本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種豬α干擾素及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來豬病毒性傳染病日益泛濫，已嚴重地威脅著我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。免疫抑制病及病毒抗原快迅變異，常導致疫苗免疫失??；加之不斷出現(xiàn)新的病毒病，目前還尚無成功的疫苗接種預(yù)防。另一方面，疫苗對疾病只有預(yù)防作用，治療還有賴于抗生素的使用。而一些抗藥性菌株的出現(xiàn)，給人類食品和健康帶來極大的威脅，一些國家已明令禁止在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產(chǎn)中迫切需要一種既有效又有利于環(huán)保的新方法來防控畜禽疾病。實踐證明，干擾素作為一種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法：由中草藥等誘生劑誘導產(chǎn)生干擾素，因純化工藝復雜，產(chǎn)量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研的應(yīng)用。隨著豬干擾素基因的克隆成功，對其重組產(chǎn)物的臨床應(yīng)用及作用機理的研究也隨之展開。1990年，lefevre和labonnar等人在大腸桿菌中表達了poifn-αl基因，得到了一個含189個氨基酸的前體蛋白，去除其n端的含23個氨基酸的信號肽后，得到了具有完全天然poifn-αl生物學活性的產(chǎn)物，并且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激豬白細胞產(chǎn)生的干擾素的6倍。poljm等(1991)研究發(fā)現(xiàn)：rpoifn-α1能夠抑制偽狂犬病毒(prv)強毒和中等毒力病毒在豬鼻腔黏膜組織stroma細胞層的增殖，prv接種干擾素處理的豬成纖維細胞和豬腎細胞，病毒滴度明顯下降。horisbergerma(1992)比較了重組poifn-α(rpoifn-α)和重組poifn-γ(rpoifn-γ)在豬的細胞中抗病毒活性的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)rpoifn-α可大大降低豬水泡性口炎病毒(vsv)在豬pk-15上引起的病變，并能削弱豬水泡性口炎病毒(vsv)和流感病毒在豬腎細胞中的復制。jordanlt等(1994)發(fā)現(xiàn)rpoifn-α對傳染性胃腸炎病毒(tgev)有很好的預(yù)防作用。buddaertw(1998)對rpoifn-α在體內(nèi)、外對豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(prrsv)的抗病毒活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)prrsv在體內(nèi)、外對rpoifn-α都很敏感，rpoifn-α可明顯抑制prrsv的產(chǎn)量和感染細胞的數(shù)量。chinsangaramj.等(2001)人用大腸桿菌表達rpoifn-α或rpolfn-α并分別進行了抗口蹄疫病毒(fmdv)實驗，發(fā)現(xiàn)rpoifn-α和rpoifn-α抑制fmdv復制是在蛋白質(zhì)翻譯水平上的，主要是激活雙鏈rna依賴性蛋白激酶(pkr)作用的結(jié)果：在細胞中加入pkr抑制劑2-氨基嘌呤后，病毒的產(chǎn)量就會上升；而rnasel和pkr基因缺失的細胞在干擾素的作用下仍能感染fmdv，這充分說明了pkr在抑制病毒復制中起作用。

我國學者也對豬α干擾素進行了多項研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一種新的豬ifn-α基因并在大腸桿菌中進行了其成熟蛋白的單純表達，表達產(chǎn)物具有較高的抗病毒活性。杜以軍等利用豬ifn-α的成熟蛋白基因構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pad-poifn-α轉(zhuǎn)染hek-293a細胞，滴度為10⁷tcid50/ml。rt-pcr證明目的基因在mrna水平上可有效表達；在pk-15細胞上可以檢測到較強的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技術(shù)奠定了重要基礎(chǔ)。謝海燕等(2004)克隆了豬ifn-α基因，構(gòu)建了原核表達載體，初步對其進行了原核表達研究；我國學者夏春等(2005)報道了用pqe30表達載體在大腸桿菌原核表達的rpoifn-α在豬源細胞和非豬源細胞系上可顯著抑制csfv、prrsv和vsv的增殖，證明了原核表達poifn-α的可行性及將基因工程原核表達的poifn-α真正用于生產(chǎn)實踐中作為抗病毒制劑可行性。曹瑞兵等對豬ifn-α1基因進行了改造，在保留編碼蛋白序列的同時，使用了大腸埃希菌的偏愛密碼子，將合成的豬ifn-α1成熟蛋白編碼基因插入原核單純表達載體prlc中，實現(xiàn)了豬ifn-α1在大腸埃希菌中的高效表達，且重組豬ifn-α1具有較高的抗病毒活性，約為6.4×10⁶u/mg。

在豬α干擾素基因研究方面，2000年夏春等首次對豬干擾素α基因進行分子克隆與測序，克隆片段長668個核苷酸，編碼186個氨基酸。其中，76～636位含有1個orf，蛋白分子量為21.8ku。除此之外，溫納相(2005)和彭貴青(2005)也對豬干擾素α的基因進行了分子克隆與測序，并檢測其生物活性。

在表達方面，曹瑞兵(2004)和吳陽(2006)分別對豬α干擾素的基因進行了原核表達，表達量分別為17.3％和18％，表達產(chǎn)物均為融合蛋白。其中曹瑞兵用重組豬α干擾素處理豬腎傳代細胞pk-15后，細胞病變抑制法(cpe50)測定結(jié)果表明，重組豬α干擾素可顯著抑制豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)的感染。但以上技術(shù)均具有原基因密碼子的表達量低、抗病毒活性低的缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的一種抗病毒活性高的豬α干擾素。

本發(fā)明的豬α干擾素含有如seqidno.1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，經(jīng)過密碼子改造，獲得了編碼豬α干擾素的基因，含有如seqidno.2所示的核苷酸序列。

含有上述基因的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供一種含有所述豬α干擾素的藥物。

具體地，該藥物為抗病毒、抗腫瘤或增強免疫功能的藥物。

本發(fā)明提供了氨基酸序列如seqidno.1所示的豬α干擾素在制備豬保健品或藥物中的應(yīng)用。

進一步地，本發(fā)明提供一種制備所述豬α干擾素的方法，包括以下步驟：

(1)合成seqidno.2所示的核苷酸序列，將目的基因克隆入puc57，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，取轉(zhuǎn)化后的克隆菌進行目的基因pcr驗證，同時進行雙酶切鑒定；

(2)鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進行雙酶切后，與表達載體相連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，涂布于含氨芐霉素的lb培養(yǎng)基平板進行過夜培養(yǎng)，取前述平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆質(zhì)粒雙酶切，鑒定為陽性者表示表達載體構(gòu)建成功；

(3)構(gòu)建完成的重組表達菌于含氨芐霉素的lb培養(yǎng)基中進行擴增，放大培養(yǎng)，至細菌達到對數(shù)生長期，測細菌在600nmod值在0.6～0.8時，加入iptg，過夜誘導表達，收集細菌，鑒定重組蛋白；

(4)用超聲破碎菌體后，得到包涵體，經(jīng)過包涵體洗滌，變性，復性，再經(jīng)親和層析純化蛋白。

其中，步驟(4)中超聲破碎菌體后，得到包涵體的方法為：收集細菌，3000-8000rpm/min離心20-40min，棄上清，留沉淀，加入10-20倍體積超聲緩沖液重懸菌體，超聲裂解得到包涵體；所述超聲緩沖液的配方為：50mmtris，50mmnacl，0.5mmedta，ph8.0；所述超聲裂解條件為：功率：350-400w，工作3秒，間隔5秒，超聲5-10min，重復3-4次。

其中，步驟(4)中變性是使用變性液處理包涵體，使蛋白變性后溶解于變性液中；所述變性液配方為50mmtris-hcl，8murea，20mmdtt，ph10-12。優(yōu)選地，變性液的ph為10-10.5。

現(xiàn)有技術(shù)中，常采用的變性液ph為8.3-8.5，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將ph值調(diào)為ph10-12時，蛋白變性更徹底，特別是ph在10-10.5能夠達到最佳的變性效果。

與傳統(tǒng)表達干擾素的方法相比，本發(fā)明通過研究制備豬α干擾素，采用一步親和層析法，降低成本，提高了回收率，獲得的豬α干擾素效價較高，在pk15-vsv體系中活性達10⁸，質(zhì)量穩(wěn)定，經(jīng)鱟試劑檢測本發(fā)明獲得的終產(chǎn)品內(nèi)毒素含量遠低于藥典要求，極大的提高藥物使用的安全性，因此為產(chǎn)品轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了先決條件，具有很好的市場潛力和較強的市場競爭力，更易在規(guī)?；i場中廣泛推廣應(yīng)用?；蛑亟M的豬α干擾素具有很好的抗病毒作用，可以單獨使用治療多種豬病毒性疾??；在市場上具有良好的應(yīng)用前景。在預(yù)防和治療豬病毒性疾病方面具有潛在的應(yīng)用價值。本發(fā)明通過精心設(shè)計，對豬α干擾素進行了基因修飾和改造，經(jīng)顯示系統(tǒng)表明，密碼子改造后所分泌蛋白豬α干擾素具有更好的抗病毒活性。

附圖說明

圖1是重組豬α干擾素蛋白表達sds-page電泳圖，m為maker，泳道1為誘導表達前；泳道2為誘導表達后1h。

圖2是重組豬α干擾素蛋白表達sds-page電泳圖，m為maker，泳道1～4是分別挑選的4個克隆進行小試誘導表達。

圖3是重組豬α干擾素蛋白可溶性鑒定圖，m為maker；泳道1全菌；泳道2菌體破碎后的上清；泳道3菌體破碎后的沉淀，電泳結(jié)果顯示目的蛋白為包涵體形式表達。

圖4是包涵體變性裂解ph優(yōu)化結(jié)果sds-page電泳圖，m為maker；泳道1和4分別為變性液ph8.43時的上清和沉淀；泳道2和5分別為變性液ph9.2時的上清和沉淀；泳道3和6分別為變性液ph10.3時的上清和沉淀。

圖5是目的蛋白純化效果sds-page電泳圖，m為maker；泳道1為待純化樣品；泳道2為純化過程中的流穿液；泳道3為純化后的目的蛋白。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1基因改造與豬干擾素α蛋白的表達

1、應(yīng)用基因分析軟件，參照ncbigenbank上登載的豬干擾素α基因成熟肽核苷酸序列g(shù)enbank:afk92985.1，根據(jù)大腸桿菌表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設(shè)計新序列，其核苷酸序列如seqidno.2所示，送生物公司合成該序列。

全基因合成目的基因后，將目的基因克隆于puc57，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。取轉(zhuǎn)化后的克隆菌進行目的基因pcr驗證，同時進行雙酶切鑒定。根據(jù)實驗結(jié)果，將pcr和雙酶切均為陽性質(zhì)粒進行目的基因測序。測序結(jié)果顯示其核苷酸序列如seqidno.2所示。

2、構(gòu)建表達載體鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進行雙酶切后，與表達載體pet23b相連接，并進行轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)plyss，涂布于含氨芐霉素的lb培養(yǎng)基平板進行過夜培養(yǎng)，取前述平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆質(zhì)粒雙酶切，鑒定為陽性者表示表達載體構(gòu)建成功。

3、重組蛋白的表達分別挑取構(gòu)建完成的重組表達菌于含氨芐霉素的100ug/ml的lb培養(yǎng)基中進行少量擴增，后分別在含氨芐霉素的100ug/ml的lb培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，至細菌達到對數(shù)生長期，測細菌在600nmod值在0.6～0.8時，加入異丙基硫代半乳糖苷iptg，37度進行過夜誘導表達，收集細菌。

4、鑒定重組蛋白經(jīng)過sds-page檢測和westernblot實驗，證明蛋白無誤。

5、純化重組蛋白，得到粗制品ifn

目的基因的重組質(zhì)粒pet23b轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)plyss，經(jīng)iptg誘導后，大腸桿菌pet23b/ifn菌體蛋白經(jīng)sds-page蛋白電泳及考馬斯亮藍染色顯示，與空菌相比，在20kd左右有一條濃染的新增蛋白條帶；經(jīng)westernblotting鑒定，此菌體蛋白為目的蛋白。結(jié)果見圖1、圖2。

5.1純化重組蛋白是指用超聲破碎重組蛋白后，得到包涵體，經(jīng)過包涵體洗滌，變性，復性，再經(jīng)親和層析純化蛋白。見圖3。純化重組蛋白得到粗制品ifn的具體步驟為：收集菌體，4℃，5000rpm/min離心30min，棄上清，留沉淀即為所得發(fā)酵菌體，10倍體積超聲緩沖液(50mmtris，50mmnacl，0.5mmedta，ph8.0)將菌體重懸，超聲裂解得到包涵體。功率：350-400w，工作3秒，間隔5秒，超聲5-10min，重復3-4次，可取少量超聲后液體涂板，檢測超聲裂解情況，12000rpm/min，4℃離心30min。

5.2包涵體洗滌：離心后的沉淀，加入洗滌液充分懸浮后離心棄去上清。用三種洗滌液依次洗滌，每次保證將離心后的包涵體充分懸浮，磁力攪拌30min后，12000rpm，4℃，20min進行離心。

洗滌1：50mmtris-hcl，0.5％tritonx-100，0.5mnacl，ph8.0

洗滌2：50mmtris-hcl，2murea，1％巰基乙醇，2mmedta，0.15mnacl，ph8.0

洗滌3：50mmtris-hcl，4murea，0.5mnacl，ph8.0

5.3包涵體裂解使用含8muera的變性液處理包涵體，使蛋白變性后溶解于變性液中。變性液：50mmtris-hcl，8murea，20mmdtt，ph10.3，另選ph為8.43和9.2的變性液做對比。菌泥量：變性液＝1：10(w：v)變性室溫磁力攪拌4～6h即可，也可4℃過夜。12000rpm，4℃，20min離心，收集變性液上清，4℃保存。結(jié)果見圖4。

5.4豬α干擾素復性：采用稀釋性法，將變性液按1:20體積比稀釋到復性液中，磁力攪拌5min后，轉(zhuǎn)到4℃靜置24h復性。

復性液配方：50mmtris-hcl，0.15mnacl，0.4ml-arg，1mmgssg，5mmgsh，10％甘油，ph8.0，過夜透析后的復性液，過親和柱，進行ifn純化。

6、親和層析層析過程中，緩沖液中添加300mm氯化鈉，降低非特異性蛋白吸附，增加洗脫前的洗滌過程，先使用低濃度的咪唑洗去結(jié)合在鎳柱上的蛋白，洗脫液中500mm咪唑濃度，洗脫并收集ifn峰。

平衡液：10mmpb，0.3mnacl，20mm咪唑，ph8.0

洗脫液：10mmpb，0.3mnacl，500mm咪唑，ph8.0

親和層析收集的蛋白，經(jīng)g25脫鹽層析柱，將蛋白換液到pbs(ph8.5)緩沖液中。純化效果見圖5。

akta蛋白純化儀親和層析精純蛋白，測定ifn效價和比活性。無菌分裝，-70℃保存。純化后重組豬αifn效價及比活性測定：細胞病變抑制法，純化后的豬αifn在pk-15細胞上能夠抑制100tcid50的vsv病毒增殖。依據(jù)種屬特異性特性選用pk15-vsv體系，活性高達10⁸。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

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<110>華南農(nóng)業(yè)大學,北京利昂盛生物技術(shù)有限公司

<120>一種豬α干擾素及其應(yīng)用

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