本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域；更具體地,本發(fā)明涉及一個(gè)特異性和廣譜抗丙型肝炎病毒的全人單克隆中和抗體。本專利提供了關(guān)于人源抗hcve2單克隆抗體的組成和方法。本專利發(fā)明的抗體結(jié)合hcve2蛋白的保守區(qū)，并且中和多種hcv基因型。本專利發(fā)明包括單獨(dú)抗體和衍生物及片段，包括人源抗hcv單克隆抗體的制藥配方，和生產(chǎn)該單克隆抗體的細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
：丙型病毒性肝炎(丙肝)由丙型肝炎病毒(hcv)引起，一般通過血液和體液傳播，是導(dǎo)致各種肝臟疾病的重要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織who統(tǒng)計(jì)，目前全球約有1.5億人患有慢性丙肝，并面臨因肝功能喪失或者肝癌導(dǎo)致死亡的風(fēng)險(xiǎn)。每年有300-400萬人新增感染丙肝病毒，并有35萬余人死于與丙肝相關(guān)的肝臟疾病。2009國(guó)際肝病峰會(huì)數(shù)據(jù)表明，中國(guó)作為丙肝流行地區(qū)，目前約有4000萬患者。急性hcv感染者轉(zhuǎn)變?yōu)槁员位颊叩母怕矢哌_(dá)80％，呈現(xiàn)出明顯的慢性化趨勢(shì)。丙型肝炎病毒(hcv)引起的終末期肝臟疾病是肝移植的主要指標(biāo)。然而，hcv的再感染普遍發(fā)生，且易導(dǎo)致同種異體移植的衰竭，這種衰竭是導(dǎo)致hcv病人肝臟再移植或死亡最常見的原因。超過三分之一的肝移植受者發(fā)展成肝硬化，并且在術(shù)后五年需要再移植。肝移植受者接受的(聚乙二醇)干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療有較差的耐受性和療效，治療患者中只有大約30％發(fā)生了持續(xù)病病毒清除。中國(guó)十年間hcv的發(fā)病人數(shù)增長(zhǎng)了9倍。全世界都迫切需要對(duì)于丙型病毒性肝炎的安全、有效、價(jià)格低廉的預(yù)防治療方法。丙型肝炎病毒(hcv)屬于黃病毒科(flaviviridae)肝炎病毒屬。hcv病毒體呈球形，直徑約60nm(在肝細(xì)胞中為36-40nm，在血液中為36-62nm)，內(nèi)部為單鏈正義rna，在核衣殼外包裹有含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。hcv基因組的單股正鏈rna全長(zhǎng)約9.6kb，包含5’-端和3’-端非編碼區(qū)(non-translatedregion，utr)及一個(gè)開放閱讀框(openreadingframe，orf)，編碼一個(gè)3000多個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，可翻譯剪切為11種病毒蛋白。其中hcvrna的n-端編碼core(f)、e1、e2和p7五個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，c-端編碼ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b六個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，核心蛋白是病毒核衣殼的最基本組成部分，e1/e2是病毒表面高度糖基化的包膜蛋白，p7是介導(dǎo)病毒顆粒組裝和釋放的離子通道蛋白，ns2、ns4b、ns5a、ns5b參與病毒的復(fù)制過程，ns3-4a參與病毒多聚蛋白前體的剪切工作。目前尚無疫苗可以有效防止hcv感染，針對(duì)慢性丙肝的標(biāo)準(zhǔn)療法是聚乙二醇干擾素- α與利巴韋林的聯(lián)合治療，但基于所感染病毒基因型和其他因素，只有50-80％的患者可以產(chǎn)生持續(xù)病毒性應(yīng)答，其他患者則無法用此療法控制病情的發(fā)展。2011年5月，fda批準(zhǔn)通過了兩種丙型肝炎新藥victrelis(伯賽匹韋,-1-boceprevir)和incivek(telaprevir,特拉匹韋)。這兩種藥物都屬于一類所謂的蛋白酶抑制劑，該抑制劑能夠阻止丙型肝炎病毒復(fù)制。這兩種藥物的治療均可以有效降低患者h(yuǎn)cvrna載量，但同時(shí)也面臨著耐藥性、副作用、價(jià)格昂貴等問題，制約了其在臨床上的大規(guī)模使用。迫使人們尋求新的預(yù)防和治療丙型病毒性肝炎的新方法—抗體藥物。hcv的治療需求可以與乙肝(hbv)患者進(jìn)行肝移植時(shí)治療需要相類比。核苷酸和核苷類似物對(duì)抑制hbv有良好的耐受性和較好的療效，但必須同時(shí)使用乙肝免疫球蛋白(hbvigg)用于預(yù)防肝移植后hbv的感染，是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。hbvigg的使用讓乙肝患者從不適宜移植變成肝移植的理想候選人。因此，即使開發(fā)更有效和耐受性良好的口服抗丙型肝炎藥物，一個(gè)有效的抗丙型肝炎抗體仍然是預(yù)防肝移植后hcv感染的重要基礎(chǔ)?？贵w藥物用于病毒感染性疾病的治療早有報(bào)道，抗血清用于治療sars和重癥h5n1丙型肝炎病毒感染者的案例已經(jīng)證明了抗體在治療病毒感染中發(fā)揮的重要作用。具有中和活性的抗丙型肝炎病毒的全人單克隆抗體具有以下潛在優(yōu)勢(shì)：一方面它可以阻斷病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合；另一方面通過補(bǔ)體和t細(xì)胞、nk細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的作用，將被病毒感染的細(xì)胞殺死。1986年，第一株治療器官移植出現(xiàn)的排斥反應(yīng)的鼠單抗——莫羅單抗-cd3(murmonabcd3，hocloneokt3)獲得美國(guó)fda批準(zhǔn)上市，但由于其在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體(hama)反應(yīng)，限制了應(yīng)用。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程抗體迅速發(fā)展，嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體生產(chǎn)技術(shù)不斷發(fā)展，將hama反應(yīng)降至最低乃至消除。2009年，美國(guó)fda批準(zhǔn)的14個(gè)藥物中有4個(gè)為全人抗體，這標(biāo)志著全人單克隆抗體時(shí)代的來臨，全人抗體成為抗體藥物未來的發(fā)展方向。丙型肝炎病毒包膜蛋白中的e2蛋白，在病毒入侵細(xì)胞過程中扮演非常重要的角色，是主要的細(xì)胞表面受體結(jié)合區(qū)域，也是免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。e2蛋白的n-端包含兩個(gè)高可變區(qū)(hvr)，分別是hvr1和hvr2，這兩個(gè)區(qū)域處于蛋白表面，研究表明丙肝的慢性感染和病毒逃逸與這兩個(gè)區(qū)域密切相關(guān)。目前，得到廣泛認(rèn)可的廣譜中和性抗原表位是ar3表位，其包含三個(gè)不連續(xù)氨基酸區(qū)段(396-424，436-447和523-540位氨基酸)。綜上，針對(duì)丙型肝炎病毒e2蛋白而開發(fā)的全人單克隆抗體，未來在hcv的預(yù)防及治療中必將產(chǎn)生重要的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供抗丙型肝炎病毒的全人單克隆中和抗體。本專利提供了關(guān)于人類抗丙型肝炎病毒e2單克隆抗體的組成和方法。該專利發(fā)明的抗體結(jié)合在hcve2蛋白 的保守和必要區(qū)域，中和丙肝病毒，并且包含了多個(gè)丙型肝炎病毒基因型。該發(fā)明的具體體現(xiàn)包括了單獨(dú)的抗體及其衍生品和片段，由一個(gè)或多個(gè)人類抗丙型肝炎病毒單克隆抗體組成的藥物制劑；以及生產(chǎn)這些單克隆抗體的細(xì)胞株。并且提供的cdr氨基酸序列，這些序列賦予這些單克隆抗體的結(jié)合特異性。這些序列以及與本專利發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的同源抗原表位，可以用來識(shí)別其他特定的結(jié)合并中和hcv的抗體；預(yù)防與hcv病毒相關(guān)的疾病的免疫治療方法，包括但不限于中和與肝移植相關(guān)的病毒。熱門的療法包括抗hcv療法的聯(lián)合療法，例如特定結(jié)合一個(gè)不同抗原表位的單克隆抗體，而非本專利發(fā)明的抗體，小分子抗病毒藥物，干擾素等?？乖某煞忠呀?jīng)提供，包括全部或部分的hcve2蛋白，該蛋白中特定高度免疫原性的氨基酸分子片段，對(duì)抗體的抗病毒功能至關(guān)重要，因此不容易產(chǎn)生病毒逃逸突變體和選擇性改變。這樣的多肽通常是連續(xù)e2序列上至少約50個(gè)氨基酸，至少約100個(gè)氨基酸，至少約200個(gè)氨基酸，或者多達(dá)完整的e2蛋白。這些抗原在篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用途，可以作為丙肝疫苗成分刺激產(chǎn)生抗丙肝抗體。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含seqidno:8所示重鏈cdr1、seqidno:9所示重鏈cdr2和seqidno:10所示重鏈cdr3。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含seqidno:14所示輕鏈cdr1、seqidno:15所示輕鏈cdr2和seqidno:16所示輕鏈cdr3。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含以下的氨基酸序列：seqidno:8所示的重鏈cdr1，seqidno:9所示的重鏈cdr2和seqidno:10所示的重鏈cdr3，seqidno:14所示的輕鏈cdr1，seqidno:15所示的輕鏈cdr2和seqidno:16所示的輕鏈cdr3。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)具有seqidno:2所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū),所述的輕鏈可變區(qū)具有seqidno:4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子是完整的免疫球蛋白，或者是單克隆抗體或嵌合抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子是fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互補(bǔ)決定 區(qū)(cdr)片段、單鏈抗體(scfv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體；優(yōu)選的，所述的結(jié)合分子是人單克隆抗體。更優(yōu)選地，所述的結(jié)合分子還包含人源的恒定區(qū)igh序列和igkappa序列。更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)選擇下組中重鏈類型之一的恒定區(qū)：iggl、igg2a、igg2b、igg3和igg4，和其輕鏈恒定區(qū)選擇下組輕鏈類型的恒定區(qū)之一：κ鏈和λ鏈；更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)分別具有g(shù)enebank號(hào)ack87036和ack87038所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，前面任一所述的結(jié)合分子能識(shí)別并結(jié)合丙型肝炎病毒的包膜蛋白(e2蛋白)中的表位。在發(fā)明的另一方面，提供編碼所述的結(jié)合分子的核酸分子。在發(fā)明的另一方面，提供前面任一所述的結(jié)合分子在制備用于檢測(cè)、治療和/或預(yù)防丙型肝炎病毒感染的藥物中的用途。在發(fā)明另一方面，提供一種表達(dá)載體,所述表達(dá)載體中含有編碼前面任一所述的結(jié)合分子的dna。在本發(fā)明另一方面，提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞中含有所述的表達(dá)載體。在發(fā)明另一方面，提供一種組合物,它含有前面任一所述的結(jié)合分子，以及藥學(xué)上可接受的載體。在發(fā)明另一方面，提供一種檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑盒，其包括前面任一所述的結(jié)合分子。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括：抗原或抗體包被用試劑，洗滌試劑，第二抗體，標(biāo)記物(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-d-半10乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶)，顯色劑酶底物等。在發(fā)明一方面，提供一種抑制丙型肝炎病毒的方法(較佳地為非治療方法)，利用前 面任一所述的結(jié)合分子來抑制丙型肝炎病毒。在發(fā)明另一方面，提供一種檢測(cè)丙型肝炎病毒的方法(優(yōu)選非診斷方法)，利用前面任一所述的結(jié)合分子與待測(cè)樣品進(jìn)行接觸，通過檢測(cè)所述的結(jié)合分子與受試樣品的結(jié)合情況，獲得丙型肝炎病毒的存在情況以及存在量。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的丙型肝炎病毒是1a亞型、1b亞型、2a亞型病毒、2b亞型、3a亞型、4a亞型、5a亞型、6a亞型或7a亞型。在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的丙型肝炎病毒1a亞型包括：h77毒株；或所述的丙型肝炎病毒1b亞型包括：pr52b6m毒株、pr79毒株、pr26c3m20毒株、con1毒株、hcr6毒株、pr52毒株、pr26毒株、pr79毒株；或所述的丙型肝炎病毒2a亞型包括：d183毒株、jfh1毒株、pr63毒株；或所述的丙型肝炎病毒2b亞型包括：j8毒株；或所述的丙型肝炎病毒3a亞型包括：patient288毒株、s52毒株；或所述的丙型肝炎病毒4a亞型包括：ed43毒株；或所述的丙型肝炎病毒5a亞型包括：sa13毒株；或所述的丙型肝炎病毒6a亞型包括：hk6a毒株、74毒株；或所述的丙型肝炎病毒7a亞型包括：qc69毒株。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明通過參照對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案的圖示說明可以更好地理解本發(fā)明，在附圖中：圖1、facs流式細(xì)胞儀分選特異性b細(xì)胞的分選圖。圖2、β-actin內(nèi)參的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖3、重鏈基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖4、輕鏈基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖5、若干種全人單克隆抗體(包括8d6)抗原抗體特異性檢測(cè)。圖6、全人單克隆抗體(8d6)對(duì)于hcv真病毒(1b亞型pr26c3m、pr52b6m、pr79三個(gè)毒株；2a亞型pr79、jfh1毒株)的中和活性檢測(cè)。圖7、抗hcve2的中和性全人單抗1f2對(duì)于hcv真病毒的中和活性檢測(cè)。圖8、elisa驗(yàn)證8d6與不同基因型的hcv毒株的表面糖蛋白e2的結(jié)合活性。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，獲得一種含有獨(dú)特的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr區(qū))的抗丙型肝炎病毒廣譜中和抗體，優(yōu)選全人單克隆抗體(8d6)，該結(jié)合分子對(duì)于丙型肝炎病 毒具有顯著的中和作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。結(jié)合分子本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是人結(jié)合分子。本發(fā)明的結(jié)合分子呈現(xiàn)對(duì)于丙型肝炎病毒的中和活性。本發(fā)明的結(jié)合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述結(jié)合分子可以是單克隆抗體或嵌合抗體，所述結(jié)合分子也可以是抗原結(jié)合片段，包括但不限于fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)片段、單鏈抗體(scfv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及至少含有足以賦予與丙型肝炎病毒毒株的特異性抗原結(jié)合的(多)肽或其片段。本發(fā)明的結(jié)合分子也可以特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的一或多個(gè)片段。對(duì)于治療和/或預(yù)防丙型肝炎病毒的方法而言，所述結(jié)合分子優(yōu)選能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的表面可及蛋白質(zhì)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合丙型肝炎病毒的e2分子。本發(fā)明還提供了所述的結(jié)合分子在制備診斷、預(yù)防和/或治療丙型肝炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了可以中和導(dǎo)致丙型肝炎的丙型肝炎病毒感染的結(jié)合分子。cdr區(qū)是免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，結(jié)合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個(gè)cdr區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明結(jié)合分子包含本文揭示的至少兩個(gè)cdr。本發(fā)明的另一方面包括本文所述結(jié)合分子的功能變體。如果變體能與親代結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合丙型肝炎病毒或其蛋白片段，則認(rèn)為該變體分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。換句話說，所述功能變體仍能結(jié)合丙型肝炎病毒e2蛋白或其片段。功能變體包括但不限于一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本相似、但是含有例如在親代結(jié)合分子中發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾的衍生物。這種修飾包括乙酰化、?；⒑塑账峄蛘吆塑账嵫苌锏墓矁r(jià)附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說，親代結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的所述結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識(shí)別并結(jié)合其靶位。所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如定向誘變和隨機(jī)pcr介導(dǎo)的誘變，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘 基置換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族己經(jīng)在本領(lǐng)域中限定。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換。相似的小變異也可包括氨基酸缺失或者插入，或者這二者。使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序可以發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。此外，功能變體可包含氨基酸氨基或者羧基端或者這兩端的截短體。本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結(jié)合親和性，但是仍能結(jié)合丙型肝炎病毒或其片段。優(yōu)選地，可變區(qū)包括但不限于構(gòu)架區(qū)、高變區(qū)或cdr區(qū)的氨基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)，包括三個(gè)cdr，以及更保守的區(qū)域，即所謂的構(gòu)架區(qū)(fr)。高變區(qū)包含來自cdr的氨基酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所述親代結(jié)合分子具有至少大約50％至大約99％、優(yōu)選至少大約60％至大約99％、更優(yōu)選至少大約70％至大約99％、甚至更優(yōu)選至少大約80％至大約99％、最優(yōu)選至少大約90％至大約99％、特別是至少大約95％至大約99％，以及特別是至少大約97％至大約99％的氨基酸序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法如gap或者bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以進(jìn)行對(duì)比以及明確相似或相同的氨基酸殘基。功能變體可以通過使用本領(lǐng)域己知的普通分子生物學(xué)方法改變親代結(jié)合分子或其一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯(cuò)pcr、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、定點(diǎn)誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的功能變體對(duì)于丙型肝炎病毒具有中和活性。所述中和活性與親代結(jié)合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，當(dāng)使用術(shù)語(人)結(jié)合分子時(shí)，其也涵蓋所述(人)結(jié)合分子的功能變體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的結(jié)合分子是單克隆抗體，優(yōu)選它包括人源的恒定區(qū)(如人源恒定區(qū)igh序列和igkappa序列)。所述的抗丙型肝炎病毒單克隆20抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)均具有獨(dú)特的不同于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)，且它們是全人源的。本發(fā)明包括：具有所述單克隆抗體的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體，具有所述單克隆抗體可變區(qū)鏈的單克隆抗體。本發(fā)明還包括具有含所述的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的輕鏈和重鏈的任何抗體，以及cdr區(qū)與本發(fā)明的單克隆抗體的cdr具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性的任何抗體?？贵w的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來描述，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion，cdr)，所述的cdr區(qū)將可變區(qū)間隔成4 個(gè)框架區(qū)域(fr)，4個(gè)fr的氨基酸序列相對(duì)比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些cdr形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的fr形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的cdr和相應(yīng)輕鏈上的cdr構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了fr或cdr區(qū)域。對(duì)于本發(fā)明的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)發(fā)明的抗丙型肝炎病毒單克隆抗體的cdr區(qū)是全新的，其針對(duì)的是一個(gè)獨(dú)特的丙型肝炎病毒e2蛋白上的抗原表位，技術(shù)構(gòu)思不同于現(xiàn)有的抗丙型肝炎病毒抗體。本發(fā)明的單克隆抗體是全人源的，其重鏈、輕鏈可變區(qū)以及恒定區(qū)均來源于人抗體。因此，其在具有特別優(yōu)異的識(shí)別和中和丙型肝炎病毒的作用的同時(shí)，還具有免疫原性低、安全性高的特點(diǎn)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，從近年感染丙型肝炎病毒的志愿者體內(nèi)獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，使用cd19+/igg+/hcv-e2為特異性標(biāo)志物，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選(facs)獲得識(shí)別丙型肝炎病毒e2蛋白的特異性b細(xì)胞。使用文獻(xiàn)已報(bào)道的單細(xì)胞rt-pcr技術(shù)(journalofimmunologicalmethods329(2008)112–124)，獲得了抗體基因，并在293t細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)獲得全人單克隆抗體8d6。真病毒(hcvcc)中和試驗(yàn)表明，8d6抗體在較低濃度下(0.4μg/ml以下)對(duì)于一些hcv真病毒具有超過90％的抑制率。由此可見，8d6抗體具有較強(qiáng)的親和力和中和活性，具有臨床上預(yù)防和治療丙型肝炎病毒感染的可能。另一方面，本發(fā)明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個(gè)結(jié)合分子以及進(jìn)一步包含至少一個(gè)標(biāo)記如可檢測(cè)的部分/物質(zhì)的分子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明免疫綴合物的混合物或者至少一種本發(fā)明免疫綴合物與另一分子的混合物，所述另一分子如治療劑或者另一結(jié)合分子或免疫綴合物。本發(fā)明的免疫綴合物可包含一個(gè)以上的標(biāo)記。這些標(biāo)記可以彼此相同或不同，并且可以與結(jié)合分子非共價(jià)地結(jié)合/綴合。所述標(biāo)記也可以通過共價(jià)鍵與人結(jié)合分子直接結(jié)合/綴合。或者，所述標(biāo)記可以通過一或多種連接化合物與所述結(jié)合分子結(jié)合/綴合。標(biāo)記與結(jié)合分子的綴合技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的免疫綴合物的標(biāo)記可以是治療劑，但是它們也可以是可檢測(cè)的部分/物質(zhì)。適于治療和/或預(yù)防的標(biāo)記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強(qiáng)吞噬作用或者免疫刺激作用的其它結(jié)合分子。包含可檢測(cè)物質(zhì)的免疫綴合物可診斷性地用于例如評(píng)定對(duì)象是否己經(jīng)感染丙型肝炎病毒毒株或者作為臨床實(shí)驗(yàn)程序的一部分監(jiān)測(cè)丙型肝炎病毒感染的發(fā)生或進(jìn)展以例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可以用于其它檢測(cè)和/或分析和/或診斷目的。可檢測(cè)的部分/物質(zhì)包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料，生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測(cè)和 /或分析和/或診斷目的用于標(biāo)記結(jié)合分子的標(biāo)記依賴于使用的特定檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法例如免疫組織化學(xué)染色(組織)樣品、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)、熒光免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、放射免疫測(cè)定(ria)、生物測(cè)定(例如吞噬作用測(cè)定)、蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用等。對(duì)于本領(lǐng)域已知的檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。此外，本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物也可以附著于固體支持物上，特別用于丙型肝炎病毒e2蛋白或其片段的體外免疫測(cè)定或者純化。這種固體支持物可以是多孔或者無孔的、平面或非平面的。本發(fā)明的結(jié)合分子可以與標(biāo)記序列融合以便于純化。所述標(biāo)記序列的例子包括但不限于六組氨酸標(biāo)記、myc標(biāo)記或者flag標(biāo)記。或者，一種抗體可以與另一種抗體綴合形成抗體異源綴合物(hetero-conjugate)。另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子可以與一或多個(gè)抗原綴合/附著。優(yōu)選地，這些抗原是由給予了結(jié)合分子-抗原綴合物的對(duì)象的免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附著抗原和結(jié)合分子的綴合方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于使用交聯(lián)劑。本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合丙型肝炎病毒并且附著于結(jié)合分子的抗原將引發(fā)對(duì)于所述綴合物的有力t細(xì)胞攻擊，最終導(dǎo)致丙型肝炎病毒的破壞。除了通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學(xué)產(chǎn)生免疫綴合物之外，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產(chǎn)生，所述融合蛋白包含本發(fā)明的結(jié)合分子及合適的標(biāo)記。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，例如通過構(gòu)建核酸分子以及隨后表達(dá)所述核酸分子而重組產(chǎn)生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結(jié)合分子的核苷酸序列以及編碼合適標(biāo)記的核苷酸序列。本發(fā)明另一方面提供了編碼本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進(jìn)行克隆，例如用于如上述的親和力成熟方法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。dna分子的序列可以用常規(guī)技術(shù)，或利用雜交瘤技術(shù)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是這樣的核酸序列，通過使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明的結(jié)合分子(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的結(jié)合分子的序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)dna序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，本發(fā)明的載體是例如含病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體，且在所述表達(dá)載體中分別插入了抗丙型肝炎病毒單克隆抗體重鏈可變區(qū)(vh)與恒定區(qū)的igh(來自人源igh的恒定區(qū))融合序列和輕鏈可變區(qū)vl與人體igkappa(來自人源igkappa的恒定區(qū))融合序列。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅s2或sf9；動(dòng)物細(xì)胞如cho、cos7、nso或bowes黑素瘤細(xì)胞等。特別適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如293細(xì)胞。用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，或常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法誘導(dǎo)(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選的是采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常需要在含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無血清的適應(yīng)過程后，方可讓細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中正常的生長(zhǎng)。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合分子也可以在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物如兔、山羊或者牛中產(chǎn)生，并且分泌進(jìn)例如其乳中。藥物組合物本發(fā)明的結(jié)合分子可用于制備抑制丙型肝炎病毒的組合物?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種可抑制丙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染疾病的組合物，其包含：有效量的本發(fā)明所述的結(jié)合分子；以及藥學(xué)上可接受的載體。本文用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的結(jié)合分子相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低組合物的效果?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉；麥芽；明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如tween；潤(rùn)濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。給藥方式例如可以采用注射或其它治療方式。本發(fā)明的結(jié)合分子可以以分離的或者分離的形式使用。此外，發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨(dú)應(yīng)用或者于包含至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子(或其變體或片段)的混合物中應(yīng)用。換句話說，所述結(jié)合分子可以組合應(yīng)用，例如作為包含兩或更多種本發(fā)明的結(jié)合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補(bǔ)活性的結(jié)合分子可以組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結(jié)合分子組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進(jìn)一步包含至少一種其它治療劑。優(yōu)選地，所述治療劑如利巴韋林，可用于預(yù)防和/或治療丙型肝炎病毒感染。所述藥物組合物可包含兩或多個(gè)對(duì)于丙型肝炎病毒具有中和活性的結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，所述結(jié)合分子呈現(xiàn)協(xié)同中和活性。換句話說，所述組合物包含至少兩種具有中和活性的結(jié)合分子，特征在于所述結(jié)合分子在中和丙型肝炎病毒中起協(xié)同作用。如本文所用，術(shù)語“協(xié)同”是指當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，結(jié)合分子的組合作用高于單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的加合作用。所述協(xié)同作用的結(jié)合分子可以結(jié)合丙型肝炎病毒的相同或不同片段上的不同結(jié)構(gòu)。計(jì)算協(xié)同作用的方式是通過組合指數(shù)計(jì)算。組合指數(shù)(ci)的概念己經(jīng)由chou andtalalay(1984)描述。本發(fā)明的結(jié)合分子或藥物組合在用于人體之前可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中檢測(cè)。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴?？贡透窝撞《镜男》肿踊衔镆部梢詤f(xié)同作用?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最佳的所需應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。合適的劑量范圍可例如是0.01-100mg/kg體重，優(yōu)選0.1-15mg/kg體重。此外，例如可以給予一次推注、隨時(shí)間給予多次分開劑量或者根據(jù)治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發(fā)明的分子和組合物優(yōu)選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領(lǐng)域所熟知。用于診斷、預(yù)防和/或治療的其它分子可以以本發(fā)明的結(jié)合分子相似的給藥方案給予。如果單獨(dú)給予其它分子，則可以在給予本發(fā)明的一或多種人結(jié)合分子或藥物組合物之前、同時(shí)或者之后給予患者。對(duì)于人患者的精確給藥方案通常在臨床實(shí)驗(yàn)期間挑選出。檢測(cè)試劑和試劑盒本發(fā)明的結(jié)合分子可用于制備檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑或試劑盒。如本文所用，術(shù)語“待測(cè)樣品”涵蓋了多種樣品類型，包括生物學(xué)來源的血液及其它體液樣品，實(shí)體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養(yǎng)物，或者衍生自其中的細(xì)胞或者其后代。該術(shù)語還包括在獲得后已經(jīng)通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或者富集某些成分如蛋白質(zhì)或者多核苷酸。該術(shù)語涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清和細(xì)胞溶解產(chǎn)物。以所述的結(jié)合分子為基礎(chǔ)，可制備方便、快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑盒。因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在丙型肝炎病毒的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中含有本發(fā)明的抗丙型肝炎病毒的結(jié)合分子。在獲得了本發(fā)明提供的結(jié)合分子后，可以方便地制備出用于特異性檢測(cè)丙型肝炎病毒的檢測(cè)試劑盒。作為本發(fā)明的一種檢測(cè)方式，采用間接elisa法，將待測(cè)的抗原包被于固相載體上，利用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行檢測(cè)。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的結(jié)合分子是抗體，可根據(jù)雙抗夾心法的原理來檢測(cè)。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將一抗(如本發(fā)明的單克隆抗體)固定于載體，然后使一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與二抗反應(yīng)(所述的二抗攜帶可檢測(cè)信號(hào)，或可與攜帶可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)結(jié)合)，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。雙抗夾心法特別適用于具有兩個(gè)或兩個(gè)以上表位的抗原的檢測(cè)。為了在檢測(cè)時(shí)更方便，所述試劑盒中除了含有本發(fā)明的結(jié)合分子以外，還可以包含其它檢測(cè)試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是elisa試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如顯色劑、標(biāo)記物、 二抗、抗抗體、增敏劑等。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，各種變化形式的檢測(cè)試劑盒均是包含在本發(fā)明中的，只要在其中利用了本發(fā)明的結(jié)合分子作為識(shí)別丙型肝炎病毒的試劑。此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。在獲得了本發(fā)明提供的結(jié)合分子和/或試劑盒后，可以利用多種免疫學(xué)相關(guān)方法來檢測(cè)樣品中e2蛋白或其含量，從而得知待測(cè)樣品的供體是否感染丙型肝炎病毒，這些方法均被包含在本發(fā)明中。較佳地，所述的方法是以非疾病診斷為目的的。作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種體外(非診斷或治療性地)檢測(cè)丙型肝炎病毒的方法，包括以下步驟：(a1)將待測(cè)樣品包被于固相載體；(a2)將本發(fā)明的結(jié)合分子加樣于(a1)的固相載體，從而使待測(cè)樣品中的丙型肝炎病毒與結(jié)合分子結(jié)合，形成帶有“丙型肝炎病毒－本發(fā)明的結(jié)合分子”二元復(fù)合物的固相載體；(a3)將特異性結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合分子的檢測(cè)物加樣于(a2)的固相載體，形成帶有“丙型肝炎病毒－本發(fā)明的結(jié)合分子-檢測(cè)物”三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測(cè)物上攜帶一標(biāo)記物；(a4)檢測(cè)三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測(cè)樣品中丙型肝炎病毒的存在與否以或存在的量。按照上述方法，只要設(shè)置已知濃度的抗原對(duì)照，制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比照濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出待測(cè)樣品中的丙型肝炎病毒含量。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1)提供了一種全新的結(jié)合分子，其是全人源的，與其它動(dòng)物源性(如鼠源性)抗丙型肝炎病毒的分子相比，免疫原性大大減少，且親和性良好。不僅治療效果好，而且副作用低。2)本發(fā)明的結(jié)合分子能夠結(jié)合具有天然構(gòu)象的丙型肝炎病毒e2亞基，阻止丙型肝炎病毒侵染易感細(xì)胞。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。i.材料和方法以下說明本發(fā)明，即一株能夠中和丙型肝炎病毒的全人單克隆抗體制備過程以及抗體 特性分析過程。分為兩部分：(1)單細(xì)胞rt-pcr法獲得抗體基因以及抗體表達(dá)制備；(2)抗體特性分析。具體過程如下:1.外周血單核細(xì)胞(pbmc)的獲得從已感染丙型肝炎病毒的志愿者體內(nèi)抽取外周血，采用常規(guī)ficoll-paque(廠家為-h(cedarlane)公司)密度梯度離心，得到107以上個(gè)外周血單核細(xì)胞(pbmc)。ficoll分離方法：(1)收集血液，于50ml離心管(預(yù)含4％檸檬酸鈉1ml)，收集全血10ml，顛倒混勻8-10次。(即使檸檬酸鈉終濃度為0.4％)；(2)加等體積rpmi1640(含檸檬酸鈉)，混勻；(3)用15ml透明離心管，鋪3ml淋巴細(xì)胞分離液，在其上小心加6ml血樣。形成分離界面(或4ml分離液加8ml血樣)；(4)室溫離心800g，20min(2000rpm，20min)；(5)小心吸取界面層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新管；(6)加rpmi1640(含檸檬酸鈉)，稀釋減小液體密度。離心，800g/2000rpm，10min。去上清；(7)rpmi1640洗細(xì)胞2-3次，備用。2.e2蛋白特異性記憶b細(xì)胞分選使用fitc-cd19/apc-igg/cy3-hcv-e2為標(biāo)志物，經(jīng)流式細(xì)胞儀獲得特異性b細(xì)胞至96孔rt-pcr板，每孔一個(gè)細(xì)胞，獲得e2蛋白特異性記憶b細(xì)胞。1)丙型肝炎病毒包膜蛋白e2(hcv-e2)由哺乳動(dòng)物細(xì)胞cho表達(dá)系統(tǒng)表tmmaxchoexpressionsystem手冊(cè)；2)e2蛋白進(jìn)行生物素(biotin)標(biāo)記：no-weighsulfo-nhs-lc-biotin(購自pierce，參考pierce公司ez-linksulfo-nhs-lc-biotin生物素標(biāo)記protocol)10mm試劑；另兩個(gè)標(biāo)志物fitc-cd19和apc-igg均購自bdbioscience公司；3)分選細(xì)胞的標(biāo)記：pbmc細(xì)胞分組，實(shí)驗(yàn)組+對(duì)照組，按細(xì)胞數(shù)加入標(biāo)志物，避光染色，進(jìn)行標(biāo)記，用pbs重懸后，使用40μmbdfalcon濾膜過濾；4)特異性b細(xì)胞的分選：使用bdfacsariaii篩選，根據(jù)前向角和側(cè)向角從pbmc中篩選到淋巴細(xì)胞，然后通過不同對(duì)照組的調(diào)節(jié)補(bǔ)償，獲得丙肝e2蛋白的特異性記憶b細(xì)胞，將其分選到96孔板中進(jìn)行rt-pcr(反轉(zhuǎn)錄pcr)，每孔一個(gè)細(xì)胞，板置于干冰上。3.抗體基因根據(jù)文獻(xiàn)journalofimmunologicalmethods329(2008)112-124中報(bào)道的方法，獲得抗體基因。獲得的抗體基因連接pgemt載體(購自invitrogen公司)，進(jìn)行測(cè)序(華大基因測(cè)序公司)，常規(guī)方法驗(yàn)證抗體基因。然后將重、輕鏈基因分別連接表達(dá)載體abvec-higg和abvec-higkappa(kennethsmithetal.rapidgenerationoffullyhumanmonoclonalantibodiesspecifictoavaccinatingantige.natprotoc.2009；4(3):372-384)。4.抗體表達(dá)將前述插入了重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，進(jìn)行全人抗體表達(dá)(參考lipofectamine2000轉(zhuǎn)化手冊(cè))。(1)在轉(zhuǎn)染前一天將1.0×106細(xì)胞接種到6細(xì)胞培養(yǎng)板中；(2)a管：500μlopti-mem+4μgigg+4μgigl；(3)b管：500μlopti-mem+20μllipofectaminereagent；(4)靜置5分鐘后，將a管與b管混合，在室溫靜置20min；(5)a、b管混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)盤中，37℃孵育6h；(6)6h后，吸除含有l(wèi)ipofectaminereagentdna的培養(yǎng)液，每孔加入2mlfreestyletm293expressionmedium；(7)72h后，收集細(xì)胞上清，4℃，3000rpm，5min。5.抗原特異性檢測(cè)檢測(cè)表達(dá)的全人抗體是否識(shí)別hcv-e2(由哺乳動(dòng)物細(xì)胞cho表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)；參考freestylemaxchoexpressionsystem手冊(cè))，以及與抗原的結(jié)合能力。(1)包被hcv-e2于elisa板(購自nunc公司)，10μg/ml，每個(gè)樣品兩個(gè)復(fù)孔，每孔100μl，4℃過夜；(2)pbst洗板，3次；(3)封閉：1％bsa，每孔200μl，37℃，2h；(4)pbst洗板，3次；(5)根據(jù)測(cè)定濃度，調(diào)整全人抗體細(xì)胞上清至相同濃度，每孔100μl，hcv病人血漿為陽性對(duì)照，37℃，2h；(6)pbst洗板，3次；(7)goatanti-humanigg(fcspecific)-peroxidaseantibody，1:10000稀釋，每孔100μl，加到樣品和陽性對(duì)照的elisa板中，37℃，1h；(8)pbst洗板，3次；(9)底物a液:b液＝1:1，底物為tmb,3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(購自sigma，使用方法按產(chǎn)品說明)。每孔100μl，37℃，15min，避光反應(yīng)；(10)加入2mh2so4，每孔50μl；(11)用分光光度計(jì)測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光度(即od450)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。6.抗體中和活性測(cè)定——真病毒中和試驗(yàn)1)消化huh7.5.1細(xì)胞，用含有10％血清的dmem重懸，以105個(gè)/ml的密度鋪在96孔板上，培養(yǎng)12-24h，2)用含有10％血清的dmem培養(yǎng)液把病毒稀釋到1-2×103個(gè)ffu/ml，加上適量的抗體，在37℃孵育1h，3)把培養(yǎng)huh7.5.1的96孔板中的培養(yǎng)液吸出，加入抗體孵育過的病毒100ul。24h后換成新鮮的含10％血清的dmem培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，4)加入100ul的pfa固定細(xì)胞，室溫靜置30min，5)加入含有0.3％tritonx-100，3％bsa，10％fbs的pbs，室溫孵育1h，6)加入anti-ns3(或ns5a，或core)蛋白的一抗室溫孵育1.5h，7)用pbs洗3次，每次5min，8)加入anti-mouse的熒光二抗，室溫孵育1h，9)用pbs洗3次，每次5min，10)在熒光顯微鏡下觀察記錄每孔內(nèi)病毒感染的細(xì)胞集落數(shù)目。ii.實(shí)施例實(shí)施例1、hcv-e2蛋白特異性記憶b細(xì)胞使用fitc-cd19/apc-igg/cy3-hcv-e2為特異性標(biāo)志物，獲得了若干個(gè)hcv-e2蛋白的特異性b細(xì)胞，見圖1。實(shí)施例2、抗體基因rt-pcr和nested-pcr法獲得抗體重輕鏈可變區(qū)基因，分子量為400bp左右，β-actin作為內(nèi)參(343bp)，電泳圖譜見圖2，圖3和圖4。將來源于同一個(gè)b細(xì)胞抗體重輕鏈基因可變區(qū)連接t載體，測(cè)序并進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建。8d6重鏈可變區(qū)基因序列如下(seqidno:1)：gaggtgcagctggtgcagtctgggtctgagttgaagaagcctggggcctcactgaagctctcctgcaaggcttctggatacacctacattacccctgccatgaac(cdr1)tgggtgcgacaggcccctggacatgggcttgagtggatgggaggaatcaacaccaacactgggaacccaacctatgcccagggcttcgcagga(cdr2)cggtttgtcttctcctgggacacctctgtcagcacggcatatctgcatatcagcagcctaaagactgaggacactgccgtctattactgtgcggacacccgaatcttttcttgtcggcgtggaacgtgctatggtggtttcgatgtc(cdr3)tggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcag備注：其中使用下劃線標(biāo)注的為重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)序列，依次為重鏈基因cdr1(seqidno:5)，cdr2(seqidno:6)，cdr3(seqidno:7)序列。8d6重鏈可變區(qū)氨基酸序列如下((seqidno:2)：evqlvqsgselkkpgaslklsckasgytyitpamn(cdr1)wvrqapghglewmggintntgnptyaqgfag(cdr2)rfvfswdtsvstaylhisslktedtavyycadtrifscrrgtcyggfdv(cdr3)wgqgtmvtvss備注：其中使用下劃線標(biāo)注的依次為重鏈氨基酸cdr1(seqidno:8)，cdr2(seqidno:9)，cdr3(seqidno:10)序列。8d6輕鏈可變區(qū)基因序列如下(seqidno:3)：gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagaatcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcaactttttaaat(cdr1)tggtttcagcatagaccggggaaagcccctaaactcctgatctatggtgcaaccattttgcaaagt(cdr2)ggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagtgacagtagtacctacatc(cdr3)tttggccaggggaccaaggtggaaatcaaac備注：其中下劃線標(biāo)注的為輕鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)序列，依次為cdr1(seqidno:11)，cdr2(seqidno:12)，cdr3(seqidno:13)序列。8d6輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如下(seqidno:4)：diqmtqspsslsasvgdrititcrasqsisnfln(cdr1)wfqhrpgkapklliygatilqs(cdr2)gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsdsstyi(cdr3)fgqgtkveik備注：其中使用下劃線標(biāo)注的依次為輕鏈氨基酸cdr1(seqidno:14)，cdr2(seqidno:15)，cdr3(seqidno:16)序列。實(shí)施例3、抗體的抗原特異性elisa結(jié)果表明，8d6全人抗體對(duì)于cho表達(dá)的hcv-e2具有特異性結(jié)合能力。如圖5所示，此實(shí)驗(yàn)，用感染過hcv的病人血漿作為陽性對(duì)照，用細(xì)胞培液和一株流感病毒抗體1f2(參見文獻(xiàn)fullyhumanbroadlyneutralizingmonoclonalantibodiesagainstinfluenzaavirusesgeneratedfromthememorybcellsofa2009pandemich1n1influenzavaccinerecipient.huw，chena，miaoy，xias，lingz，xuk，etal.virology.2013jan20；435(2):320-8.doi:10.1016/j.virol.2012.09.034.)作為陰性對(duì)照。實(shí)施例4、抗體的中和活性全人單克隆抗體(8d6)使用293t細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)純化后將其濃度調(diào)整為50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml和0.08μg/ml進(jìn)行真病毒中和試驗(yàn)測(cè)定其中和活性，即對(duì)hcv真病毒的抑制率。用于實(shí)驗(yàn)的真病毒包括：pr52b6m、pr79、jfh1(國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)毒株)、pr26c3m、d183(2a)(國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)毒株)，上述真病毒株均獲自中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所。如圖6-7所示，相比于陰性對(duì)照(一株流感病毒ha蛋白的中和性全人單抗1f2)，實(shí)驗(yàn)組(抗丙肝病毒e2蛋白的全人單抗8d6)對(duì)于1b亞型中pr52b6m、pr79兩個(gè)毒株以及2a亞型中d183、jfh1兩個(gè)毒株hcv真病毒，在濃度大于0.4μg/ml時(shí)，具有超過90％的抑制率，對(duì)于另一株1b亞型毒株pr26c3m在10μg/ml以上是有超過90％的抑制率。實(shí)施例5、elisa驗(yàn)證8d6與不同基因型的hcv毒株的表面糖蛋白e2的結(jié)合活性用293t細(xì)胞表達(dá)來自不同基因型的hcv的表面糖蛋白e2(表1，且c端帶有6×histag)，收細(xì)胞上清，加入到預(yù)包被8d6抗體的96微孔板中，37℃孵育兩個(gè)2小時(shí)，洗去雜蛋白后，用mouse-antihistag的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。用分光光度計(jì)測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光度(即od450)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。表1、不同基因型的hcv的表面糖蛋白e2的genbank登錄號(hào)病毒株(基因型)表面糖蛋白e2genbank登錄號(hào)h77(1a)jf343780.2con1(1b)aj238799.1hcr6(1b)ay045702.1pr52(1b)hq912958.1pr26(1b)hq912956.1pr79(1b)hq912959.1jfh1(2a)ab047639.1j8(2b)jf343783.1patient28(3a)gq356213.1ed43(4a)jf343785.1sa13(5a)jf343786.1hk6a(6a)jf343787.174(6a)dq480524.1qc69(7a)fj230884.1結(jié)果如圖8，可見8d6抗體對(duì)于不同基因型的hcv具有廣譜的結(jié)合活性。實(shí)施例6、真病毒水平上進(jìn)行抗體微中和活性測(cè)定不同亞型的hcv病毒(表2)顆粒與梯度稀釋的8d6抗體在室溫孵育1個(gè)小時(shí)，然后加入到huh-7.5細(xì)胞中進(jìn)行孵育，3個(gè)小時(shí)孵育后，吸走細(xì)胞上清，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，再額外孵育72小時(shí)。被hcv感染的細(xì)胞用4％的多聚甲醛固定后，通過確定帶有熒光的細(xì)胞集落數(shù)量檢測(cè)ns5a的表達(dá)水平，進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞被hcv感染的情況。抗體的ic50值即病毒的感染被抑制50％時(shí)抗體的濃度，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。表2、不同hcv毒株的相關(guān)信息亞型病毒genbank登陸號(hào)1ah77jf343780.21bcon1aj238799.11bpr26hq912956.11bpr52hq912958.11bpr79hq912959.12ajfh7ab047639.12apr63kf6763512bj8jf343783.13as52jf343784.24aed43jf343785.25asa13jf343786.26ahk6ajf343787.27aqc69fj230884.18d6抗體的ic50值結(jié)果如表3。表3、用細(xì)胞培養(yǎng)的hcv真病毒體系驗(yàn)證8d6的微中和活性由表3可見，8d6在較低濃度時(shí)就具有良好的微中和活性，且中和活性具有廣譜性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁12