：不同片段的ns1與2b8單抗的反應(yīng)性。附圖標(biāo)記說明：圖8中的上方anti-his或2b8代表分別用不同的抗體與蛋白反應(yīng)；a-i字母標(biāo)識(shí)代表圖7中所述的不同ns1蛋白片段。

圖9：?jiǎn)蝹€(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變蛋白與2b8單抗的反應(yīng)原性。附圖標(biāo)記說明：圖9a中為不同氨基酸突變的ns1蛋白與his抗體的反應(yīng)性；圖9b為不同氨基酸突變的ns1蛋白與2b8單抗的反應(yīng)性。泳道1為未突變蛋白對(duì)照，2-7分別對(duì)應(yīng)于表2中的ka、kb、la、lb、ma、mb的突變。

圖10：本發(fā)明制備的單克隆抗體對(duì)乙型腦炎病毒攻擊的保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：用不同的單克隆抗體注射被乙型腦炎病毒感染的小白鼠，本發(fā)明的單克隆抗體2b8可達(dá)到80％的保護(hù)力，而本實(shí)驗(yàn)室制備的其它針對(duì)ns1的單抗則為0-20％之間。說明本發(fā)明制備的單克隆抗體2b8具有很好的治療效果。

圖11：多肽免疫保護(hù)的試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式：

以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，但不限制本發(fā)明的使用范圍。

實(shí)施例1乙型腦炎病毒ns1蛋白抗原的制備

1)抗原的克隆表達(dá)

以乙腦病毒ns1基因(genbank登錄號(hào)u47032.1)為模板，用引物forward：gcagaattcgacactggatgtgccattg，reverse：cagaagcttgagcatcaacctgtgatctaa進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下：taqdna聚合酶1ul、10×taqbuffer5ul、模板1ul、forward引物1ul、reverse引物1ul、dntp2ul、h2o39ul。擴(kuò)增條件如下：95度變性5分鐘，然后進(jìn)入循環(huán)：94度30秒、55度30秒、72度1分鐘，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)后，72度延伸10分鐘。pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠回收，酶切回收后連入到載體pet-28a(圖3)構(gòu)建重組表達(dá)載體質(zhì)粒，再將重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)菌株，37℃增殖，當(dāng)od630值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，向其中加入終濃度為0.8mm的iptg于28℃誘導(dǎo)12h。

2)重組蛋白包涵體提取

將重組菌用iptg誘導(dǎo)后，于8000rpm離心10min，收集菌體，用1×pbs洗滌菌體2次，用壓力破碎儀充分破碎。破碎的溶液經(jīng)8000rpm，離心15min，收集沉淀，棄上清。往沉淀中加19.7mlbuffera、0.3ml20％的skl(十二烷基肌氨酸鈉)貯存液、20ul的dtt混合液，劇烈攪勻，使其緩慢溶解，室溫靜置30min-2h。然后8000rpm離心15min，收集上清，加入終濃度為0.2％聚乙二醇4000(peg4000)，1mmol/l氧化型谷胱甘肽和2mmol/l還原型谷胱甘肽。最后用teph8.0透析2-3天，其間應(yīng)換液6-8次。透析后的蛋白用sds-page電泳檢測(cè)(圖4)，并測(cè)定蛋白濃度，分裝成小管后置-20℃保存?zhèn)溆?，作為小鼠免疫原及elisa的包被抗原。

實(shí)施例2乙型腦炎病毒ns1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備

(1)小鼠免疫

將上述制備的乙腦病毒ns1蛋白用pbs緩沖液稀釋到800ug/ml，與等體積完全弗氏佐劑充分乳化，選擇雌性5周齡balb/c小鼠4只，頸背部皮下兩點(diǎn)注射0.2ml。第15天時(shí)加強(qiáng)免疫1次(佐劑改用不完全弗氏佐劑，免疫劑量和部位與首次免疫相同)；第30天時(shí)再加強(qiáng)免疫1次(同上)。在第45天時(shí)斷尾采血，用間接elisa的方法檢測(cè)抗體水平，在第46天時(shí)對(duì)免疫效果最好的balb/c小鼠使用不加佐劑的ns1蛋白100ug腹腔注射沖擊免疫一次，三天后即可融合。

(2)sp2/0瘤細(xì)胞的制備

將凍存的sp2/0細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)至六孔板，然后收集細(xì)胞，用0.3ml基礎(chǔ)1640培養(yǎng)基重懸，注入balb/c小鼠背部皮下。待10～14天后小鼠背部形成腫瘤時(shí)用頸椎脫臼法處死，75％酒精浸泡5min，消毒皮毛。將小鼠固定于解剖盤中，無菌狀態(tài)下將腫瘤塊剪下，置勻漿器中，加5ml1640基本培養(yǎng)基充分研磨后，補(bǔ)加1640基本培養(yǎng)基至10ml，靜置5min，吸取上層的細(xì)胞懸液于另一離心管備用，再補(bǔ)加1640基本培養(yǎng)基至10ml，重復(fù)兩次。1000rpm離心10min去上清，以20ml1640基本培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。在另一50ml離心管中加入15ml淋巴細(xì)胞分離液，將sp2/0細(xì)胞懸液輕輕地加在分離液之上，1000rpm離心10min，用吸管吸取位于界面致密的白色細(xì)胞層，用1640基本培養(yǎng)基洗2遍，計(jì)數(shù)后備用。

(3)免疫脾細(xì)胞的制備

取免疫的balb/c鼠的脾臟，加3ml1640基本培養(yǎng)基于勻漿器中研磨，制備脾細(xì)胞，再補(bǔ)加10ml1640基本培養(yǎng)基于勻漿器中，同上重復(fù)2次。1000rpm離心10min去上清，細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)。

(4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

取未免疫的balb/c鼠，用吸管吸3ml1640液注入小鼠腹腔，吸打幾次，再將液體吸出放置于50ml離心管中，再重復(fù)一次，此為腹腔巨噬細(xì)胞。同上操作制備脾細(xì)胞懸液，并放入腹腔巨噬細(xì)胞管中。1000rpm離心10min去上清，細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)，用hat培養(yǎng)基懸浮后，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中待用。

(5)細(xì)胞融合

將sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞以體積比為1:10比例在50ml離心管中混勻，1500rpm離心10min。倒空上清(可用滅菌的濾紙吸干)，輕輕敲擊管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37℃水浴中。然后在1min內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37℃的融合用peg0.8ml，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌。繼續(xù)攪拌30秒后靜置1min。然后慢慢加入37℃預(yù)溫的1640基本培養(yǎng)基10ml，并不斷輕輕地?cái)嚢琛Ｗ詈缶徛尤?0ml1640基本培養(yǎng)基。1000rpm離心5min，去上清后37℃放置5-8min。用hat培養(yǎng)基懸浮，同時(shí)也用hat培養(yǎng)基懸浮飼養(yǎng)脾細(xì)胞與融合后的細(xì)胞混合，根據(jù)需要補(bǔ)加適量的hat培養(yǎng)基，均勻滴加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，約250μl/孔。置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后于第5天補(bǔ)加1滴hat培養(yǎng)基，第8-10天時(shí)換ht培養(yǎng)基100ul。待融合細(xì)胞集落長(zhǎng)至培養(yǎng)孔1/4時(shí)，進(jìn)行抗體檢測(cè)。

(6)分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞的篩選

采用間接elisa方法檢測(cè)。用ns1蛋白包被96孔酶聯(lián)板，并用0.5％的bsa37℃封閉1h，用洗滌液洗三次，然后加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清100ul，同時(shí)設(shè)陰、陽性血清對(duì)照，于37℃溫育30min，取出后洗滌三次，加入1:5000倍稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg，37℃反應(yīng)30min，取出后洗滌三次，加入底物顯色，用0.25％hf終止反應(yīng)之后，在630nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)od值。同時(shí)設(shè)sp2/0細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，od630大于陰性對(duì)照3倍的樣品為陽性。

(7)雜交瘤細(xì)胞的克隆化

經(jīng)間接elisa試驗(yàn)檢測(cè)為陽性的細(xì)胞孔，按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，克隆前一天制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞層。將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕地吹下，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。將細(xì)胞用培養(yǎng)基(ht)稀釋到每毫升5、10、50個(gè)細(xì)胞。將上述三個(gè)濃度的細(xì)胞懸液分別加入已制備好的飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中100μl/孔。使相應(yīng)的每孔分別含0.5、1和5個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)第4天換液一次，第5～6天仔細(xì)觀察各孔內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并記錄。在克隆后第10～14天，細(xì)胞長(zhǎng)滿1/4～1/2孔底時(shí)，即可檢測(cè)，如檢出細(xì)胞生長(zhǎng)孔有特異性抗體，可選擇抗體效價(jià)高，呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)，形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞孔，繼續(xù)同法再克隆，一般克隆3次。3次后陽性孔的雜交瘤細(xì)胞可移至24孔培養(yǎng)板，待24孔板中的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，再轉(zhuǎn)至6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，最后凍存雜交瘤細(xì)胞。

(8)針對(duì)不同抗原表位單克隆抗體的篩選

采用間接elisa法相加試驗(yàn)，計(jì)算相加指數(shù)(ai)來分析單抗決定簇，具體做法如下：

用ns1純化蛋白包被酶標(biāo)板，然后每孔加入各種單抗(均稀釋5倍)各100μl，以及各單抗兩兩組合各50μl，37℃孵育1h，后續(xù)步驟與常規(guī)elisa相同。根據(jù)下列公式計(jì)算ai。a1、a2分別為各株單抗的a值，a1+2為兩兩組合的混合單抗的a值。ai大于10％表示兩株單抗針對(duì)不同抗原表位，具有相加效應(yīng)；ai小于10％則表示兩株單抗針對(duì)抗原表位相同或相近。ai＝(a1+2-a1)/a2×100％。結(jié)果篩選出五株針對(duì)不同抗原表位的單克隆抗體，分泌這些抗體的雜交瘤細(xì)胞分別為1h9、2b8、3h1、4f12、4g11(結(jié)果見表1)。

表1單抗相加實(shí)驗(yàn)

注:“/”表示未檢測(cè)

9)單克隆抗體的生產(chǎn)

對(duì)已經(jīng)建株的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)同時(shí)在balb/c小鼠體內(nèi)誘生小鼠腹水生產(chǎn)單克隆抗體，取8周齡的balb/c小鼠，腹腔注射滅菌的不完全弗氏佐劑0.5ml/只，3天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×10⁵～5×10⁶/只，7～10天后抽取小鼠腹水，1200rpm離心10min取上清，凍存?zhèn)溆谩?/p>

10)單克隆抗體純化

按照igg抗體純化試劑盒的操作說明，純化該腹水以獲得乙腦ns1蛋白單克隆抗體。

實(shí)施例2本發(fā)明制備的單克隆抗體與ns1蛋白反應(yīng)原性的間接免疫熒光鑒定

將hela細(xì)胞接種至24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70％-80％后，用不含血清的dmem洗兩遍；然后加入適量無血清dmem，同時(shí)接jev病毒，培養(yǎng)1-2h后換成2％的培養(yǎng)基(2％的四季青+1％雙抗+97％dmem)；36h后，棄去培養(yǎng)基，用pbs輕輕洗兩次，5min/次；加入100％甲醇室溫固定30min，pbs洗滌三次，5min/次；封閉液封閉1h，pbs洗滌三次，5min/次；加入待檢單抗，37℃溫箱孵育1h，pbs洗三次，5min/次；避光加入體積為1:500稀釋的fitc標(biāo)記的羊抗鼠igg，37℃溫箱孵育1h，pbs洗三次，5min/次，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。單抗實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中均能觀察到特異性的綠色熒光，熒光信號(hào)均位于細(xì)胞質(zhì)中，與ns1蛋白在細(xì)胞中的定位一致(圖5a)，而空白對(duì)照組則沒有可見綠色熒光(圖5b)。

實(shí)施例3單克隆抗體的westernblot鑒定

用原核表達(dá)的pet-28a-ns1蛋白進(jìn)行sds-page電泳。電泳后通過半干法將蛋白從page膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用2b8單克隆抗體與膜上的蛋白反應(yīng)1個(gè)小時(shí)后，用pbst(緩沖液)對(duì)膜進(jìn)行3次洗滌，然后加入體積比為1：5000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗并反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，再次洗滌三次后加入化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示本發(fā)明的單抗可與乙腦ns1蛋白產(chǎn)生良好的反應(yīng)，而對(duì)照組則無反應(yīng)(圖6)。

實(shí)施例4單克隆抗體所針對(duì)的保護(hù)性抗原表位的定位

為定位2b8單抗與ns1蛋白反應(yīng)的表位，將ns1基因分成9個(gè)不同的片段進(jìn)行表達(dá)(圖7)，通過westernblot方法對(duì)不同片段的蛋白與2b8單克隆抗體或者標(biāo)簽蛋白的抗體檢測(cè)，如果蛋白與抗his標(biāo)簽或抗gst標(biāo)簽的抗體反應(yīng)，說明蛋白成功表達(dá)；如果蛋白同時(shí)與2b8分泌的單抗反應(yīng)，則表明該單抗針對(duì)的保護(hù)性抗原表位位于該蛋白中。通過一系列的westernblot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2b8單克隆抗體與g片段不反應(yīng)，但與h片段可發(fā)生反應(yīng)(圖8)，g片段為205-224位氨基酸，h片段為215-234位氨基酸，說明了2b8針對(duì)的抗原表位為224-234之間的氨基酸片段，其具體序列為wpethtlwgd。

實(shí)施例5保護(hù)性抗原表位中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)鑒定

針對(duì)上述鑒定的表位，進(jìn)一步構(gòu)建了一系列單個(gè)氨基酸突變的ns1基因(表2)，通過原核表達(dá)的方法構(gòu)建并表達(dá)了這些突變基因，通過westernblot方法對(duì)突變蛋白的與雜交瘤細(xì)胞株2b8分泌的抗體的反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，所有突變蛋白均與his的抗體反應(yīng)，說明蛋白表達(dá)正確(見圖9a)，而t²²⁸、h²²⁹、l²³¹、w²³²等4個(gè)位點(diǎn)中，任何一個(gè)氨基酸突變后，2b8都會(huì)失去與蛋白的反應(yīng)原性，說明上述4個(gè)氨基酸為該抗原肽中的關(guān)鍵位點(diǎn)。

實(shí)施例6單克隆抗體在小白鼠內(nèi)對(duì)乙型腦炎病毒攻擊的保護(hù)用

用乙型腦炎病毒強(qiáng)毒攻擊小白鼠，將攻毒當(dāng)天記為第0天，在攻毒后第2天小鼠尾靜脈注射五種純化的單抗500μg/只，同時(shí)設(shè)pbs對(duì)照組。從攻毒第4天開始，pbs對(duì)照組小鼠逐漸有感染癥狀出現(xiàn)，表現(xiàn)為被毛直立，站立不穩(wěn)，四肢震顫，精神萎靡等癥狀，從第5天開始出現(xiàn)死亡，而且隨后幾天，死亡數(shù)目急劇增加，至第15天全部死亡。同時(shí)設(shè)置了幾種非保護(hù)性的單抗組，也在第5天開始出現(xiàn)死亡，而且死亡數(shù)目逐漸增加,死亡率80-100％。2b8單抗注射的小鼠可明顯抵抗病毒的攻擊，保護(hù)效率為80％(圖10)。

表2不同突變位點(diǎn)的設(shè)置

實(shí)施例7多肽對(duì)小白鼠的免疫保護(hù)性驗(yàn)證

人工合成本專利中鑒定的保護(hù)性多肽wpethtlwgd，并將其偶聯(lián)到klh，將該偶聯(lián)抗原用弗氏佐劑乳化后，免疫小白鼠，于首免后2周，加強(qiáng)免疫一次。二免后兩周，用jev進(jìn)行攻擊，觀察小白鼠的保護(hù)率。結(jié)果顯示：對(duì)照組在攻毒后第5天開始出現(xiàn)死亡，在短暫的幾天內(nèi)死亡數(shù)目急劇增加，在第7天時(shí)，小鼠全部死亡。在多肽疫苗免疫組實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)死亡小鼠在攻毒第4天就開始出現(xiàn)臨床癥狀(四肢震顫，站立不穩(wěn)，精神萎靡，身體蜷縮，眼睛微睜，背部被毛直立等)直至死亡；而存活的小鼠在攻毒后5天內(nèi)出現(xiàn)輕微精神萎靡后觀察不到明顯的臨床癥狀，多肽疫苗的保護(hù)效率可以達(dá)到33％，比相應(yīng)的表達(dá)蛋白高(圖11)?？紤]到該多肽小(10個(gè)氨基酸)和免疫原性低的特性，能夠獲得33％的免疫保護(hù)效率，也足以說明該表位是ns1中的一個(gè)保護(hù)性抗原表位，可作為疫苗設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。

實(shí)施例82b8單克隆抗體在病毒治療中的應(yīng)用

鑒于單克隆抗體已經(jīng)在人類及獸醫(yī)疾病的治療中取得了較大的成功，已經(jīng)發(fā)展稱為成熟的技術(shù)(bc,raposot,jains,huppt,argyledj.challengesandopportunitiesformonoclonalantibodytherapyinveterinaryoncology.vetj.2016dec；218:40-50)，可以預(yù)見本專利中獲得的2b8單克隆抗體可應(yīng)用于人及動(dòng)物乙型腦炎的治療。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種保護(hù)性乙型腦炎病毒ns1蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用

<130>

<141>2017-01-03

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