本發(fā)明涉及生物醫(yī)療領域，具體地涉及調節(jié)能量代謝的多肽及其在制備用于治療與能量代謝異常，特別是脂肪代謝異常有關之疾病的藥物中的用途。

背景技術：

肥胖是世界范圍內主要且日益增長的健康問題。肥胖也是誘發(fā)許多常見病(如動脈粥樣硬化、高血壓、ii型糖尿病、血脂障礙、冠心病、骨關節(jié)炎和多種惡性腫瘤)發(fā)生的危險因素。它還會通過降低運動能力和生活質量引起更嚴重的問題。肥胖的發(fā)生和由肥胖引起的疾病正在所有的發(fā)達國家中增長。

脂肪肝是指肝細胞內脂肪堆積過多導致的病變。脂肪肝的發(fā)病原因有很多種，比如酗酒、飲食不合理、久坐等。其在中國的發(fā)病率日益增高，成為威脅人們健康的一大威脅。

然而，目前用于治療肥胖和其引起的疾病，包括非酒精性脂肪肝的藥物和方法都具有一定的不足，因此對于肥胖和非酒精性脂肪肝的治療仍需要開發(fā)更有效和低副作用的藥物和方法。

骨鈣素是由成骨細胞合成和分泌的一種維生素k依賴性鈣結合蛋白，一種非膠原酸性糖蛋白，其分子中的維生素k依賴性谷氨酸殘基是骨鈣素和ca²⁺結合的重要功能基團^[1,2]。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人出人意料的發(fā)現(xiàn)了一種來源于骨鈣素的能夠調節(jié)能量代謝的多肽；其具有減少脂肪吸收，降低肝臟脂肪、外周血中血脂、及減小脂肪細胞體積等功能，能夠有效清除肝細胞中蓄積的脂肪、降低血脂水平、以及縮小體內脂肪組織，對于治療脂肪性肝炎、調節(jié)高血壓及其它心血管疾病起作用。

本發(fā)明的一些方面涉及調節(jié)能量代謝的多肽，所述多肽由式m1-za-m2表示，其中：

m1、m2各自獨立地為具有不超過5、4、3、2或1個氨基酸殘基的多肽區(qū)段或者不存在；

za為tyr-leu-x1-x2-x3-x4-gly-ala-x5-x6-pro-x7-pro-asp-x8-leu-glu-pro，其中：

x1為tyr、asn、asp或不存在，

x2為gln、asn、his、pro、ser或不存在，

x3為trp、gly或不存在，

x4為leu或不存在，

x5為pro或ser，

x6為ala或val，

x7為tyr或ser，

x8為thr或pro，

并且所述za可任選地具有中氨基酸替換、插入或缺失并且所述氨基酸替換、插入和缺失的總數(shù)不超過4，優(yōu)選不超過3，更優(yōu)選不超過2，最優(yōu)選不超過1。

進一步地，本發(fā)明的一些實施方案中，所述多肽中的za選自以下之一：

seqidno.1：ylgasvpspdplep，

seqidno.2：ylyqwlgapvpypdplep

seqidno.4：ylnnglgapapypdplep，

seqidno.5：ylyqwlgapvpypdtlep，

seqidno.6：ylyqwlgapvpypdplep，

seqidno.7：yldhwlgapapypdplep，

seqidno.8：yldpglgapapypdplep，

seqidno.9：yldhglgapapypdplep，

seqidno.10：yldqglgapapapdplep，

seqidno.11：yldsglgapvpypdplep。

進一步地，本發(fā)明的另一些實施方案中，所述多肽中的m1、m2均不存在；或者在又一些實施方案中，所述多肽中za為ylyqwlgapvpypdplep、m1不存在且m2為arg，即該多肽的氨基酸序列如seqidno.3所示；在又一些實施方案中，所述多肽中za為ylgasvpspdplep，m1不存在且m2為thr，即該多肽的氨基酸序列如seqidno.18所示。

本發(fā)明的另一些方面也涉及調節(jié)能量代謝的多肽，其包含選自以下任一序列之至少6個連續(xù)氨基酸且其氨基酸殘基總數(shù)不超過18，例如不超過17、16、15、14：

seqidno.1：ylgasvpspdplep，

seqidno.2：ylyqwlgapvpypdplep

seqidno.3：ylyqwlgapvpypdplepr，

seqidno.4：ylnnglgapapypdplep，

seqidno.5：ylyqwlgapvpypdtlep，

seqidno.6：ylyqwlgapvpypdplep，

seqidno.7：yldhwlgapapypdplep，

seqidno.8：yldpglgapapypdplep，

seqidno.9：yldhglgapapypdplep，

seqidno.10：yldqglgapapapdplep，

seqidno.11：yldsglgapvpypdplep。

進一步地，其包含以下任一：

seqidno.12：pvpypdplep，

seqidno.13：pypdplep，

seqidno.14：pdplep，

seqidno.15：svpspdplep，

seqidno.16：pspdplep。

更進一步地，其為

seqidno.12：pvpypdplep，

seqidno.13：pypdplep，

seqidno.14：pdplep，

seqidno.15：svpspdplep，

seqidno.16：pspdplep。

本發(fā)明的一些方面涉及本發(fā)明的多肽的可藥用鹽。

本發(fā)明的一些方面涉及這樣的本發(fā)明多肽或其可藥用鹽，其具有減少脂肪吸收，降低血脂水平，減輕非酒精性脂肪肝、以及縮小體內脂肪組織等作用。

本發(fā)明的一些方面涉及多核苷酸，其編碼本文上述的多肽。

本發(fā)明的一些方面涉及載體，其包含前述的多核苷酸。

本發(fā)明的一些方面涉及宿主細胞，其轉染有前述的載體并且能夠在可表達蛋白質的條件下產生本發(fā)明的多肽。

本發(fā)明的一些方面涉及藥物組合物，其包含治療有效量的前述本發(fā)明多肽或其可藥用鹽。

在本發(fā)明中所述的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物具有調節(jié)能量代謝，特別是脂肪代謝的作用。

本發(fā)明的一些方面涉及本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物在制備用于治療與能量代謝(更優(yōu)選地脂肪代謝)異常有關之疾病的藥物中的用途，所述疾病為可受益于脂肪吸收減少、血脂降低、脂肪消耗增加或脂肪積累減少的疾病，例如肥胖癥、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥、高血糖、高膽固醇、動脈粥樣硬化、冠心病。

本發(fā)明的一些方面涉及治療與脂肪代謝異常有關之疾病的方法，其包括向由此需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物，所述疾病為可受益于脂肪吸收減少、血脂降低、脂肪消耗增加或脂肪積累減少的疾病，例如肥胖癥、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥、高血糖、高膽固醇、動脈粥樣硬化、冠心病。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物可與任何已知用于治療與脂肪代謝異常有關之疾病的藥物和方法組合物一起施用。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物用于治療與脂肪代謝異常有關之疾病，所述疾病為可受益于脂肪吸收減少、血脂降低、脂肪消耗增加或脂肪積累減少的疾病，例如肥胖癥、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥、高膽固醇、動脈粥樣硬化、冠心病。

本發(fā)明的一些方面涉及本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽在制備用于減輕體重之保健品中的用途。

本發(fā)明的一些方面涉及用于減輕體重的保健品，其包含本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物可以通過各種常規(guī)的方式施用，優(yōu)選經口施用。

本發(fā)明的多肽可以對脂肪的吸收產生直接影響，經口施用減少了常規(guī)多肽施用的諸多不便，多肽的殘基很少，大大降低了成本，具有作為藥物的非常顯著的潛在優(yōu)勢。

附圖說明

圖1示出了使用高脂飼料喂養(yǎng)c57bl/6小鼠12周后獲得肥胖和非酒精性脂肪肝模型(diet-induced-obesity&non-alcoholicfattyliverdisease，dio-nafld)與正常對照的體重比較；正常飲食(nd)和高脂肪飲食(hfd)。

圖2示出了連續(xù)6周給高脂肪飲食的dio-nafld小鼠注射不同濃度的isap1和ocn(小鼠骨鈣素)后，與對照組(僅高脂肪飲食小鼠)相比，注射isap1對小鼠的影響。(a)nd對照組、hfd對照組及每日腹腔注射ocn或isap1組小鼠附睪脂肪墊的變化；(b)各組中附睪脂肪墊平均質量；(c)各組附睪脂肪墊組織切片的蘇木精伊紅(h&e)染色；(d)雙盲條件下根據(jù)h&e染色切片計算獲得的平均脂肪細胞表面積。統(tǒng)計學分析：與hfd對照組進行比較。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。

圖3示出了示出了連續(xù)6周給高脂肪飲食的dio-nafld小鼠注射不同濃度的isap1和ocn后，與對照組(僅高脂肪飲食小鼠)相比，腹腔注射isap1對小鼠肝臟的影響。(a)各組小鼠肝臟外觀的代表性形象的照片；(b)各組小鼠肝臟組織切片h&e染色；(c)各組小鼠肝臟油紅o染色后雙盲條件下獲得的蓄積非酒精性脂肪肝細胞的表面積。統(tǒng)計學分析：為與hfd對照組進行比較。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。各組分別有6只小鼠用于分析。

圖4示出了連續(xù)6周給高脂肪飲食的dio-nafld小鼠注射不同濃度的isap1和ocn后，與對照組(僅高脂肪飲食小鼠)相比，注射isap1對小鼠肝臟功能和血脂的影響。(a)谷丙轉氨酶(alt)；(b)堿性磷酸酶(alp)；(c)谷草轉氨酶(ast)；(d)血清總膽固醇(tc)；(e)低密度脂蛋白(ldl)；(f)高密度脂蛋白(hdl)。統(tǒng)計學分析：*:與hfd對照組進行比較。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001.#：與nd對照組進行比較。#:p<0.05,##:p<0.01,###p<0.001。各組分別有6只小鼠用于分析。

圖5示出了灌胃施用isap1和ocn對小腸脂肪吸收的影響。nd飼喂的野生型c57bl/6小鼠灌胃滅菌橄欖油(30分鐘)后，腹腔注射isap1和ocn后30分鐘安樂死小鼠并解剖獲得小腸，對近十二指腸段空腸進行冰凍切片并用油紅o染色，蘇木素復染(a)；雙盲條件下對油紅o陽性區(qū)域通過imagej軟件進行定量并計算該面積與小腸絨毛總面積的比值(b)。統(tǒng)計學分析：與生理鹽水+橄欖油組相比較。***:p<0.001.n＝3。

圖6示出了isap1和isap2分別與人gprc6a的結合及受體內化。(a)人gprc6a在hela細胞中過表達；(b)isap1、ocn和ocn-22；以及isap2、hocn和hocn-22與hugprc6a過表達的hela細胞的細胞膜的結合實驗；(c)帶有cy-5標記的ocn(cy5-ocn)、帶有cy-5標記的ocn-22(cy5-ocn22)，帶有cy-5標記的isap2(cy5-isap2)在gprc6a過表達的hela細胞中對gprc6a內化的影響。

圖7示出了在經灌胃施用ocn、isap1、isap2、isap3后七周內對小鼠的影響：(a)小鼠體重變化；(b)小鼠糞便中甘油三酯的含量比較。

圖8示出了來自不同物種的isap的序列的比較。

圖9示出了灌胃施用isap4、isap5、isap6對小腸脂肪吸收的影響。nd飼喂的野生型c57/b小鼠15只，分為5組，每組3只，三個實驗組，分別灌胃施用isap4、isap5、isap6；兩組對照，每日灌胃施用生理鹽水，持續(xù)一周后，三組實驗組和一個對照組灌胃施用滅菌橄欖油，一個對照組灌胃施用生理鹽水，20分鐘后安樂死小鼠并解剖獲得小腸，對近十二指腸段空腸進行冰凍切片并用油紅o染色，蘇木素復染；雙盲條件下對油紅o陽性區(qū)域通過imagej軟件進行定量并計算該面積與小腸絨毛總面積的比值。統(tǒng)計學分析：與生理鹽水+橄欖油組相比較。***:p<0.001.n＝3。

具體實施方式

定義

本文所用的術語“調節(jié)能量代謝的多肽”又稱作“胰島素分泌相關多肽(insulinsecretionassociationpeptide，isap)”是指來源于骨鈣素的或從骨鈣素衍生的能夠調節(jié)能量代謝的多肽及其變體。

本文所使用的術語“保守氨基酸替換”是指用具有相似性質的另一個氨基酸殘基對原氨基酸序列進行的替換。例如，賴氨酸殘基、精氨酸殘基和組氨酸殘基在具有堿性側鏈方面是相似的。此外，天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基在具有酸性側鏈方面是相似的。此外，天冬酰胺殘基、谷氨酰胺殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、酪氨酸殘基和半胱氨酸殘基在具有不帶電的極性側鏈方面是相似的，并且甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基、異亮氨酸殘基、脯氨酸殘基、色氨酸殘基、苯丙氨酸殘基和甲硫氨酸殘基在具有非極性側鏈方面是相似的。此外，酪氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、色氨酸殘基和組氨酸殘基在具有芳族側鏈方面是相似的。因此，對本領域技術人員顯而易見的是，在具有上述相似性質的氨基酸組中進行的氨基酸替換不會引起性質的任何變化。

本文中所使用的氨基酸簡寫及中文名稱對照如下

本文所使用的術語“與脂肪代謝異常有關之疾病”是指有遺傳或環(huán)境或二者共同導致的以脂肪代謝紊亂為特征的疾病或其并發(fā)癥，例如但不限于肥胖癥、ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥、高膽固醇、動脈粥樣硬化、冠心病。

本文所使用的術語“非酒精性脂肪肝”是指除酒精以外的因素所致的以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。

本文所使用的術語“胰島素抵抗”是指因用于降低血糖的胰島素的功能下降而細胞無法有效燃燒葡萄糖的狀態(tài)。當胰島素抵抗高時，人體就生成過多的胰島素，而導致高血壓、異常脂質血癥、心臟病和糖尿病等。尤其在ii型糖尿病的情況下，由于肌肉和脂肪組織無法識別胰島素的增加，所以胰島素不起作用。

本文所使用的未明確定義的術語具有本領域技術人員通常所理解的含義。

具體實施方案

本發(fā)明所使用的dmem購自sigma中，其中每500ml培養(yǎng)基中補充10％fbs(胎牛血清)，1％非必須氨基酸，1g葡萄糖，0.75g碳酸氫鈉，0.1g牛血清白蛋白以及1.5mlhepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)。

3t3l1從atcc購買。

isap1序列為tyr-leu-gly-ala-ser-val-pro-ser-pro-asp-pro-leu-glu-pro-thr(seqidno.18)。isap2的序列為tyr-leu-tyr-gln-trp-leu-gly-ala-ser-val-pro-ser-pro-asp-pro-leu-glu-pro(seqidno.2)。isap3的序列為tyr-leu-tyr-gln-trp-leu-gly-ala–ser-val-pro-ser-pro-asp-pro-leu-glu-pro-arg(seqidno.3)。isap4序列為ser-val-pro-ser-pro-asp-pro-leu-glu-pro(seqidno.15)。isap5序列為pro-ser-pro-asp-pro-leu-glu-pro(seqidno.16)。isap6序列為pro-asp-pro-leu-glu-pro(seqidno.14)。

所有的動物實驗均通過中國科學院先進技術研究院動物倫理委員會批準，按照倫理委員會的要求進行。

實施例1

isap1的功能研究

1、高脂喂養(yǎng)建立肥胖和非酒精性脂肪肝模型

健康6周齡雄性c57bl/6spf級小鼠購買自廣東省實驗動物中心，體質量18-22g。分兩組，飼養(yǎng)于深圳先進研究院spf級動物房。對照組：給予小鼠正常飼料(nd)(正常飼料：脂肪，5％；碳水化合物，53％；蛋白，23％；總熱量25j/g)，自由攝食和飲水，喂養(yǎng)12周。實驗組：給予小鼠高脂飼料(hfd)(高脂飼料d12451，researchdiets,inc.)，自由攝食和飲水，喂養(yǎng)12周。檢測其生理指標。高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重超過40g，認為肥胖和非酒精性脂肪肝模型(dio-nafld)構建成功。構建中的小鼠體重與對照組的對比見圖1，箭頭所指為開始飼喂高脂飼料的時間點。

2、腹腔注射isap1對dio-nafld小鼠的影響

2.1腹腔注射isap1對附睪脂肪墊的影響

高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重超過40g，血糖高于10mmol時，對dio-nafld小鼠進行為期6周的isap1腹腔注射，每組分別有6只小鼠，將isap1溶解于0.01％bsa生理鹽水溶液中，每日一次以20pmol/g，2pmol/g劑量腹腔注射到dio-nafld小鼠中，ocn(小鼠骨鈣素蛋白)與isap1類似，濃度為6pmol/g。6周后，施用95％co2對小鼠實施安樂死，采集其附睪脂肪墊組織，稱重；然后做石蠟切片，通過顯微術觀察脂肪細胞面積。

實驗結果見圖2，(a)nd對照組、hfd對照組及每日腹腔注射多肽組小鼠脂肪的整體外觀，與hfd對照組相比，施用isap1使脂肪組織明顯減少；(b)各組小鼠的附睪脂肪墊平均質量，與hfd對照組相比，施用isap1使附睪脂肪墊重量顯著降低；(c)各組附睪脂肪墊h&e染色，揭示與hfd對照組相比，施用isap1使脂肪細胞明顯減?。?d)雙盲條件下根據(jù)h&e染色切片計算獲得的平均單個脂肪細胞表面積，說明isap1使脂肪細胞明顯減小。統(tǒng)計學分析：與hfd對照組進行比較。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。

2.2腹腔注射isap1對肝臟的影響

步驟2.1中，在采集脂肪組織的同時采集肝臟，進行外觀拍照，之后取部分肝臟組織進行冰凍切片，使用油紅o染色后進行顯微鏡觀察，然后對相同面積進行定量分析，實驗結果參見圖3。(a)各組小鼠肝臟外觀的代表性形象,顏色越淡說明脂肪含量越高；hfd+載劑導致顯著的肝臟脂肪積累，腹腔注射isap1顯著減少了肝臟的脂肪積累(b)各組小鼠肝臟h&e染色，淺色代表細胞內為染色的脂肪；(c)各組小鼠肝臟油紅o染色后雙盲條件下獲得的蓄積非酒精性脂肪肝細胞的表面積，可見在肝臟中，isap1與hfd對照相比，脂肪所占的比例顯著降低，表明isap1降低了肝臟細胞中的脂肪含量。

2.3腹腔注射isap1對小鼠肝臟功能和血脂的影響。

步驟2.1中，在處死小鼠之前，尾靜脈采血，使用羅氏血糖儀(型號cobas8000)按照制造商的說明書檢測谷丙轉氨酶(alt)、堿性磷酸酶(alp)、谷草轉氨酶(ast)、血清膽固醇，以及低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)。實驗及結果參見圖4，甚至在2pmol/g的劑量下，與hfd對照相比，isap1有效降低alt、alp、ast、膽固醇以及l(fā)dl。

從以上的結果可以看出，isap1的腹腔注射可以對小鼠的體內脂肪代謝產生顯著影響，減少肝臟細胞和脂肪細胞中的脂肪積累，改善脂肪代謝，有效的緩解非酒精性脂肪肝的進展。

3、isap1與人gprc6a的結合

3.1在hela細胞中過表達hgprc6a

1)細胞鋪板：將hela細胞懸液以1.6×10⁵/ml的密度鋪板在6孔板中，每孔2mldmem培養(yǎng)基，于37℃，5％的co2中培養(yǎng)24小時。

2)使用lipofectamine2000(invitrogen)，按照廠商的說明書將hgprc6過表達載體(preceiver-m61)轉染到hela細胞中，轉染后4小時更換正常培養(yǎng)基。

3)轉染后48小時，棄掉培養(yǎng)基，用無菌pbs清洗板底細胞兩次，添加300μl的trizol溶液，按照rnaisoplus(takara)說明書提取細胞rna，經dna酶處理后,用superscript^t(invitrogen公司,加拿大)試劑盒經dnaengine反轉錄成cdna。以cdna為模板,用sybrgreen法對各時間點的熒光pcr產物進行實時監(jiān)測分析(lightcyclerroche公司,德國)，以檢測hgprc6a的表達量。如有需要，使用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達細胞株，之后使用qpcr檢測其基因表達，實驗結果如圖6a所示，人gprc6a在hela中穩(wěn)定大量表達。

3.2ocn的不同多肽與過表達hgprc6a的hela細胞的細胞膜的結合實驗

實驗結果見圖6b，與ocn相比，isap1具有幾乎一致的膜結合能力，而ocn-22雖能和gprc6a結合但親和性相差了10倍，證明isap1是ocn的核心結構域，與受體hgprc6a相互作用。

4、isap1急性灌胃在正常小鼠中對小腸脂肪吸收的影響

使用6周齡雄野生型c57bl/6小鼠，分四組，每組3只，腸道內灌注滅菌橄欖油溶液200μl(sigma)，30分鐘后，腹腔注射ocn和isap1(濃度為6pmol/g)，并于30分鐘處死小鼠，收集小腸樣本。樣本為十二指腸到盲腸段，取等長3段?？拷改c段用預冷的生理鹽水溶液沖洗后，進行冰凍切片，使用油紅o染色觀察脂肪吸收。

實驗結果參見圖5；(a)對近十二指腸段空腸進行冰凍切片并用油紅o染色，蘇木素復染；(b)雙盲條件下對油紅o陽性區(qū)域通過imagej軟件進行定量并計算該面積與小腸絨毛總面積的比值?？梢钥闯觯鄬τ邴}水對照，isap1非常有效的降低了橄欖油吸收，甚至比ocn的效果也明顯很多。

5、灌胃施用isap1對hfd小鼠的影響

使用6周齡雄野生型c57bl/6小鼠，分6組，每組6只，第1組給予正常飼料(nd)，第2-6組給予高脂飼料(hfd)，第2組作為對照，第3-6組為實驗組，每日分別以2pmol/g體重灌胃施用ocn、isap1、isap2、isap3，持續(xù)七周，每周監(jiān)測體重一次。實驗結果見圖7a，從圖中可以明顯看出，相對hfd對照組，isap1組出現(xiàn)了明顯的體重降低。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。

收集第7周的小鼠糞便，在60℃下烘烤3天，確保烘干，然后取1毫克，用1ml氯仿和甲醇2比1的混合溶液浸泡，然后用組織勻漿儀粉碎糞便，離心后取上清，用羅氏血生化儀檢測其甘油三酯，實驗結果參見圖7b。**:p<0.01,***:p<0.001。與hfd對照組相比，isap1組的糞便中甘油三酯的含量明顯升高，表明灌胃施用isap1顯著減少了腸道中甘油三酯的吸收。

實施例2

isap2的功能研究

1、isap2與人gprc6a的結合

1.1在hela細胞中過表達hgprc6a

1)細胞鋪板：將hela細胞懸液以1.6×10⁵/ml的密度鋪板在6孔板中，每孔2mldmem培養(yǎng)基，于37℃，5％的co2中培養(yǎng)24小時。

2)使用lipofectamine2000(invitrogen)，按照廠商的說明書將hgprc6過表達載體(preceiver-m61)轉染到hela細胞中，轉染后4小時更換正常培養(yǎng)基。

3)轉染后48小時，棄掉培養(yǎng)基，用無菌pbs清洗板底細胞兩次，添加300μl的trizol溶液，按照rnaisoplus(takara)說明書提取細胞rna，經dna酶處理后,用superscript^t(invitrogen公司,加拿大)試劑盒經dnaengine反轉錄成cdna。以cdna為模板,用sybrgreen法對各時間點的熒光pcr產物進行實時監(jiān)測分析(lightcyclerroche公司,德國)，以檢測hgprc6a的表達量。如有需要，使用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達細胞株，之后使用qpcr檢測其基因表達，實驗結果如圖6a所示，人gprc6a在hela中穩(wěn)定大量表達。

2、isap2和hocn與過表達hgprc6a的hela細胞的細胞膜的結合實驗

實驗方法與實施例中所述基本相同，實驗結果見圖6b，與hocn相比，isap2具有幾乎一致的膜結合能力，而hocn-22不具備這種能力，結合實施例1中項3.2的結果，證明isap1和isap2分別是ocn和hocn的核心結構域，均與受體hgprc6a相互作用，從而認為isap1和isap2具有相同的功能，通過hgprc6a引起后續(xù)的信號傳導和生物學事件。

2.3帶有cy5標記的ocn、hocn22，isap2在gprc6a過表達的hela細胞中促進gprc6a的內化。

將表達hgprc6ahela細胞懸液以1.6×10⁵/ml的密度鋪板在預先放置明膠涂層蓋玻片的24孔板中，每孔0.5mldmem，于37℃，5％的co2中培養(yǎng)24小時。細胞在處理前，用無血清培養(yǎng)基饑餓4h后，每孔添加100nm的cy5-ocn、cy5-hocn22，cy5-isap2，37℃孵育30分鐘，使用多聚甲醇固定細胞30分鐘，并加入tritonx-100(sigma)孵育10分鐘，dapi(sigma)10秒按照廠商的說明書，對細胞和染色，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，實驗結果參見圖6c。可見，cy5-ocn和cy5-isap2在細胞內部有分布，而cy5-hocn22則分布在胞外，再次說明了cy5-ocn和cy5-isap2均可與受體結合并通過內在化作用進入細胞內，從而發(fā)揮調節(jié)能量代謝的作用。

2.4灌胃施用isap2對hfd小鼠的影響

使用6周齡雄野生型c57bl/6小鼠，分6組，每組6只，第1組給予正常飼料(nd)，第2-6組給予高脂飼料(hfd)，第二組作為對照，第3-6組為實驗組，分別每日灌胃2pmol/g體重的ocn、isap1、isap2、isap3，持續(xù)七周，每周監(jiān)測體重一次。實驗結果見圖7a，從圖中可以明顯看出，相對hfd對照組，isap2組出現(xiàn)了明顯的體重降低。

收集第7周的小鼠糞便，在60℃下烘烤3天，確保烘干，然后取1毫克，用1ml氯仿和甲醇2比1的混合溶液浸泡，然后用組織勻漿儀粉碎糞便，離心后取上清，用羅氏血生化儀檢測其甘油三酯，實驗結果參見圖7b。與hfd對照組相比，isap2組的糞便中甘油三酯的含量明顯升高，表明灌胃施用isap2顯著減少了腸道中甘油三酯的吸收。

實施例3

isap3的功能研究

1、灌胃施用isap3對hfd小鼠的影響

使用6周齡雄野生型c57bl/6小鼠，分6組，每組6只，第1組給予正常飼料(nd)，第2-6組給予高脂飼料(hfd)，第二組作為對照，第3-6組為實驗組，分別每日灌胃2pmol/g體重的ocn、isap1、isap2、isap3，持續(xù)七周，每周監(jiān)測體重一次。實驗結果見圖7a，從圖中可以明顯看出，相對hfd對照組，isap3組出現(xiàn)了明顯的體重降低。

收集第7周的小鼠糞便，在60℃下烘烤3天，確保烘干，然后取1毫克，用1ml氯仿和甲醇2比1的混合溶液浸泡，然后用組織勻漿儀粉碎糞便，離心后取上清，用羅氏血生化儀檢測其甘油三酯，實驗結果參見圖7b。與hfd對照組相比，isap3組的糞便中甘油三酯的含量明顯升高，表明灌胃施用isap3顯著減少了腸道中甘油三酯的吸收。

對比isap1、isap2、isap3的序列可知：相對于isap1,isap2具有4個插入，2個替換，和1個缺失；相對于isap1，isap3具有4個插入，3個替換；相對于isap2，isap1具有4個缺失，2個替換，和1個插入；綜上所述，可以認為三個多肽互為變體，推定可以以這三個序列為基礎，進行本領域技術人員公知的氨基酸替換、插入和缺失，條件是不使其調節(jié)能量代謝的能力顯著降低，例如降低不超過40％、30％、20％、10％，參見附圖8中對多種不同生物來源的同源序列進行比對，其中seqidno.2：ylyqwlgapvpypdplep，seqidno.4：ylnnglgapapypdplep，seqidno.5：ylyqwlgapvpypdtlep，seqidno.6：ylyqwlgapvpypdplep，seqidno.7：yldhwlgapapypdplep，seqidno.8：yldpglgapapypdplep，seqidno.9：yldhglgapapypdplep，seqidno.10：yldqglgapapapdplep，seqidno.11：yldsglgapvpypdplep之間差異很小，兩兩比較時，多數(shù)情況下差異不超過四個氨基酸的替換，因此可以推定這些序列具有類似的生物學功能，也應當包含在本發(fā)明的范圍內，優(yōu)選地，其中缺失、替換和插入的總數(shù)不超過4，例如不超過3、2、1。另外seqidno.1與seqidno.18相比僅缺失了一個氨基酸殘基，因此推斷seqidno.1也具有與seqidno.18類似的功能。

同時，相對于isap2，isap1、isap3相當于在isap2末端具有1個插入；表明可以在多肽的末端添加若干個氨基酸殘基，條件是不使其調節(jié)能量代謝的能力顯著降低，例如降低不超過40％、30％、20％、10％，優(yōu)選地末端添加不超過5個，例如4個、3個、2個、1個或0個氨基酸殘基。

實施例4

isap4、isap5、isap6的功能

isap4、isap5、isap6急性灌胃在正常小鼠中對小腸脂肪吸收的影響

使用6周齡雄野生型c57bl/6小鼠15只，分為5組，每組3只，三個實驗組，分別以2pmol/g體重、灌胃施用isap4、isap5、isap6；兩組對照，每日灌胃施用等體積生理鹽水，持續(xù)一周后，第8日，分別灌胃施用isap4、isap5、isap6以及生理鹽水后30分鐘，三組實驗組和一個對照組灌胃施用滅菌橄欖油200μl，一個對照組灌胃施用生理鹽水200μl，50分鐘后95％co2安樂死小鼠并解剖獲得小腸，對近十二指腸段空腸進行冰凍切片并用油紅o染色，蘇木素復染；雙盲條件下對油紅o陽性區(qū)域通過imagej軟件進行定量并計算該面積與小腸絨毛總面積的比值。統(tǒng)計學分析：與生理鹽水+橄欖油組相比較。***:p<0.001.n＝3。。

實驗結果參見圖9；雙盲條件下對油紅o陽性區(qū)域通過imagej軟件進行定量并計算該面積與小腸絨毛總面積的比值?？梢钥闯?，相對于鹽水對照，isap4、isap5、isap6非常有效的降低了橄欖油吸收，證明了他們和isap1、isap2、isap3在生物學功能上相當，同時，參照圖8的序列對比，也可以看出seqidno.12：pvpypdplep與seqidno.15：svpspdplep，seqidno.13：pypdplep與seqidno.16：pspdplep在序列上相似度非常高，同時在各個物種之間也是非常保守的序列，因而應當具有類似的生物活性，從而可以認為這些多肽及其變體也能夠通過口服施用對脂肪的吸收和代謝產生影響，即可以對其進行本領域技術人員公知的氨基酸替換、插入和缺失，條件是不使其調節(jié)能量代謝的能力顯著降低，例如降低不超過40％、30％、20％、10％。同時，isap4、isap5、isap6更短，因此成本更低，穩(wěn)定性更好，具有用作制備治療與脂肪代謝異常有關之疾病的藥物的巨大潛力。

本文中提及的所有出版物和專利通過引用整體并入本文，如同每個單獨的出版物或專利被具體地且單獨地表明通過引用并入。在沖突的情況下，以本申請(包括本文中的任何定義)為準。

等同方案

雖然本文中已經明確地公開了本發(fā)明的一些具體實施方案，以上說明書是舉例說明性的而非限制性的。對于本領域的技術人員來說，通過瀏覽本說明書和所附權利要求，本發(fā)明的許多變化形式將變得明顯。本發(fā)明的全部范圍應通過參照權利要求、其等同方案的全部范圍、以及本說明書和這樣的變化來確定。

序列表

<110>深圳先進技術研究院

<120>調節(jié)能量代謝的多肽及其用途

<160>18

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>小鼠（musmusculus）

<400>1

tyrleuglyalaservalproserproaspproleuglupro

1510

<210>2

<211>18

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>2

tyrleutyrglntrpleuglyalaprovalprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>3

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>isap3

<400>3

tyrleutyrglntrpleuglyalaprovalprotyrproaspproleu

151015

gluproarg

<210>4

<211>18

<212>prt

<213>大鼠（rattusnorvegicus）

<400>4

tyrleuasnasnglyleuglyalaproalaprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>5

<211>18

<212>prt

<213>倭黑猩猩（pantroglodytes）

<400>5

tyrleutyrglntrpleuglyalaprovalprotyrproaspthrleu

151015

glupro

<210>6

<211>18

<212>prt

<213>獼猴（macacamulatta）

<400>6

tyrleutyrglntrpleuglyalaprovalprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>7

<211>18

<212>prt

<213>牛（bostaurus）

<400>7

tyrleuasphistrpleuglyalaproalaprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>8

<211>18

<212>prt

<213>綿羊（ovisaries）

<400>8

tyrleuaspproglyleuglyalaproalaprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>9

<211>18

<212>prt

<213>野豬（susscrofa）

<400>9

tyrleuasphisglyleuglyalaproalaprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>10

<211>18

<212>prt

<213>裸鼢鼠（heterocephalusglaber）

<400>10

tyrleuaspglnglyleuglyalaproalaproalaproaspproleu

151015

glupro

<210>11

<211>18

<212>prt

<213>犬（canislupus）

<400>11

tyrleuaspserglyleuglyalaprovalprotyrproaspproleu

151015

glupro

<210>12

<211>10

<212>prt

<213>人

<400>12

provalprotyrproaspproleuglupro

1510

<210>13

<211>8

<212>prt

<213>人

<400>13

protyrproaspproleuglupro

15

<210>14

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>iasp6

<400>14

proaspproleuglupro

15

<210>15

<211>10

<212>prt

<213>小鼠

<400>15

servalproserproaspproleuglupro

1510

<210>16

<211>8

<212>prt

<213>小鼠

<400>16

proserproaspproleuglupro

15

<210>17

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>isap的一種通式

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa為tyr、asn、asp或不存在

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>xaa為gln、asn、his、pro、ser或不存在

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa為trp、gly或不存在

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa為leu或不存在

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>xaa為pro或ser

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>xaa為ala或val

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>xaa為tyr或ser

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>為thr或pro

<400>21

tyrleuxaaxaaxaaxaaglyalaxaaxaaproxaaproaspxaaleu

151015

glupro

<210>18

<211>15

<212>prt

<213>小鼠（musmusculus）

<400>18

tyrleuglyalaservalproserproaspproleugluprothr

151015