調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位、組合物及其用途的制作方法
本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2008年1月29日，申請(qǐng)?zhí)枮?00880011016.5(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枺簆ct/us2008/001148，針對(duì)的分案申請(qǐng)?zhí)枺?01310685046.7)，發(fā)明名稱為“調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表位、組合物及其用途”。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明廣泛涉及新穎種類的t細(xì)胞表位組合物(稱作“tregitopes”)。本發(fā)明提供tregitope組合物、其制備方法和用途。
發(fā)明背景
人工誘導(dǎo)對(duì)自身或外源抗原的耐受是治療自身免疫、移植變態(tài)反應(yīng)和其他疾病的目標(biāo)，并且在用自體蛋白和非-自體蛋白的療法中也是需要的。直至最近，治療性耐受誘導(dǎo)依賴于可引起細(xì)胞排除(celldepletion)和細(xì)胞因子特性改變的基礎(chǔ)廣泛的方法。這些基礎(chǔ)廣泛的方法一般會(huì)減弱免疫系統(tǒng)并使許多受試者易于患機(jī)會(huì)感染、自身免疫攻擊和癌癥。本領(lǐng)域需要侵襲性較低并且更具靶向性的方法誘導(dǎo)免疫耐受。
免疫耐受由t細(xì)胞、b細(xì)胞、細(xì)胞因子和表面受體之間的復(fù)雜相互作用調(diào)節(jié)。最早的自我/非我辨別發(fā)生在新生兒發(fā)育過(guò)程中的胸腺，其髓質(zhì)上皮細(xì)胞表達(dá)對(duì)未成熟t細(xì)胞的特異自身蛋白表位。以高親和性識(shí)別自身抗原的t細(xì)胞被清除，但是具有中等親和性的自身反應(yīng)性t細(xì)胞可免于被清除并且可轉(zhuǎn)化成所謂的“天然”調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)。這些天然treg細(xì)胞被運(yùn)輸至外周并提供對(duì)自身免疫的長(zhǎng)久抑制。
第二種形式的耐受發(fā)生在外周，其中成熟t細(xì)胞在il-10和tgf-β存在下經(jīng)它們的t細(xì)胞受體活化轉(zhuǎn)化成“適應(yīng)性”treg表型。這些適應(yīng)性treg細(xì)胞的可能作用包括成功清除入侵病原體后緩沖免疫應(yīng)答作為控制變態(tài)反應(yīng)或低水平慢性感染可能引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)的方法，或可能輔助有益的共生細(xì)菌和病毒的共存?！斑m應(yīng)性”treg也可在控制經(jīng)歷了體細(xì)胞超突變的人抗體的生存周期中發(fā)揮作用。
天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞是外周免疫調(diào)節(jié)的重要組分。經(jīng)它們的tcr活化后，天然tregs可經(jīng)接觸依賴型和非依賴型機(jī)制抑制對(duì)不相關(guān)抗原的旁觀者效應(yīng)t細(xì)胞應(yīng)答。此外這些細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子包括il-10和tgf-β可誘導(dǎo)抗原特異性適應(yīng)性tregs。盡管已做出了大量努力，除少數(shù)例外，天然tregs并且更重要的在具有臨床意義的體積中循環(huán)的天然tregs的特異性仍是未知。
本領(lǐng)域需要鑒別包含在普通自體蛋白例如igg(“tregitopes”)中的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表位以及與它們制備相關(guān)的方法和用途。
概述
本發(fā)明利用調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)尤其是已在外周調(diào)節(jié)對(duì)外源和自身蛋白的免疫應(yīng)答的那些細(xì)胞(預(yù)存或天然treg)的功能。在一方面本發(fā)明提供t-細(xì)胞表位多肽組合物。
通過(guò)使用tregitopes和tregitope-抗原融合物選擇性黏附和活化預(yù)存天然treg作為治療以不想要的免疫應(yīng)答存在為標(biāo)志的任何疾病或癥狀的手段具有治療價(jià)值。實(shí)例包括以下：自身免疫疾病例如i型糖尿病、ms、狼瘡和ra；移植相關(guān)病癥例如移植物抗宿主疾病(gvhd)；變態(tài)反應(yīng)；生物藥物例如單克隆抗體，替代蛋白例如fviii或胰島素，治療性毒素例如肉毒桿菌毒素的應(yīng)用引起的免疫排斥；以及對(duì)急性或慢性傳染病免疫應(yīng)答的控制。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及t-細(xì)胞表位多肽組合物，其包括至少一種選自seqidnos：4-58的多肽。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明多肽和藥學(xué)可接受載體的藥用組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及編碼至少一種選自seqidnos：4-58的t-細(xì)胞表位多肽的核酸。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明核酸的載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明載體的細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及治療或預(yù)防有需要的受試者中醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給予治療有效量的選自seqidnos：4-58的t-細(xì)胞表位多肽。在具體的實(shí)施方案中，該醫(yī)學(xué)病癥選自：變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、移植相關(guān)疾病、移植物抗宿主疾病、酶或蛋白質(zhì)缺乏癥、凝血障礙、癌癥、不育；以及病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染。
在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及預(yù)防或治療受試者醫(yī)學(xué)病癥的試劑盒，其中該試劑盒包括至少一種選自seqidnos：4-58的t-細(xì)胞表位多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及擴(kuò)增調(diào)節(jié)性t細(xì)胞群的方法，其包括：(a)提供受試者的生物樣品；(b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞；以及將分離的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞與有效量的本發(fā)明tregitope組合物在t-調(diào)節(jié)性細(xì)胞數(shù)量增加形成擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞組合物的條件下接觸，藉此擴(kuò)增生物樣品中的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及刺激生物樣品中調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞的方法，其包括：(a)提供受試者的生物樣品；(b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞；以及將分離的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞與有效量的本發(fā)明tregitope組合物在t-調(diào)節(jié)性細(xì)胞被刺激以改變一種或多種生物學(xué)功能的條件下接觸，藉此刺激生物樣品中的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及抑制受試者中免疫應(yīng)答的方法，其包括給予受試者包括治療有效量的包括tregitope的肽的組合物，其中該肽抑制免疫應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，該肽抑制效應(yīng)t細(xì)胞應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，該肽抑制輔助t細(xì)胞應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制b細(xì)胞應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)給予治療有效量的包括一種或多種tregitopes的組合物抑制受試者中抗原特異性免疫應(yīng)答的方法，其中一種或多種tregitopes與特異目標(biāo)抗原或共價(jià)結(jié)合、或非共價(jià)結(jié)合或混合，引起對(duì)該目標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答降低。在具體的實(shí)施方案中，抑制作用由天然treg介導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，該抑制作用由適應(yīng)性treg介導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制效應(yīng)t細(xì)胞應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制輔助t細(xì)胞應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，該肽抑制b細(xì)胞應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，該肽包括選自seqidnos：4-58的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中。本發(fā)明涉及增強(qiáng)疫苗遞送載體免疫原性的方法，其包括鑒別和去除調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表位。在具體的實(shí)施方案中該t細(xì)胞表位選自seqidnos：4-58。
附圖簡(jiǎn)述
圖1為免疫球蛋白g(igg)的示意圖。
圖2為比較加帽和不加帽肽的一系列圖解表示。用單獨(dú)(上圖)的cef(陽(yáng)性對(duì)照肽庫(kù))、cef+tregitope289-酰胺(中圖)或cef+tregitope-289-不加帽(下圖)在培養(yǎng)基中刺激pbmc8天。與單獨(dú)cef溫育相比，cef與tregitope-289-酰胺共溫育1)得到更高的具有調(diào)節(jié)性表型的細(xì)胞百分比(左圖)和2)導(dǎo)致響應(yīng)cef再刺激的γ干擾素分泌的相關(guān)顯著性(p＜0.0005)降低(右圖)。相反，與單獨(dú)cef溫育(上圖)相比，與tregitope289-不加帽(下圖)共溫育未引起顯著性差異。
圖3顯示了tregitope存在下天然tregs的活化。在破傷風(fēng)毒素肽(tt830-844)、tregitope或無(wú)刺激物存在下體外直接刺激人pbmcs四天。用抗-cd4和抗-cd25胞外染色細(xì)胞并接著用foxp3胞內(nèi)染色，用流式細(xì)胞儀分析。與tt830-844(745個(gè)細(xì)胞的12.5％)或無(wú)刺激物相比(497個(gè)細(xì)胞的19.5％)，用tregitope溫育增加了cd4+cd25+foxp3+t細(xì)胞的百分比(644個(gè)細(xì)胞的53.6％)。
圖4為顯示tregitope誘導(dǎo)t-調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子上調(diào)和t-效應(yīng)細(xì)胞因子和趨化因子下調(diào)的一系列柱形圖。用a)衍生自c3d蛋白的免疫原性肽庫(kù)(黑色柱形)；b)c3d肽+tregitope-167(淺灰色柱形)或c)c3d肽+tregitope134(中度灰色柱形)初始刺激后對(duì)c3d再刺激的應(yīng)答。第二次溫育中，應(yīng)答顯示為高于背景的倍數(shù)增加，其中背景為無(wú)刺激物(對(duì)照)。以pg/ml表示的各自的基線(背景)值在x-軸標(biāo)注中指出。il-4、tnfα或tgfβ1水平?jīng)]有顯著性差異。
圖5為顯示用a)衍生自c3d蛋白的免疫原性肽庫(kù)(黑色柱形)或b)c3d肽+tregitope-167(淺灰色柱形)初始刺激后對(duì)c3d肽再刺激的應(yīng)答的一系列柱形圖。第二次溫育中，應(yīng)答顯示為高于背景的倍數(shù)增加，其中背景為無(wú)刺激物(對(duì)照)。對(duì)于各細(xì)胞因子，基線(無(wú)刺激物，背景)值顯示于x-軸標(biāo)注中。
圖6為顯示用衍生自tshr的表位協(xié)同刺激的柱形圖，tshr為格雷夫斯病的靶抗原，抑制對(duì)格雷夫斯病患者pbmc表位的免疫應(yīng)答。來(lái)自格雷夫斯病患者的pbmc首先與1)單獨(dú)tshr肽庫(kù)或2)tshr肽庫(kù)和tregitope-134、tregitope-167和tregitope-289庫(kù)溫育8天。然后收獲細(xì)胞、洗滌并與1)單個(gè)的tshr肽和tregitope庫(kù)或2)tshr肽庫(kù)和tregitope庫(kù)溫育(在所描述的il-4elispot板中)。也有“無(wú)刺激物”的對(duì)照板。相對(duì)于未用抗原再刺激顯示應(yīng)答。黑色柱形對(duì)應(yīng)于單獨(dú)用抗原的溫育和再刺激，灰色柱形對(duì)應(yīng)于用抗原+tregitope庫(kù)的溫育和再刺激。在本實(shí)驗(yàn)中tregitope共溫育將對(duì)單獨(dú)tshr肽的應(yīng)答抑制了35％至67％并將對(duì)tshr肽庫(kù)的應(yīng)答抑制了65％。顯示成對(duì)比較的p值。
圖7為顯示與以下：?jiǎn)为?dú)的cef、cef+tregitope-289、cef+tregitope294、cef+tregitope-029、cef+tregitope-074或cef+tregitope-009之一溫育八天后三個(gè)受試者對(duì)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的陽(yáng)性對(duì)照肽(cef)庫(kù)的平均應(yīng)答的柱形圖。對(duì)cef的應(yīng)答被抑制了29％至48％，取決于所使用的單個(gè)tregitope。對(duì)cef(在之前與單獨(dú)的cef溫育的樣品中)的基線應(yīng)答高于背景范圍為1404至10139ifn-γsfc/百萬(wàn)pbmc(背景為無(wú)刺激物)。顯示成對(duì)比較的p值。
圖8為顯示與tregitope共溫育抑制對(duì)衍生自肉毒桿菌神經(jīng)毒素肽表位的免疫應(yīng)答的柱形圖。取有證據(jù)證明存在抗-bont/a抗體的受試者的外周血。pbmc首先與單獨(dú)的bont/a肽庫(kù)或bont/a肽庫(kù)+tregitopes(tregitope-134、tregitope-167和tregitope-289)庫(kù)溫育八天。接著收集細(xì)胞、洗滌并接著與一式三份的單個(gè)bont/a肽或一式三份的bont/a肽庫(kù)溫育(在ifn-γelispot板中)。相對(duì)于未用抗原的再刺激顯示應(yīng)答。黑色柱形對(duì)應(yīng)于與單獨(dú)抗原的溫育，灰色柱形對(duì)應(yīng)于與抗原+tregitopes庫(kù)的溫育。對(duì)bont/a的應(yīng)答被抑制了26％至73％；對(duì)bont/a肽庫(kù)的應(yīng)答被抑制了59％。顯示成對(duì)比較的p值。
圖9為顯示tregitope-289和tregitope-134響應(yīng)體外聯(lián)合給藥免疫顯性抗原下調(diào)增殖的一系列圖形。pmbc分離自血庫(kù)供體并用單獨(dú)的cef、cef+tregitope-134或cef+tregitope-289刺激八天。與兩種tregitopes之一共溫育導(dǎo)致對(duì)cef的應(yīng)答降低(如ifn-γelisa測(cè)定(左圖))和增殖降低(如cfse熒光測(cè)定(右圖))(灰色陰影指抗原-tregitope共溫育抑制的應(yīng)答；黑色指與單獨(dú)的抗原溫育后的基線應(yīng)答)。
圖10為顯示對(duì)牛痘苗肽應(yīng)答的曲線圖。pmbc分離自血庫(kù)供體并用單獨(dú)的cef、cef+tregitope-134或cef+tregitope-289刺激八天。與兩種tregitopes之一共溫育導(dǎo)致對(duì)cef的應(yīng)答降低(如ifn-γelisa測(cè)定(左圖))和增殖降低(如cfse熒光測(cè)定(右圖))?；疑幱爸缚乖?tregitope共溫育抑制的應(yīng)答；黑色指與單獨(dú)的抗原溫育后的基線應(yīng)答。
圖11為顯示tregitope抑制由具有調(diào)節(jié)性表型的細(xì)胞介導(dǎo)的一系列圖形。tregitope抑制依賴于cd4+cd25hit細(xì)胞。左圖：用抗-cd4和抗-cd25抗體染色來(lái)自過(guò)敏個(gè)體的pbmc并用流式細(xì)胞儀分析。從剩余的pbmc中排除cd4+cd25hi亞群(框(gate))。中圖：用含有或不含tregitope-289的hdm裂解物協(xié)同刺激排除和未排除cd4+cd25hi的pbmc。排除cd4+cd25hi的pbmc對(duì)ifn-γ的抑制低于未排除pbmc。右圖：hdm裂解物和tregitope-289共溫育導(dǎo)致響應(yīng)hdm裂解物刺激的cd4+細(xì)胞增殖降低。
圖12為顯示與il-10分泌相關(guān)的treg(cd4/cd25hi)擴(kuò)增的曲線圖和圖形。與tregitope-289和hdm共溫育后cd4/cd25hit細(xì)胞的擴(kuò)增；和用單獨(dú)hdm再刺激后共溫育細(xì)胞分泌的il-10的量。用tregitope-167共溫育的結(jié)果相似：cd4/cd25hi細(xì)胞從1.67％增加至7.5％以及il-10分泌增加五倍。
圖13為顯示tregitope共溫育引起抗原特異性變應(yīng)性th2應(yīng)答抑制的一系列圖形和曲線。與tregitope和betv1141-155變應(yīng)原共培養(yǎng)導(dǎo)致從th2效應(yīng)細(xì)胞至th1/treg的轉(zhuǎn)變。用含有或不含tregitope-167的betv1141-155肽協(xié)同刺激來(lái)自三名對(duì)白樺樹(shù)花粉過(guò)敏的受試者的pbmc。十天的tregitope協(xié)同刺激引起betv1144-155四聚體陽(yáng)性cd4+細(xì)胞產(chǎn)生的il-5分泌的降低(左下圖)和th2-相關(guān)表面標(biāo)記(上圖)的降低。延時(shí)培養(yǎng)(30天，右下圖)引起betv1144-155-特異細(xì)胞中從th2(il-5)至th1(ifn-γ)的顯著轉(zhuǎn)變。
圖14為顯示tregitope聯(lián)合給藥引起對(duì)體內(nèi)聯(lián)合給予的蛋白質(zhì)藥物的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答(effectorresponse)抑制的圖形。單獨(dú)antigen-xx(見(jiàn)實(shí)施例5a)免疫(黑色柱形)激起il-4(左邊成對(duì)的柱形，左軸)和抗-antigen-xx抗體滴度(右邊成對(duì)的柱形，右軸)二者的強(qiáng)烈應(yīng)答。當(dāng)聯(lián)合給予antigen-xx與tregitope-167和tregitope-106的鼠同源物時(shí)這些應(yīng)答均減半(灰色柱形)。在假免疫的動(dòng)物中對(duì)antigen-xx的應(yīng)答如預(yù)期為陰性?？贵w的應(yīng)答(右邊成對(duì)的柱形)和il-4elispot(左邊成對(duì)的柱形)相關(guān)聯(lián)。
圖15的圖形顯示了對(duì)屋塵螨裂解物(hdml)和塵螨抗原的il-4和抗體應(yīng)答。hdml免疫(黑色柱形)激起il-4(左邊成對(duì)的柱形，左軸)和抗hdm抗原抗體滴度(右邊成對(duì)的柱形，右軸)二者的強(qiáng)烈應(yīng)答。當(dāng)聯(lián)合給予hdml與tregitope-289的鼠同源物時(shí)這些應(yīng)答均減半。在假免疫動(dòng)物中對(duì)hdml的應(yīng)答如預(yù)期為陰性?？贵w的應(yīng)答(右邊成對(duì)的柱形)和il-4elispot(左邊成對(duì)的柱形)相關(guān)聯(lián)。這些圖形顯示dm未免疫小鼠中38％的體內(nèi)抑制和預(yù)致敏小鼠中為84％。參見(jiàn)實(shí)施例5b。
圖16為顯示tregitope聯(lián)合給予對(duì)免疫原性肽藥物(“ipt”)的t效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答體內(nèi)抑制的柱形圖。每日三次皮下給予hladr4tg小鼠單獨(dú)ipt或ipt+鼠fc或ipt+tregitope-289(鼠同源物)。最后一次劑量后一周，處死小鼠并在48hril-4elispot測(cè)定中用免疫原性肽藥物刺激脾細(xì)胞。聯(lián)合給予免疫原性蛋白質(zhì)藥物和fc或tregitope-289導(dǎo)致il-4斑點(diǎn)形成細(xì)胞的顯著減少。參見(jiàn)實(shí)施例5c。
發(fā)明詳述
綜述
當(dāng)可溶性蛋白質(zhì)抗原被抗原遞呈細(xì)胞(apcs)攝取并經(jīng)ii類抗原遞呈途徑加工時(shí)適應(yīng)性免疫級(jí)聯(lián)開(kāi)始。ii類遞呈途徑中的蛋白質(zhì)抗原被存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的各種蛋白酶降解。一些形成的蛋白質(zhì)片段與mhcii類分子結(jié)合。荷載肽的mhc分子被運(yùn)輸至細(xì)胞表面，在那里被cd4+t細(xì)胞識(shí)別。可結(jié)合至mhc分子并介導(dǎo)apc和循環(huán)t細(xì)胞之間細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的肽片段被稱作t細(xì)胞表位。cd4+t細(xì)胞對(duì)這些肽-mhc復(fù)合物的識(shí)別根據(jù)應(yīng)答t細(xì)胞的表型和局部的細(xì)胞因子/趨化因子環(huán)境可引起免疫活化或免疫抑制應(yīng)答。一般而言，mhc/肽復(fù)合物和t效應(yīng)細(xì)胞的t細(xì)胞受體(tcr)之間的黏附導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子例如il-4和ifn-y的活化和分泌。另一方面天然t調(diào)節(jié)性細(xì)胞(treg)的活化導(dǎo)致免疫抑制細(xì)胞因子中il-10和tgf-β的表達(dá)(shevach，e.，nat.rev.immunol.，2：389-400，2002)。這些細(xì)胞因子直接作用于附近的效應(yīng)t細(xì)胞在一些情況下引起無(wú)反應(yīng)性或凋亡。在其他情況下調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子將效應(yīng)t細(xì)胞轉(zhuǎn)換成t調(diào)節(jié)性表型；這一過(guò)程在本文中稱作“誘導(dǎo)性”或“適應(yīng)性”耐受?？山Y(jié)合至mhc分子并黏附和活化循環(huán)treg的t細(xì)胞表位稱作tregitopes。
最早的自我/非我辨別發(fā)生在新生兒發(fā)育過(guò)程中的胸腺，其髓質(zhì)上皮細(xì)胞表達(dá)對(duì)未成熟t細(xì)胞的特異自身蛋白表位。以高親和性識(shí)別自身抗原的t細(xì)胞被清除但是具有中等親和性的自身反應(yīng)性t細(xì)胞可免于被清除并且可轉(zhuǎn)化成所謂的“天然”調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)。這些天然treg細(xì)胞被運(yùn)輸至外周并提供對(duì)自身免疫的長(zhǎng)久抑制。天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)和自身耐受的重要組分。
自身耐受由t細(xì)胞、b細(xì)胞、細(xì)胞因子和表面受體之間的復(fù)雜相互作用調(diào)節(jié)。t調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答平衡對(duì)蛋白質(zhì)抗原(不論自身的或外源的)的t效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過(guò)增加自身反應(yīng)性t效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量功能或通過(guò)減少t調(diào)節(jié)性細(xì)胞的數(shù)量或功能使該平衡向自身反應(yīng)性一邊的傾斜表現(xiàn)為自身免疫。
第二種形式的耐受發(fā)生在外周，其中成熟t細(xì)胞在il-10和tgf-β(通常由旁觀者t調(diào)節(jié)性細(xì)胞提供)存在下經(jīng)它們的t細(xì)胞受體活化轉(zhuǎn)化成“適應(yīng)性”treg表型。這些適應(yīng)性treg細(xì)胞的可能作用包括成功清除入侵病原體后緩沖免疫應(yīng)答作為控制變態(tài)反應(yīng)或低水平慢性感染可能引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)的手段，或可能輔助有益的共生細(xì)菌和病毒的共存。“適應(yīng)性”treg也可在控制經(jīng)歷了體細(xì)胞超突變的人抗體的生存周期中發(fā)揮作用。
據(jù)信免疫球蛋白的恒定區(qū)包含數(shù)種重要的tregitopes，其主要功能是抑制對(duì)超突變cdrs的免疫應(yīng)答。由于循環(huán)igg的高容量，可能也存在對(duì)應(yīng)于包含于igg的tregitopes的高容量t調(diào)節(jié)性細(xì)胞。這一推斷的部分證據(jù)認(rèn)為包括免疫球蛋白fc部分的嵌合蛋白賦予嵌合蛋白若干期望性質(zhì)，包括穩(wěn)定性增強(qiáng)、血漿半衰期增加、與fc受體結(jié)合以及免疫原性降低(lei，t.等，cell.immunol.，235：12-20，2005，baxevanis，c.etal.，eur.j.immunol.，16：1013-1016，1986)。
treg細(xì)胞也在b細(xì)胞耐受中發(fā)揮作用。b細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面表達(dá)單個(gè)低親和性fc受體fcyriib(ravetch，j.等，science，234：718-725，1986)。這一受體在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體酪氨酸基抑制基序序列(itim)。免疫復(fù)合物對(duì)fcyriib和bcr的共連接可觸發(fā)itim的酪氨酸磷酸化導(dǎo)致肌醇磷酸酶ship的募集，其可通過(guò)干擾map激酶的活化抑制bcr誘導(dǎo)的增殖并通過(guò)將burton酪氨酸激酶(btk)從細(xì)胞膜解離阻斷吞噬作用，其抑制進(jìn)入細(xì)胞的鈣內(nèi)流。fcyriib也可誘導(dǎo)不依賴itim的凋亡。在ics作用下fcriib同類聚集時(shí)btk與細(xì)胞膜的聯(lián)系被增強(qiáng)，觸發(fā)凋亡性應(yīng)答(pearse，r.等，immunity，10：753-760，1999)。fcyriib的表達(dá)高度可變并依賴于細(xì)胞因子。由活化的th2和treg細(xì)胞表達(dá)的il-4和il-10已顯示可協(xié)同增強(qiáng)fcyriib表達(dá)(joshi，t.等，mol.immunol.，43：839-850，2006)，因此有助于抑制體液應(yīng)答。
有可能利用tregitope特異性treg細(xì)胞抑制不想要的免疫應(yīng)答并誘導(dǎo)對(duì)共遞送蛋白質(zhì)的適應(yīng)性treg。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)設(shè)計(jì)治療方案和用于移植的抗原特異療法、蛋白質(zhì)藥物、變態(tài)反應(yīng)、慢性感染、自身免疫和疫苗設(shè)計(jì)具有意義。與tregitope一起給予藥物、蛋白質(zhì)或變應(yīng)原可抑制效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。tregitope可用于有意操縱免疫系統(tǒng)的耐受性。
本發(fā)明肽可用于調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的選擇性黏附和活化。本文例證了某些預(yù)存調(diào)節(jié)性t細(xì)胞群可被黏附、活化并用于抑制全身的和限制性的疾病特異性條件下的不想要的免疫應(yīng)答。
盡管付出了許多努力，除了少數(shù)例外，天然tregs并且更重要的在具有臨床意義的體積中循環(huán)的天然tregs的抗原特異性仍是未知。本文例證了一些在血液中循環(huán)的人類蛋白，例如免疫球蛋白或血清白蛋白，包含與t調(diào)節(jié)性細(xì)胞的天然種群相關(guān)的t細(xì)胞表位。在正常的免疫監(jiān)督過(guò)程中這些蛋白質(zhì)被專職apc例如樹(shù)突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞攝取并降解。在降解過(guò)程中一些包含于這些蛋白質(zhì)的表位與mhv分子結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面遞呈給調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。這些細(xì)胞一旦被apc活化即釋放細(xì)胞因子和趨化因子幫助抑制自身免疫應(yīng)答，否則自身免疫應(yīng)答會(huì)阻礙胞外蛋白質(zhì)功能。
通過(guò)使用本發(fā)明肽選擇性活化這些預(yù)存調(diào)節(jié)性t細(xì)胞，本文顯示本發(fā)明肽可用于抑制各種不想要的免疫應(yīng)答。在最簡(jiǎn)單的形式中，本發(fā)明肽的全身應(yīng)用可用作全身免疫抑制劑，其可用于控制嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)例如多發(fā)性硬化癥急性發(fā)作、變態(tài)反應(yīng)、移植反應(yīng)或?qū)Ω腥镜牟豢煽貞?yīng)答。在更加受控的應(yīng)用中，例如局部應(yīng)用至受風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)影響的關(guān)節(jié)，本發(fā)明肽可用于抑制局部自身免疫應(yīng)答。在靶向應(yīng)用中，例如可通過(guò)該肽與一些其他t細(xì)胞表位的融合或結(jié)合所達(dá)到的，這些肽可抑制高特異性免疫反應(yīng)并使免疫系統(tǒng)的平衡保持完整。舉例而言，通過(guò)給予和自身免疫抗原例如胰島素或變應(yīng)原例如brazilnut抗原融合的調(diào)節(jié)性肽，免疫系統(tǒng)可經(jīng)訓(xùn)練通過(guò)將應(yīng)答效應(yīng)t細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換至適應(yīng)性調(diào)節(jié)t細(xì)胞的表型而“耐受”共遞送的抗原。
如上所述，本發(fā)明肽衍生自循環(huán)胞外蛋白。為了具有可用性這些肽必須是真正的t細(xì)胞表位(即可與mhc分子和tcrs二者結(jié)合)并與足夠大以具有治療作用的預(yù)存調(diào)節(jié)性t細(xì)胞群相關(guān)。t細(xì)胞表位簇，可結(jié)合至多個(gè)mhc等位基因和多個(gè)tcrs的表位，是滿足后一資格的關(guān)鍵。
定義
為了進(jìn)一步輔助對(duì)本發(fā)明的理解，在下文中定義多個(gè)術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”指生物體的組織、細(xì)胞或分泌物的任何樣品。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“移植”指從一個(gè)受試者取出細(xì)胞、組織或器官，稱作“移植體”或“移植物”并將它們置于(通常)不同的受試者中。提供移植物的受試者稱作“供體”，接受該移植物的受試者稱作“受體”。在兩個(gè)相同種但基因不同的受試者之間移植的器官或移植物稱作“同種異體移植物”。在不同種受試者之間移植的移植物稱作“異種移植物”。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“醫(yī)學(xué)病癥”包括但不限于表現(xiàn)為一種或多種身體和/或心理癥狀(需要對(duì)其進(jìn)行治療和/或預(yù)防)的任何病癥或疾病，并包括之前和新鑒定的疾病和其他病癥。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指淋巴細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的協(xié)同作用，其可選擇性損傷、破壞或從人體清除癌性細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞、惡性黑色素瘤、侵入病原體、病原體感染的細(xì)胞或組織或自身免疫或病理性炎癥的情況下的正常的人體細(xì)胞或組織。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)組合物的“有效量”為足以達(dá)到預(yù)期治療和/或預(yù)防作用的量，例如可引起被治療疾病相關(guān)癥狀的預(yù)防或減少的量。給予受試者的本發(fā)明組合物的量取決于疾病的類型和嚴(yán)重性以及個(gè)體的特征，例如總體健康、年齡、性別、體重和對(duì)藥物的耐受。也取決于疾病的程度、嚴(yán)重性和類型。技術(shù)人員可根據(jù)這些和其他因素確定適當(dāng)?shù)膭┝?。本發(fā)明組合物也可相互之間或與一種或多種其他治療性化合物聯(lián)合給藥。
如本文所使用術(shù)語(yǔ)“t細(xì)胞表位”指蛋白決定簇，長(zhǎng)度為7至30個(gè)氨基酸并可特異結(jié)合hla分子并與特異tcrs相互作用。一般而言，t細(xì)胞表位是線性的并且不表達(dá)特異的三維特征。t細(xì)胞表位不受變性溶劑的影響。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“b細(xì)胞表位”指可特異結(jié)合抗體的蛋白決定簇。表位通常由分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成并通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異的電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別為在變性溶劑存在下喪失與前者而不是與后者的結(jié)合。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“受試者”指可在其中引起免疫應(yīng)答的任何活的生物體。術(shù)語(yǔ)受試者包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類例如猩猩和其他猿猴和猴子種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物例如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒類例如小鼠、大鼠和豚鼠。該術(shù)語(yǔ)不表示具體的年齡或性別。因此成年或新生兒受試者以及胎兒不論雄性或雌性均被涵蓋。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)mhc復(fù)合物指可與被稱作hla配體的特異性全部多肽(repertoire)結(jié)合并將所述配體運(yùn)輸至細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“mhc配體”指可結(jié)合一個(gè)或多個(gè)特異mhc等位基因的多肽。術(shù)語(yǔ)“hla配體”可與術(shù)語(yǔ)mhc配體互換。在其表面表達(dá)mhc/配體復(fù)合物的細(xì)胞被稱作“抗原遞呈細(xì)胞”(apcs)。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)t細(xì)胞受體或tcr指由可與遞呈于apcs表面的特異的全部mhc/配體復(fù)合物黏附的t細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“t細(xì)胞表位”指可與特異t細(xì)胞受體(tcrs)相互作用的mhc配體。可通過(guò)計(jì)算機(jī)(insilico)法(degroot，a.等，aidsres.hum.retroviruses，13：539-541，1997；schafer，j.等，vaccine，16：1880-1884，1998；degroot，a.等，vaccine，19：4385-95，2001；degroot，a.等，vaccine，21：4486-504，2003)預(yù)測(cè)t細(xì)胞表位。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“mhc結(jié)合基序”指預(yù)測(cè)可與具體mhc等位基因結(jié)合的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸模式。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“t細(xì)胞表位簇”指包含約4個(gè)至約40個(gè)mhc結(jié)合基序的多肽。在具體的實(shí)施方案中，t細(xì)胞表位簇包含約5個(gè)至約35個(gè)mhc結(jié)合基序，約8個(gè)至約30個(gè)mhc結(jié)合基序；以及約10個(gè)至約20個(gè)mhc結(jié)合基序。
如本文所使用術(shù)語(yǔ)“epibar”指經(jīng)預(yù)測(cè)與至少四種不同hla等位基因具有反應(yīng)性的單個(gè)9-mer框架。包含epibars的已知免疫原的序列包括流感病毒血凝素307-319、破傷風(fēng)毒素825-850和gad65557-567。包含epibar的免疫原性肽的實(shí)例顯示于下文。
實(shí)例epibar
登錄號(hào)：流感-序列：ha306-318
進(jìn)行的評(píng)價(jià)：40與期望值的偏差：17.62
z評(píng)分表示9-mer框架與給定hla等位基因結(jié)合的可能性；評(píng)分的強(qiáng)度由如下所示的藍(lán)色陰影表示：
前5％中的所有評(píng)分被認(rèn)為“命中”。方便起見(jiàn)遮蔽10％以下的無(wú)命中＊
表1.epibar實(shí)例：混合性流感表位的epibar分析。考慮流感ha肽，一個(gè)已知具有混合免疫原性的表位。其對(duì)于epimatrix中的所有八個(gè)等位基因的評(píng)分都非常高。其集簇評(píng)分為18。集簇評(píng)分大于10被認(rèn)為具有意義。帶狀epibar模式是混合性表位的特點(diǎn)。顯示了pryvkqntl(seqidno：59)、ryvkqntlk(seqidno：60)、yvkqntlkl(seqidno：61)、vkqntlkla(seqidno：62)和kqntlklat(seqidno：63)的結(jié)果。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“免疫突觸”指給定t細(xì)胞表位與細(xì)胞表面mhc復(fù)合物和tcr二者同時(shí)粘附形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)性t細(xì)胞”指以某些細(xì)胞表面標(biāo)記包括但不限于cd4、cd25、和foxp3的存在為特征的天然t細(xì)胞亞群?；罨瘯r(shí)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞分泌免疫抑制細(xì)胞因子和趨化因子包括但不限于il-10、tgf-β和tnf-α。
術(shù)語(yǔ)“多肽”指氨基酸聚合物并不限定具體長(zhǎng)度；因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)均包含在多肽的定義中。如本文所使用，當(dāng)多肽從重組和非重組細(xì)胞中分離而基本不含細(xì)胞物質(zhì)時(shí)或當(dāng)其為化學(xué)合成而基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)時(shí)多肽被稱作是“分離的”或“純化的”。然而，多肽可與另一種在細(xì)胞中通常與其不相關(guān)的多肽結(jié)合而仍然是“分離的”或“純化的”。當(dāng)重組生產(chǎn)多肽時(shí)，它也可基本不含培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)基相當(dāng)于多肽制劑體積的小于約20％、小于約10％或小于約5％。
變異體多肽的氨基酸差異可為一個(gè)或多個(gè)替換、缺失、插入、倒位、融合和截短或這些的任意組合。
本發(fā)明也包括本發(fā)明多肽的多肽片段。本發(fā)明也涵蓋本文所述多肽變異體的片段。本發(fā)明也提供嵌合或融合多肽。這些包括與具有與該多肽不實(shí)質(zhì)同源的氨基酸序列的異源蛋白或多肽可操作地連接的本發(fā)明多肽?！翱刹僮鞯剡B接”表示該多肽和異源蛋白質(zhì)為框架內(nèi)融合。
分離的多肽可純化自天然表達(dá)該多肽的細(xì)胞，純化自經(jīng)改變可表達(dá)該多肽(重組)的細(xì)胞，或使用已知的蛋白質(zhì)合成方法合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)重組dna技術(shù)生產(chǎn)多肽。舉例而言，將編碼該多肽的核酸分子克隆至表達(dá)載體，將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該多肽表達(dá)于該宿主細(xì)胞中。接著可通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓桨甘褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從細(xì)胞中分離該多肽。
對(duì)于本發(fā)明目的，多肽可包括例如天然氨基酸經(jīng)修飾的形式例如d-立體異構(gòu)體、非天然氨基酸；氨基酸類似物以及模擬體。
盡管與本文所述相似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)從描述和權(quán)利要求中顯而易見(jiàn)。在說(shuō)明書(shū)和附加權(quán)利要求中，單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指代物除非文章另外指明。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解的相同含義。本文引用的所有參考文獻(xiàn)均以其完整內(nèi)容并于本文作為參考并用于所有目的，其引用程度如同明確并獨(dú)立指明各單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)以其完整內(nèi)容并于本文作為參考用于所有目的。
組合物
一方面本發(fā)明提供新穎種類的t細(xì)胞表位組合物，稱作“tregitopes”，其包括具有一個(gè)或多個(gè)下文所列特性的肽或多肽。即本發(fā)明tregitopes包括但不限于具有一個(gè)或多個(gè)下列特性：
(1)本發(fā)明tregitopes衍生自普通的人蛋白。
(2)本發(fā)明tregitopes在他們來(lái)源蛋白的已知變異體中高度保守(例如，存在于多于50％的已知變異體中)。
(3)本發(fā)明tregitopes包括至少一個(gè)經(jīng)epimatrix分析鑒定的推定t細(xì)胞表位。epimatrix是epivax開(kāi)發(fā)的專有計(jì)算機(jī)算法，其可用于篩選蛋白質(zhì)序列以確定是否存在推定的t細(xì)胞表位。輸入序列被解析成重疊的9-mer框架，其中各框架與上一個(gè)重疊8個(gè)氨基酸。就與一組八個(gè)普通ii類hla等位基因(drb1*0101、drb1*0301、drb1*0401、drb1*0701、drb1*0801、drb1*1101、drb1*1301和drb1*1501)的預(yù)測(cè)結(jié)合親和力給各所得框架評(píng)分。根據(jù)隨機(jī)生成肽的較大樣本的分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化初始分?jǐn)?shù)。報(bào)告所得“z”分?jǐn)?shù)。任何等位基因特異性epimatrixz-分?jǐn)?shù)超過(guò)1.64的任何9-mer肽，理論上為任何給定樣品的前5％，被認(rèn)為是推定的t細(xì)胞表位。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明tregitopes包含若干推定t細(xì)胞表位，形成已知為t細(xì)胞表位簇的模式。推定的t細(xì)胞表位并不是隨機(jī)分布在整個(gè)蛋白質(zhì)序列中，而是“集簇”在特定區(qū)域中。此外，包含推定t細(xì)胞表位簇的肽在體外和體內(nèi)的驗(yàn)證檢測(cè)中更可能檢測(cè)為陽(yáng)性。從初始epimatrix分析的結(jié)果使用第二種稱作clustimer的專有算法篩選推定t細(xì)胞表位“集簇”的存在。clustimer算法可鑒定包含于任何包含統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著高數(shù)量的推定t細(xì)胞表位的氨基酸序列中的亞區(qū)。典型的t-細(xì)胞表位“集簇”的長(zhǎng)度約9至約30個(gè)氨基酸，考慮到它們與多個(gè)等位基因的親和力以及跨越多個(gè)9-mer框架，其可在任何位置包含約4至約40個(gè)推定t細(xì)胞表位。對(duì)于各鑒定的表位簇，通過(guò)總和推定t細(xì)胞表位分?jǐn)?shù)并減去基于候選表位簇長(zhǎng)度的矯正因子和隨機(jī)生成的相同長(zhǎng)度集簇的預(yù)期分?jǐn)?shù)計(jì)算聚集epimatrix分?jǐn)?shù)。大于+10的epimatrix集簇評(píng)分被認(rèn)為是顯著性的。
許多最具有反應(yīng)性的t細(xì)胞表位簇包含被稱作“epibar”的特征。epibar為預(yù)期與至少四個(gè)不同hla等位基因具有反應(yīng)性的單個(gè)9-mer框架。包含epibar的序列包括流感血凝素307-319(集簇評(píng)分18)、破傷風(fēng)毒素825-850(集簇評(píng)分16)和gad65557-567(集簇評(píng)分19)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明肽可包括一個(gè)或多個(gè)epibar。
(4)本發(fā)明tregitopes可以至少中等親和力(例如，在基于可溶hla分子的hla結(jié)合測(cè)定法中ic50＜200μm)結(jié)合至少一個(gè)并優(yōu)選兩個(gè)或更多普通hlaii類分子。
(5)本發(fā)明tregitopes可在至少一個(gè)并在優(yōu)選的實(shí)施方案中為兩個(gè)或多個(gè)hla等位基因的情況下被apcs遞呈至細(xì)胞表面。
(6)在這一情況下，tregitope-hla復(fù)合物可被具有特異于tregitope-hla復(fù)合物的tcrs并在正常對(duì)照受試者中循環(huán)的預(yù)存調(diào)節(jié)性t細(xì)胞群識(shí)別。tregitope-hla復(fù)合物的識(shí)別可引起匹配調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的活化并分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子。
(7)具有本發(fā)明tregitope的刺激調(diào)節(jié)性t細(xì)胞引起一種或多種以下細(xì)胞因子和趨化因子的分泌增加：l-10、tgf-β、tnf-α和mcp1。調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子分泌的增加是調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的標(biāo)志。
(8)被本發(fā)明tregitope活化的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表達(dá)cd4+cd25+foxp3表型。
(9)被tregitope活化的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞直接抑制離體t-效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，如通過(guò)抗原特異性th1-或th2-相關(guān)細(xì)胞因子(主要是inf-γ、il-4和il-5)水平降低以及通過(guò)抗原-特異性t效應(yīng)細(xì)胞增殖降低(如通過(guò)cfse稀釋測(cè)定)所測(cè)定。
(10)被tregitope活化的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞直接抑制體內(nèi)t-效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，如通過(guò)抗原特異性th1-或th2-相關(guān)細(xì)胞因子(如elisa測(cè)定法測(cè)定)水平降低、抗原-特異性t效應(yīng)細(xì)胞水平(如elispot測(cè)定法測(cè)定)降低和蛋白質(zhì)抗原的抗體滴度降低所測(cè)定。
(11)被本發(fā)明tregitopes活化的天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞刺激適應(yīng)性treg細(xì)胞的發(fā)育。將外周t細(xì)胞與本發(fā)明tregitopes在抗原存在下共溫育引起抗原特異性cd4+/cd25+t細(xì)胞的擴(kuò)增、上調(diào)這些細(xì)胞上foxp3+的表達(dá)并抑制抗原-特異性t效應(yīng)細(xì)胞的體外活化。
本發(fā)明tregitopes可用于調(diào)節(jié)對(duì)單克隆抗體、蛋白質(zhì)藥物、促進(jìn)自身免疫應(yīng)答的自身抗原、變應(yīng)原、移植組織的免疫應(yīng)答和其他應(yīng)用中，其中耐受為期望結(jié)果。本發(fā)明tregitopes的選擇性實(shí)施方案總結(jié)于實(shí)施例1的表2中。
在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明tregitopes為如表2所述分離的t細(xì)胞表位。表2的tregitopes(seqidnos：4至58)可結(jié)合mhcii類分子，在mhcii類分子情況下黏附tcr并活化天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。
本發(fā)明多肽可純化至均質(zhì)或部分純化。然而應(yīng)理解的是其中的多肽未純化至均質(zhì)的制劑也可用。關(guān)鍵特征為制劑可實(shí)現(xiàn)多肽的期望功能，甚至在大量其他組分存在的情況下。因此，本發(fā)明涵蓋各種等級(jí)的純度。在一個(gè)實(shí)施方案中，“基本不含細(xì)胞物質(zhì)”包括含有少于約30％(干重)其他蛋白質(zhì)(例如，污染蛋白)、少于約20％其他蛋白質(zhì)、少于約10％其他蛋白質(zhì)或少于約5％其他蛋白質(zhì)的多肽制劑。
當(dāng)重組生產(chǎn)一種多肽時(shí)，它也可以基本不含培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)基占多肽制劑體積的少于約20％、少于約10％或少于約5％?！盎静缓瘜W(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括分離自與其合成相關(guān)的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)的多肽制劑?！盎静缓瘜W(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”可包括例如含有少于約30％(干重)化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)、少于約20％化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)、少于約10％化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)或少于約5％化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)的多肽制劑。
如本文所使用，當(dāng)氨基酸序列至少約45-55％、通常至少約70-75％、更通常至少約80-85％并更通常大于約90％或更同源或相同時(shí)兩個(gè)多肽(或多肽的一個(gè)區(qū)域)為基本同源或相同。為了測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同源性或一致性百分比，將序列比對(duì)用于最佳比較目的(例如，可在一個(gè)多肽或核酸分子中引入空位用于和另一多肽或核酸分子的最佳比對(duì))。接著比較對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)一個(gè)序列上的一個(gè)位點(diǎn)被與另一序列上對(duì)應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么這些分子在這一位點(diǎn)是同源的。如本文所使用，氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“一致性”。兩個(gè)序列之間的同源性百分比是這些序列共有相同位點(diǎn)數(shù)量的函數(shù)(例如，同源性百分比等于相同位點(diǎn)數(shù)量/總位點(diǎn)數(shù)量×100)。
本發(fā)明也涵蓋具有較低程度一致性但具有足夠的相似性以執(zhí)行本發(fā)明核酸分子編碼的多肽所執(zhí)行的一種或多種相同功能的多肽。相似度由保守氨基酸替換測(cè)定。這些替換為用另一性質(zhì)相似的氨基酸替換多肽中的給定氨基酸。保守替換很可能是表型沉默的。通常被看做保守替換的為在脂肪族氨基酸ala、val、leu和ile中的相互替換；羥基殘基ser和thr互換，酸性殘基asp和glu交換，酰胺殘基asn和gln之間的替換，堿性殘基lys和arg之間的交換以及芳香殘基phe和tyr之間的替換。對(duì)于哪些氨基酸變化可能是表型沉默的指導(dǎo)參見(jiàn)例如bowie，j.等，science，247：1306-1310，1990。
變異體多肽的氨基酸差異可為一個(gè)或多個(gè)替換、缺失、插入、倒位、融合和截短或這些的任意組合。變異體多肽可具有完整的功能或缺少一個(gè)或多個(gè)活性的功能。具有完全功能的變異體通常僅包含保守變異或非關(guān)鍵殘基或非關(guān)鍵區(qū)域中的變異。功能性變異體也可包含相似氨基酸的替換，其不引起或引起不顯著的功能變化?；蛘撸@些替換可在一定程度上正向或反向影響功能。非功能性變異體通常包含一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸替換、缺失、插入、倒位或截短或關(guān)鍵殘基或關(guān)鍵區(qū)域的替換、插入、倒位或缺失。變異體多肽的若干實(shí)例包括于表2中。
本發(fā)明也包括本發(fā)明多肽的多肽片段。本發(fā)明也涵蓋本文所述多肽變異體的片段。如本文所使用，片段包括至少約5個(gè)連續(xù)的氨基酸?？捎闷伟ūＡ袅硕嚯牡囊环N或多種生物學(xué)活性的片段以及可用作免疫原生成多肽-特異性抗體的片段。生物學(xué)活性片段的長(zhǎng)度例如約6、9、12、15、16、20或30個(gè)氨基酸。片段可為離散的(不與其他氨基酸或多肽融合)或可在更大的多肽內(nèi)。數(shù)個(gè)片段可包括在單個(gè)較大的多肽內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中經(jīng)設(shè)計(jì)用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的片段可具有與多肽片段的氨基端融合的前多肽和多肽原(pre-andpro-polypeptide)區(qū)以及與片段羧基端融合的附加區(qū)域。
本發(fā)明也提供嵌合或融合多肽。這些包括與具有與該多肽不實(shí)質(zhì)同源的氨基酸序列的異源蛋白或多肽可操作地連接的本發(fā)明多肽?！翱刹僮鞯剡B接”表示該多肽和異源蛋白質(zhì)為框架內(nèi)融合。異源蛋白可與該多肽的n-端或c-端融合。在一個(gè)實(shí)施方案中融合多肽不影響該多肽自身的功能。舉例而言，融合多肽可為gst-融合多肽，其中該多肽序列與gst序列的c-端融合。融合多肽的其他類型包括但是不限于酶融合多肽例如β-半乳糖苷酶融合、酵母雙雜交gal融合、多聚-組氨酸融合和ig融合。這些融合多肽尤其是多聚-組氨酸融合或親和標(biāo)簽融合可輔助重組多肽的純化。在一些宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，可通過(guò)使用異源信號(hào)序列增加多肽的表達(dá)和/或分泌。因此，在另一實(shí)施方案中，融合多肽在其n-端包含異源信號(hào)序列。
可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)生產(chǎn)嵌合或融合多肽。舉例而言，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的dna片段在框架內(nèi)連接在一起。在另一實(shí)施方案中，可通過(guò)常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)化dna合成儀合成融合基因?；蛘?，可使用錨定引物進(jìn)行核酸片段的pcr擴(kuò)增，錨定引物可在兩個(gè)保守核酸片段之間生成互補(bǔ)的突出端，其隨后可復(fù)性并再次擴(kuò)增生成嵌合核酸序列(ausubel等.，currentprotocolsinmolecularbiology，1992)。此外，可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)許多已編碼融合部分(例如gst蛋白)的表達(dá)載體。編碼本發(fā)明多肽的核酸分子可克隆至表達(dá)載體中，這樣該融合部分與多肽框架內(nèi)相連。
分離的多肽可純化自天然表達(dá)該多肽的細(xì)胞，純化自經(jīng)改變可表達(dá)該多肽(重組)的細(xì)胞，或使用已知的蛋白質(zhì)合成方法合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)重組dna技術(shù)生產(chǎn)多肽。舉例而言，將編碼該多肽的核酸分子克隆至表達(dá)載體，將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該多肽表達(dá)于該宿主細(xì)胞中。接著可通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓桨甘褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從細(xì)胞中分離該多肽。
本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明完整或部分多肽的核酸。本發(fā)明核酸分子可插入載體中并用作例如表達(dá)載體或基因療法載體?？赏ㄟ^(guò)例如靜脈注射、局部給藥(美國(guó)專利號(hào)5328470)或通過(guò)立體定位注射(chen等，proc.natl.acad.sci.usa，91：3054-3057，1994)給予受試者基因療法載體?；虔煼ㄝd體的藥物制劑可包括可接受稀釋劑中的基因療法載體或可包括包埋了基因遞送載體的緩釋基質(zhì)?；蛘撸?dāng)可從重組細(xì)胞中生產(chǎn)完整的基因遞送載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，該藥物制劑可包括一個(gè)或多個(gè)生產(chǎn)該基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。藥物組合物可連同使用說(shuō)明包含在容器、包裝或給藥器中。
本發(fā)明tregitopes可包括等位或序列變異體(“突變體”)或其類似物，或可包括化學(xué)修飾(例如peg化、糖基化)。在一個(gè)例子中，突變體可提供與mhc分子更強(qiáng)的結(jié)合。在另一實(shí)例中，突變體可導(dǎo)致與tcrs更強(qiáng)的結(jié)合。在另一實(shí)例中，突變體可導(dǎo)致與mhc分子和/或tcrs結(jié)合的降低。也包括可以結(jié)合但是不允許經(jīng)tcrs的信號(hào)傳導(dǎo)的突變體。
本發(fā)明提供tregitope組合物，其為嵌合蛋白組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，tregitope組合物包括連接在一起的第一和第二多肽鏈，其中第一鏈包括序列編號(hào)4至58或其任意組合，并且所述第二鏈包括生物活性分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性分子選自：免疫原性分子、t細(xì)胞表位、病毒蛋白、細(xì)菌蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明tregitope組合物包括連接在一起的第一和第二多肽鏈，其中第一鏈包括fc區(qū)，其中289-309區(qū)的氨基酸已被改變從而不與mhcii類分子結(jié)合，并且所述第二鏈包括免疫原性分子。
一方面本發(fā)明提供生產(chǎn)識(shí)別至少一部分seqidnos：4-58的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞系的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)選自seqidnos：4-58的肽與適當(dāng)?shù)妮o料混合。這些組合物可用于預(yù)防或治療有需要的受試者中的炎癥，其中和適當(dāng)?shù)妮o料一起局部給予該混合物可減少受試者的炎癥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)選自seqidnos：4-58的肽與抗原或變應(yīng)原混合。這些組合物可用于在有需要的受試者中誘導(dǎo)對(duì)該抗原或變應(yīng)原的耐受的方法中，其中局部給予與抗原或變應(yīng)原的混合物可增強(qiáng)受試者對(duì)該抗原或變應(yīng)原的耐受，并且與適當(dāng)?shù)妮o料一起給予可誘導(dǎo)對(duì)該抗原或變應(yīng)原的耐受。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包括一個(gè)或多個(gè)選自seqidnos：4-58的tregitope多肽的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括編碼一個(gè)或多個(gè)選自seqidnos：4-58的tregitope多肽的核酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明載體的細(xì)胞。該細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
克隆tregitope特異t細(xì)胞
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行tregitope特異t細(xì)胞的克隆。舉例而言，用包含20％hsa的rpmi培養(yǎng)基中10μg/mltregitopes刺激分離的pbmcs。從第5天開(kāi)始每隔一天加入il-2(終濃度為10u/ml)。在第11或12天用四聚體庫(kù)染色t細(xì)胞。對(duì)于每一庫(kù)，將2-3×105個(gè)細(xì)胞與0.5mgpe-標(biāo)記的四聚體在50ml培養(yǎng)基(10mg/ml)中于37℃溫育1至2小時(shí)，然后用抗-cd4-fitc(bdpharmingen，sandiego，ca)于室溫下染色15分鐘。在bectondickinsonfacscalibur流式細(xì)胞儀(bectondickinson，sanjose，ca)上洗滌并分析細(xì)胞。產(chǎn)生載有對(duì)應(yīng)的單個(gè)肽的四聚體用于給出陽(yáng)性染色的庫(kù)，并在第14或15天進(jìn)行分析。對(duì)特定四聚體是陽(yáng)性的細(xì)胞為在同一天或第二天用bectondickinsonfacsvantage(sanjose，ca)分揀至96-孔u(yù)-形底培養(yǎng)板的單個(gè)細(xì)胞。用每孔1.5-3×105個(gè)不匹配的、經(jīng)輻射(5000rad)的pbmc作為飼養(yǎng)細(xì)胞并在24小時(shí)后加入2.5mg/mlpha和10u/mlil-2擴(kuò)增已分揀的細(xì)胞。通過(guò)用四聚體染色(載有同源肽或?qū)φ针?，ha307-319)和用10mg/ml特異肽進(jìn)行t細(xì)胞增殖測(cè)定(novak，e.等，j.immunol.，166：6665-6670，2001)驗(yàn)證已克隆t細(xì)胞的特異性。
tregitope組合物的應(yīng)用方法
一方面本發(fā)明提供使用tregitope用于設(shè)計(jì)小分子的方法。在本發(fā)明一個(gè)方法中，用小分子混合物庫(kù)以1μg/ml的濃度刺激tregitope特異t細(xì)胞三次并用自體樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)以兩周間隔刺激，接著用異源dc和抗原刺激。在圓底96-孔板的每孔中加入t細(xì)胞(1.25×105)和dc(0.25×105)。通過(guò)添加含有50mlfcs(hyclone)、青霉素和鏈霉素(gibco)的500mlrpmi培養(yǎng)基1640；20mmhepes(gibco)；和4ml1nnaoh溶液制備t細(xì)胞培養(yǎng)基。il-2濃度起始為0.1nm并在之后的幾輪刺激中逐漸增加至1nm。通過(guò)用0.6×105個(gè)epstein-barr病毒轉(zhuǎn)化的b細(xì)胞(100gray)和1.3×105個(gè)異源外周血單核細(xì)胞(33gray)作為飼養(yǎng)細(xì)胞以及包含2nmil-2培養(yǎng)基中的1μg/ml植物凝集素(difco)有限稀釋而衍生t細(xì)胞克隆。接著以單個(gè)分子檢測(cè)刺激tregitope特異t細(xì)胞的小分子庫(kù)。
一方面本發(fā)明提供使用tregitopes用于克隆t細(xì)胞受體的方法。用rneasyminikit(qiagene)從如上所述生成的tregitopes特異t細(xì)胞系中萃取總rna。通過(guò)cdna末端快速擴(kuò)增(race)法(generacerkit，invitrogen)將一毫克的總rna用于克隆tcrcdnas。在合成單鏈cdna之前，rna為脫磷酸化的、脫帽的并根據(jù)5′racegeneracerkit的使用說(shuō)明與rna寡聚核苷酸連接。用superscriptiirt和generaceroligo-dt逆轉(zhuǎn)錄rna寡聚核苷酸連接的mrna至單鏈cdnas。使用generacer5′(generacerkit)作為5′引物和基因-特異引物tcrcar(5′-gttaactagttcagctggaccacagccgcagc-3′；seqidno：64)或tcrcb1r(5′-cgggttaactagttcagaaatcctttctcttgaccatggc-3′；seqidno：65)，或tcrcbr2(5′-ctagcctctggaatcctttctcttg-3′；seqidno：66)分別作為tcrα、β1或β2鏈的3′引物進(jìn)行5′race。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)產(chǎn)物克隆至pcr2.1topo載體(invitrogen)并接著轉(zhuǎn)化至oneshottop10感受態(tài)大腸桿菌(invitrogen)。從tcrα、β1和β2鏈的各構(gòu)建體的96個(gè)單個(gè)克隆制備質(zhì)粒dnas。測(cè)序所有質(zhì)粒的全長(zhǎng)插入物以確定vα/vβ應(yīng)用(zhao，y.等，j.immunother.，29：398-406，2006)。
藥物制劑
本發(fā)明提供治療患有醫(yī)學(xué)病癥的受試者的方法，其包括與藥學(xué)可接受載體或輔料一起給予治療有效量的tregitope。本發(fā)明tregitope可并入適于給藥的藥物組合物中。該藥物組合物通常包括至少一種tregitope和適于給予受試者的形式的藥學(xué)可接受載體。藥學(xué)可接受載體部分取決于所給予的具體組合物以及用于給予該組合物的具體方法。因此，許多適當(dāng)?shù)乃幱媒M合物制劑可用于給予tregitope組合物(參見(jiàn)，例如remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，easton，pa第18版，1990)。藥用組合物通常配制成無(wú)菌的，基本等滲的并完全符合美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的所有優(yōu)良操作規(guī)范(gmp)章程。
當(dāng)指組合物、載體、稀釋劑和試劑時(shí)，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”、“生理耐受的”及其語(yǔ)法變體可互換使用并表示可給予受試者而不產(chǎn)生禁止給予該組合物程度的不良生理學(xué)作用的材料?！八帉W(xué)可接受的輔料”指例如可用于制備基本安全、無(wú)毒并有利的藥用組合物的輔料，并且包括可用于獸用和人用藥物用途的輔料。這些輔料可為固體、液體、半固體或如果是氣霧劑組合物時(shí)為氣體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定給予具體藥物和本發(fā)明組合物的適當(dāng)時(shí)間、順序和劑量。
這些載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂質(zhì)體和非水溶媒例如非揮發(fā)油。將這些介質(zhì)和化合物用于藥學(xué)活性物質(zhì)為本領(lǐng)域熟知。除非任何常規(guī)介質(zhì)或化合物均與tregitope不相容，可考慮其在組合物中的用途。也可將附加活性物質(zhì)并入該組合物中。
本發(fā)明組合物配制成與其預(yù)期給藥途徑相容。本發(fā)明tregitope組合物可經(jīng)腸胃外、局部、靜脈內(nèi)、口腔、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、直腸、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)；陰道；肌肉內(nèi)途徑或作為吸入劑給藥。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，直接將藥物注入沉積物可聚積的特定組織中，例如顱內(nèi)注射。肌肉內(nèi)注射或靜脈內(nèi)輸注為tregitope的優(yōu)選給藥方式。在一些方法中將本發(fā)明特定tregitope直接注入顱內(nèi)。在一些方法中本發(fā)明tregitope作為緩釋組合物或裝置例如medipadtm裝置給藥。
本發(fā)明tregitope可任選與至少部分有效地治療本文所述各種醫(yī)學(xué)病癥的其他藥劑聯(lián)合給藥。在給藥至受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，本發(fā)明tregitope也可與可增強(qiáng)本發(fā)明藥劑通過(guò)血腦屏障的其他藥劑聯(lián)合給藥。
用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液包括以下組分：無(wú)菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、非揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌化合物例如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物例如乙二胺四乙酸(edta)；緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)節(jié)張力的化合物例如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A調(diào)ph，例如鹽酸或氫氧化鈉。輔料的實(shí)例可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米粉、面粉、白堊、硅膠、水、乙醇、dmso、甘油、丙烯、脫脂奶粉等。該組合物也可包含ph緩沖劑和潤(rùn)濕或乳化劑。
腸胃外制劑可包含于玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量管形瓶中。
適用于注射的藥用組合物包括無(wú)菌水溶液(當(dāng)為水溶性時(shí))或分散劑和無(wú)菌粉末用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散體。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，適當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽水、抑菌水、cremophoreltm(basf，parsippany，n.j.)或磷酸鹽緩沖液(pbs)。在所有情況下，該組合物為無(wú)菌的并且流動(dòng)性應(yīng)達(dá)到通針性良好的程度。它在生產(chǎn)和保存條件下是穩(wěn)定的并經(jīng)防腐處理以避免微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。例如可通過(guò)使用包衣例如卵磷脂，通過(guò)在分散體中維持所要求的粒徑并通過(guò)使用表面活性劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。防止微生物的作用可通過(guò)許多抗菌和抗真菌化合物達(dá)成，例如尼泊金、三氯叔丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下優(yōu)選在組合物中包括等滲化合物例如糖類、多元醇類例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。可通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的化合物例如單硬脂酸鋁和明膠達(dá)到可注射組合物的長(zhǎng)效吸收。
可將適當(dāng)溶劑中的要求量的tregitope與一種或多種上文所列成分按需要合并，接著過(guò)濾除菌制備無(wú)菌注射液。通常將粘合劑并入包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和要求的上文所列其他成分的無(wú)菌溶媒中制備分散體。對(duì)于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末，制備方法為真空干燥和冷凍干燥，其可得到活性成分和之前無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何其他要求成分的粉末。本發(fā)明藥劑可以配制成允許活性成分緩釋或脈動(dòng)釋放方式的儲(chǔ)庫(kù)注射劑(depotinjection)或植入物制劑形式給藥。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可包被于明膠膠囊中或壓制成片。對(duì)于口服治療給藥目的，可將粘合劑與輔料合并并用于片劑、糖錠或膠囊形式中。也可使用用于漱口劑的流體載體制備口服組合物，其中將流體載體中的化合物應(yīng)用于口腔，漱口并吐出或吞咽。也可包括藥學(xué)相容性粘合化合物和/或輔料作為組合物的一部分。片劑、藥丸、膠囊、糖錠等可包含任何以下成分或具有相似性質(zhì)的化合物：粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；輔料例如淀粉或乳糖，崩解化合物例如褐藻酸、primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑例如膠體二氧化硅；甜味化合物例如蔗糖或糖精；或芳香化合物例如薄荷、水楊酸甲酯或柑桔香精。
對(duì)于吸入給藥，可從加壓容器或包含適當(dāng)拋射劑例如氣體如二氧化碳的給藥器或噴霧器以氣霧劑形式給予tregitope(s)。
全身給藥也可為經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式給藥，在制劑中使用適用于待滲透屏障的滲透劑。這些滲透劑通常為本領(lǐng)域已知并包括例如用于經(jīng)粘膜給藥的去污劑、膽鹽和夫西地酸衍生物?？赏ㄟ^(guò)使用鼻噴霧劑或栓劑完成經(jīng)粘膜給藥。對(duì)于經(jīng)皮給藥，將tregitope配制于軟膏、油膏、凝膠或乳膏中并應(yīng)用于局部或經(jīng)本領(lǐng)域一般熟知的經(jīng)皮貼劑技術(shù)應(yīng)用。
tregitope也可制備為用于直腸給藥的栓劑(例如用常規(guī)的栓劑基質(zhì)例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌腸劑形式的藥用組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用可防止tregitope被人體快速清除的載體制備tregitope，例如控釋制劑，包括植入物和微囊化給藥系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾?、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。制備這些制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。也可從alzacorporation和novapharmaceuticals，inc商業(yè)購(gòu)買(mǎi)這些材料。脂質(zhì)體混懸劑(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥物可接受載體。這些可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備(美國(guó)專利號(hào)4522811)。tregitopes或嵌合蛋白可植入生物聚合物固相載體或與其連接，其允許tregitopes或嵌合蛋白緩慢釋放至期望位點(diǎn)。
將口服或腸胃外組合物以劑量單位形式配制以便于給藥和計(jì)量均一性是尤其有利的。如本文所使用劑量單位形式指適用做被治療受試者單一劑量的物理不連續(xù)單位；各單位包含經(jīng)計(jì)算可與所要求藥物載體一起產(chǎn)生期望療效的預(yù)定量的粘合劑。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格取決并直接依賴于粘合劑的獨(dú)特特性和要達(dá)到的具體療效以及配制該tregitope用于治療受試者的技術(shù)固有的限制。
預(yù)防和治療醫(yī)學(xué)病癥的方法
本發(fā)明涉及例如治療一種或多種醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給予本發(fā)明tregitope或嵌合蛋白，藉此治療醫(yī)學(xué)病癥。醫(yī)學(xué)病癥可為例如原發(fā)性免疫缺陷；免疫介導(dǎo)的血小板減少癥、川崎病、20歲以上患者中的造血干細(xì)胞移植、慢性b-細(xì)胞淋巴細(xì)胞性白血病和兒童i型hiv感染。具體實(shí)例包括：(血液學(xué))再生障礙性貧血、單純紅細(xì)胞再生障礙、戴-布二氏貧血、自身免疫性溶血性貧血、新生兒溶血、獲得性因子viii抑制劑、獲得性馮·威利布蘭德病、免疫介導(dǎo)中性粒細(xì)胞減少癥、血小板輸注無(wú)效、新生兒同種免疫/自身免疫血小板減少癥、輸血后紫癜、血栓性血小板減少性紫癜/溶血尿毒綜合征；(感染性疾病)其中患有感染性疾病的是有害的病癥包括低出生體重(例如，＜1500g)、實(shí)體器官移植、手術(shù)、創(chuàng)傷、燒傷和hiv感染；(神經(jīng)學(xué))癲癇和兒童頑固性格林-巴利綜合征、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力、lambert-eaton肌無(wú)力綜合癥、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥；(產(chǎn)科學(xué))反復(fù)妊娠丟失；(肺病學(xué))哮喘、慢性胸癥狀(chronicchestsymptoms)；風(fēng)濕病學(xué)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(成人和青少年)、全身性紅斑狼瘡、全身血管炎、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、包涵體肌炎、韋格納肉芽腫??；(混合性)腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、白塞綜合征、急性心肌病、慢性疲乏綜合征、阻塞型心臟傳導(dǎo)阻滯、囊性纖維病、自身免疫膿皰性皮病、糖尿病、急性特發(fā)性家族性自主神經(jīng)機(jī)能異常、急性播散性腦脊髓炎、內(nèi)毒素血癥、溶血性輸血反應(yīng)、噬血細(xì)胞綜合征、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、下位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、人t細(xì)胞淋巴營(yíng)養(yǎng)性病毒-1-相關(guān)脊髓病、腎炎綜合征、膜性腎病、腎病綜合征、甲狀腺功能正常型眼病、眼陣攣-肌陣攣、復(fù)發(fā)性中耳炎、副腫瘤性小腦變性、副蛋白血癥性神經(jīng)病、細(xì)小病毒感染(全身)、多發(fā)性神經(jīng)病，器官巨大癥，內(nèi)分泌病，m-蛋白質(zhì)和皮膚改變(poems)綜合癥、進(jìn)行性腰骶神經(jīng)叢病、lyme神經(jīng)根神經(jīng)炎、rasmussen綜合癥、萊特爾綜合征、急性腎功能衰竭、血小板減少癥(非免疫的)、鏈球菌中毒性休克綜合征、眼色素層炎和伏格特-小柳-原田三氏綜合征。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及例如治療變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、移植相關(guān)疾病例如移植物抗宿主病、酶或蛋白質(zhì)缺乏癥、凝血障礙、癌癥、不育或感染(病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng))的方法。本發(fā)明tregitopes或嵌合蛋白可與其他用于治療患有醫(yī)學(xué)病癥的受試者的蛋白質(zhì)化合物聯(lián)合使用以減少不良事件或增加聯(lián)合給予化合物的藥效。
應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)。變應(yīng)原-特異性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞在控制變態(tài)反應(yīng)和哮喘的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。天然cd4/cd25調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和第二tregs(抗原特異性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞)，二者均表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子foxp3，已顯示可抑制變應(yīng)性疾病中的不適當(dāng)免疫應(yīng)答。一些近期的研究表明調(diào)節(jié)性t細(xì)胞在控制易感個(gè)體(不僅是動(dòng)物模型而且在人體中)中t-輔助細(xì)胞2型為主的免疫應(yīng)答的過(guò)度發(fā)展。近期研究表明t調(diào)節(jié)性細(xì)胞也通過(guò)分泌tgf-β和il-10抑制t細(xì)胞協(xié)同刺激，表明t調(diào)節(jié)性細(xì)胞在調(diào)節(jié)變應(yīng)性疾病中的重要作用。天然或適應(yīng)性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞擴(kuò)增受損可導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)變應(yīng)原-特異性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的治療可提供變態(tài)反應(yīng)和哮喘的治愈性治療。
用于預(yù)防和治療哮喘的一種策略為誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)免疫刺激引起th1或tr應(yīng)答防止動(dòng)物產(chǎn)生哮喘。
應(yīng)用于移植。本發(fā)明tregitopes可用于誘導(dǎo)移植過(guò)程中的耐受，其方式為促進(jìn)特異下調(diào)對(duì)供體細(xì)胞免疫應(yīng)答的細(xì)胞的發(fā)育。誘導(dǎo)抗原-特異性treg細(xì)胞用于治療器官特異性自身免疫是重要的治療學(xué)發(fā)展，避免了全身免疫抑制。在骨髓移植的鼠類模型中，tregs促進(jìn)供體骨髓移植物并降低移植物抗宿主病的發(fā)病率和嚴(yán)重性而不取消有益的移植物抗腫瘤免疫作用。這些發(fā)現(xiàn)，與小鼠和人類中的tregs共享表型和功能特性的觀察一致，已引起對(duì)使用這些細(xì)胞減少與人造血細(xì)胞移植相關(guān)并發(fā)癥的積極研究。tregs和效應(yīng)t細(xì)胞的失調(diào)促進(jìn)移植物抗宿主病的發(fā)展。然而，免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，尤其是tregs的同種識(shí)別性質(zhì)，它們對(duì)其他免疫細(xì)胞的作用和相互作用以及它們抑制活性的位點(diǎn)還是未知。
來(lái)自人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的累積證據(jù)已表明tregs參與移植物抗宿主病(gvhd)的發(fā)展。tregs可將gvhd從移植物抗腫瘤(gvt)活性分離的例證表明可操控它們的免疫抑制潛能以減少gvhd而對(duì)gvt作用無(wú)有害影響。盡管已報(bào)導(dǎo)了多種具有免疫抑制能力的t淋巴細(xì)胞，但是兩個(gè)研究最充分的亞群為天然存在的、胸腺內(nèi)生成的tregs(天然tregs)和外周生成的可誘導(dǎo)tregs(可誘導(dǎo)tregs)。
應(yīng)用于自身免疫。tregitopes可用作免疫原性化合物(蛋白質(zhì)藥物)的耐受劑。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)藥物的設(shè)計(jì)具有意義。因此，與tregitopes聯(lián)合給予單克隆抗體、自體細(xì)胞因子或外源蛋白可抑制不良t效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。在體內(nèi)，tregs通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞限制自身反應(yīng)性t細(xì)胞活化，因此防止它們分化和獲得效應(yīng)細(xì)胞功能。通過(guò)限制提供活化的致病細(xì)胞，tregs防止或減緩自身免疫疾病的進(jìn)展。然而這一保護(hù)性機(jī)制對(duì)自身免疫個(gè)體而言是不足的，很可能因?yàn)槿鄙賢regs細(xì)胞和/或tregs-抗性致病t細(xì)胞在長(zhǎng)期疾病進(jìn)程中的發(fā)展和積累。因此，這些患者中自身耐受的恢復(fù)需要清除致病t細(xì)胞并同時(shí)輸注控制現(xiàn)行組織損傷能力增強(qiáng)的tregs。器官特異性自身免疫疾病例如甲狀腺炎和胰島素依賴型糖尿病已歸因于這一耐受機(jī)制的瓦解。
應(yīng)用于糖尿病。i型(少年)糖尿病為器官特異性自身免疫疾病，由產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞破壞引起。在非糖尿病患者中，胰島細(xì)胞抗原-特異性t細(xì)胞或在胸腺發(fā)育中被清除或被轉(zhuǎn)化成可積極抑制對(duì)胰島細(xì)胞抗原的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的t調(diào)節(jié)性細(xì)胞。在少年糖尿病患者中中和少年糖尿病的nod小鼠模型中，缺失這些耐受機(jī)制。在它們?nèi)笔У那闆r下，胰島細(xì)胞抗原由人白細(xì)胞抗原i和ii類分子遞呈并被cd8(+)和cd4(+)自身反應(yīng)性t細(xì)胞識(shí)別。這些自身反應(yīng)性細(xì)胞對(duì)胰島細(xì)胞的破壞最終導(dǎo)致葡萄糖耐受不良。同時(shí)給予tregitopes和胰島細(xì)胞抗原導(dǎo)致天然t調(diào)節(jié)性細(xì)胞的活化和現(xiàn)有的抗原特異效應(yīng)t細(xì)胞轉(zhuǎn)化至調(diào)節(jié)性表型。這樣改變了有害的自身免疫應(yīng)答導(dǎo)致對(duì)抗原特異性適應(yīng)性耐受的誘導(dǎo)。通過(guò)誘導(dǎo)抗原-特異性耐受調(diào)節(jié)對(duì)自體表位的自身免疫應(yīng)答可預(yù)防現(xiàn)行的β-細(xì)胞破壞。因此，本發(fā)明tregitope可用于預(yù)防或治療糖尿病的方法中。
應(yīng)用于乙肝病毒(hbv)感染。慢性hbv通常為獲得性(由母體胎兒傳播)或在罕見(jiàn)情況下為成人急性hbv感染的結(jié)果。慢性乙肝(ch-b)急劇加重通常伴隨著對(duì)乙肝核心抗原和e抗原(hbcag/hbeag)細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)。在近期的研究中，syfpeithit細(xì)胞表位定位系統(tǒng)可用于預(yù)測(cè)hbcag和hbeag的mhcii類-限制性表位肽。使用高評(píng)分肽構(gòu)建mhcii類四聚體并用于測(cè)定treg和ctl頻率。結(jié)果顯示在加重過(guò)程中特異于hbcag的treg細(xì)胞減少，伴隨著hbcag肽-特異細(xì)胞毒性t細(xì)胞的增加。在耐受期，鑒定foxp3-表達(dá)treg細(xì)胞克隆。這些數(shù)據(jù)表明hbcagtregt細(xì)胞的減少解釋了慢性乙肝病毒感染自然進(jìn)程上的自發(fā)加重。因此，本發(fā)明tregitope可用于預(yù)防或治療病毒感染例如hbv感染的方法中。
應(yīng)用于slf。已確定了在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)或干燥綜合征(
應(yīng)用于格雷夫斯病(graves’disease)。格雷夫斯病是以自身促甲狀腺激素受體(tshr)的抗體為特點(diǎn)的自身免疫疾病，導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)或從甲狀腺非正常地強(qiáng)烈釋放激素。若干遺傳因素可影響對(duì)格雷夫斯病的易感性。女性比男性更容易感染該疾病；白人和亞洲人比黑人的風(fēng)險(xiǎn)更高并且hladrb1-0301與該疾病密切相關(guān)。因此，聯(lián)合給予本發(fā)明tregitope(s)和tshr或其他格雷夫斯病的抗原或其部分可用于預(yù)防和治療格雷夫斯病的方法中。
應(yīng)用于自身免疫性甲狀腺炎。自身免疫性甲狀腺炎為對(duì)自身甲狀腺過(guò)氧化酶和/或甲狀腺球蛋白產(chǎn)生抗體時(shí)發(fā)生的疾病，其引起甲狀腺濾泡的逐漸破壞。hladr5與該疾病緊密相關(guān)。因此，聯(lián)合給予本發(fā)明tregitope和甲狀腺過(guò)氧化酶和/或甲狀腺球蛋白tshr或其部分可用于預(yù)防和治療自身免疫性甲狀腺炎的方法中。
應(yīng)用于疫苗載體的設(shè)計(jì)。靶向樹(shù)突狀細(xì)胞表面受體dec-205的單克隆抗體已顯示作為可靶向疫苗抗原至樹(shù)突狀細(xì)胞的疫苗載體的潛能。然而抗-dec-205可成功作為強(qiáng)炎性免疫應(yīng)答的刺激劑依賴于聯(lián)合給予非特異樹(shù)突狀細(xì)胞成熟因子。當(dāng)它們不存在時(shí)，抗-dec-205誘導(dǎo)抗原-特異性耐受而不是免疫。因此，包含于抗-dec-205的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表位可促進(jìn)致耐受性反應(yīng)，其只有通過(guò)聯(lián)合給予非特異性免疫刺激劑才可克服。這一點(diǎn)已被試驗(yàn)驗(yàn)證，也就是說(shuō)包含于抗-dec-205載體中的tregitopes引起調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的抗原特異性擴(kuò)增并抑制炎性免疫應(yīng)答。修飾這些tregitopes這樣它們不再結(jié)合mhc分子將顯著降低致耐受性，使得可將抗-dec-205用作消除免疫系統(tǒng)非特異性活化相關(guān)危險(xiǎn)的有效的獨(dú)一無(wú)二的抗原遞送系統(tǒng)。
試劑盒
例如可通過(guò)使用包括至少一種本發(fā)明tregitopes組合物的預(yù)包裝試劑盒實(shí)施本文所述方法，其可方便地用于例如臨床環(huán)境治療顯示本文所述醫(yī)學(xué)病癥癥狀或家族史的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包括至少一種本發(fā)明tregitopes組合物的使用說(shuō)明以治療顯示本文所述醫(yī)學(xué)病癥癥狀或家族史的受試者。
用tregitopes離體擴(kuò)增t-調(diào)節(jié)性細(xì)胞
在另一方面，本發(fā)明提供離體擴(kuò)增調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供擴(kuò)增生物樣品中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的方法，該方法包括：(a)提供來(lái)自受試者的生物樣品；(b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性t細(xì)胞；以及將分離的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞與有效量的本發(fā)明tregitope組合物在t-調(diào)節(jié)性細(xì)胞數(shù)量增加得到擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞組合物的條件下接觸，藉此擴(kuò)增生物樣品中的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括給予受試者擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予了擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞組合物的受試者(例如通過(guò)自體移植擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞組合物)為獲得原始生物樣品的相同個(gè)體(ruitenberg，j.等，bmcimmunol.，7：11，2006)。
tregitope組合物的體外應(yīng)用
在另一方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明tregitope組合物作為在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒芯空{(diào)節(jié)性t細(xì)胞功能的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供刺激生物樣品中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的體外方法，該方法包括：(a)提供來(lái)自受試者的生物樣品；(b)從生物樣品中分離調(diào)節(jié)性t細(xì)胞；以及將分離的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞與有效量的本發(fā)明tregitope組合物在t調(diào)節(jié)性細(xì)胞被刺激而改變一種或多種生物功能的條件下接觸，藉此刺激生物樣品中的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測(cè)定tregitope與調(diào)節(jié)性t細(xì)胞或其片段結(jié)合的體外方法。
下文的實(shí)施例不應(yīng)理解為以何方式限制本發(fā)明范疇。就本公開(kāi)而言，本文權(quán)利要求范圍內(nèi)的許多實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
例證
將tregitopes(1)用t細(xì)胞表位定位算法epimatrix鑒定，(2)驗(yàn)證其結(jié)合至可溶性hla，(3)證明其與天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞黏附，(4)證明其離體(在人pbmc中)抑制對(duì)聯(lián)合給予抗原的免疫應(yīng)答和(5)證明其體內(nèi)(在小鼠中)抑制對(duì)聯(lián)合給予抗原的免疫應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)的方法列于下文，后面為對(duì)應(yīng)的結(jié)果。
(1)鑒定t細(xì)胞表位和t細(xì)胞表位集簇的方法
t細(xì)胞特異識(shí)別由抗原遞呈細(xì)胞(apcs)在mhc(主要組織相容性復(fù)合物)ii類分子情況下遞呈的表位?？梢园?至30個(gè)連續(xù)氨基酸并適合mhcii類分子結(jié)合溝槽的線性序列遞呈這些t-輔助細(xì)胞表位。已開(kāi)發(fā)一些計(jì)算機(jī)算法并用于檢測(cè)各種來(lái)源蛋白質(zhì)分子中的ii類表位(degroot，a.等，aidsres.hum.retroviruses，13：539-541，1997；schafer，j.等，vaccine，16：1880-1884，1998；degroot，a.等，vaccine，19：4385-95，2001；degroot，a.等，vaccine，21：4486-504，2003)。這些對(duì)t-輔助細(xì)胞表位的“計(jì)算機(jī)算法(insilico)”預(yù)測(cè)已成功應(yīng)用于疫苗設(shè)計(jì)和治療性蛋白的去免疫性。
epimatrix系統(tǒng)為預(yù)測(cè)i類和ii類表位的工具。該算法使用預(yù)測(cè)結(jié)合hla分子的9-和10-mer肽的矩陣。各矩陣以與氨基酸結(jié)合親和力(由與口袋譜型法(pocketprofilemethod)(sturniolo，t.等，nat.biotechnol.，17：555-561，1999)相似但是不相同的方法闡明)相關(guān)的位置特異性系數(shù)為基礎(chǔ)。epimatrix系統(tǒng)已用于前瞻性預(yù)測(cè)大量的已在體外或體內(nèi)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的表位。首先將任何給定序列的完整氨基酸分割成重疊的9-mer框架，其中各框架與上一個(gè)重疊八個(gè)氨基酸。就其與八個(gè)普通ii類hla單倍型(drb1*0101、drb1*0301、drb1*0401、drb1*0701、drb1*0801、drb1*1101、drb1*1301和drb1*1501)的預(yù)測(cè)親和力給各框架評(píng)分。由于它們的普遍性和它們之間的差異，這些8個(gè)等位基因涵蓋了約97％的世界人群。然后相對(duì)于衍生自大量隨機(jī)生成肽序列的分?jǐn)?shù)分布標(biāo)準(zhǔn)化epimatrix初始分?jǐn)?shù)。所得“z”分?jǐn)?shù)通常正態(tài)分布并可在等位基因之間直接比較。
epimatrix肽評(píng)分。已測(cè)定在epimatrix“z”范圍中的評(píng)分高于1.64(約任何給定肽組的前5％)的任何肽具有顯著的機(jī)會(huì)與被預(yù)測(cè)的mhc分子結(jié)合。在該范圍內(nèi)評(píng)分高于2.32(前1％)的肽極有可能結(jié)合；大多數(shù)已發(fā)表的t細(xì)胞表位在這一評(píng)分范圍內(nèi)。之前研究已證明epimatrix可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)已公開(kāi)的mhc配體和t細(xì)胞表位。
鑒定混合t細(xì)胞表位簇。表位定位后，篩選epimatrix算法生成的結(jié)果組判斷t細(xì)胞表位簇和epibars的存在。潛在的t細(xì)胞表位并不是隨機(jī)分布在整個(gè)蛋白質(zhì)序列中而是易于“集簇”。t細(xì)胞表位“(集)簇(cluster)”的長(zhǎng)度為9至約30個(gè)氨基酸并且，考慮到它們與多個(gè)等位基因的親和力以及跨越多個(gè)基因，其在任何位置包含4至40個(gè)結(jié)合基序。使用已知為clustimer的適當(dāng)算法鑒定推定的t細(xì)胞表位簇。簡(jiǎn)略而言，聚集所分析的各9-mer肽的epimatrix分?jǐn)?shù)并根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)獲得的閾值檢查。接著將高分?jǐn)?shù)9-mer一次延伸一個(gè)氨基酸。再次聚集已延伸序列的分?jǐn)?shù)并與修改的閾值比較。重復(fù)該過(guò)程直至預(yù)定的延伸不再提高集簇的整體分?jǐn)?shù)。在本研究中鑒定的tregitope(s)由clustimer算法鑒定為t細(xì)胞表位簇。它們包含顯著數(shù)量的推定t細(xì)胞表位和epibars，表明mhc結(jié)合和t細(xì)胞反應(yīng)性的巨大潛力。
(2)評(píng)價(jià)肽合成和結(jié)合可溶性mhc的方法
肽合成?？赏ㄟ^(guò)直接化學(xué)合成或重組方法(sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress，(1989))生產(chǎn)tregitopes。通過(guò)newenglandpeptide的9-芴甲氧羰基(fmoc)合成法在自動(dòng)化rainensymphony/蛋白質(zhì)技術(shù)合成儀(synpep，dublin，ca)上制備對(duì)應(yīng)于本發(fā)明tregitopes的肽。經(jīng)hplc、質(zhì)譜和uv掃描(分別確證純度、質(zhì)量和光譜)驗(yàn)證該肽以純度>80％遞送。
所生產(chǎn)肽的結(jié)合。將非生物素化的待檢測(cè)肽重懸于96-孔聚丙烯板中至終濃度在0.1μm-400μm的范圍內(nèi)，一式三孔。接著在這些孔中加入已純化重組hlaii類分子的在150mm檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(ph5.4)中包含1mmpefabloc、0.75％正-辛基-b-d-吡喃葡萄糖苷的溶液至終濃度200ng/孔。將96孔板于37℃在6％co2中溫育45分鐘。溫育后，將生物素化fluha肽307-319(或另一適當(dāng)?shù)膶?duì)照肽)加入至終濃度0.1μm/孔并37℃溫育20小時(shí)。接著將各孔的內(nèi)容物加入預(yù)先包被了抗-人hla-drl243捕獲抗體(bectondickenson)的96-孔高結(jié)合elis板中并于4℃溫育20小時(shí)。接著向各孔中加入100μl(10μg/ml)銪-標(biāo)記鏈霉親和素(perkin-elmer)和100μl富集緩沖液(perkin-elmer)顯色。在室溫下于暗處使反應(yīng)進(jìn)行15-30分鐘并接著在wallacvictor3-v時(shí)間分辨熒光免疫分析儀上測(cè)定熒光。通過(guò)使用sigmaplot分析程序用非線性回歸分析計(jì)算ic50值。基于與已知肽的比較，250μm或更大的ic50指示弱結(jié)合并且400μm或更大的ic50指示無(wú)結(jié)合相互作用。
(3)評(píng)價(jià)肽黏附天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞能力的方法
t細(xì)胞分離。本研究方案涉及從rhodeislandbloodbank，providence獲得的捐贈(zèng)血液，來(lái)自clinicalpartners，johnston，rhodeisland招募的志愿者的血液，從stallergenes，paris，france招募的志愿者獲得的血液以及從供應(yīng)商獲得的樣品。遵循聯(lián)邦指南以及stallergenes和epivax機(jī)構(gòu)政策獲得供體血液。獲得供體血液的方案經(jīng)各自機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。根據(jù)accuspin方案(sigma-aldrich，st.louis，mo)分離外周血單核細(xì)胞。塵螨過(guò)敏性個(gè)體的冷藏pbmc獲自cellulartechnologiesltd.(cleveland，ohio)。
天然treg測(cè)定法。在單獨(dú)破傷風(fēng)毒素肽tt830-844、單獨(dú)tregitope、單獨(dú)植物凝血素(促有絲分裂陽(yáng)性對(duì)照)存在下或無(wú)刺激物條件下離體直接刺激人pbmcs4天。用抗-cd4-fitc(克隆rpa-t4；ebioscience)和抗-cd25-apc(克隆bc96；ebioscience)抗體在冰上在流式染色緩沖液(ebioscience)中將1×106個(gè)細(xì)胞染色30分鐘并用緩沖液洗滌兩次。細(xì)胞表面染色后，根據(jù)使用手冊(cè)將細(xì)胞固定并透化處理(ebioscience)，并對(duì)foxp3(克隆pch101；ebioscience)胞內(nèi)染色。在不同培養(yǎng)條件下foxp3陽(yáng)性cd4+/cd25+t細(xì)胞的頻率由flowjo分析軟件列出。cd4+cd25+表達(dá)的增加指示t細(xì)胞活化，當(dāng)伴隨foxp3表達(dá)增加時(shí)指示被活化的細(xì)胞為調(diào)節(jié)性的。
(4)評(píng)價(jià)肽離體抑制對(duì)聯(lián)合給予抗原的應(yīng)答能力的方法
旁觀者抑制測(cè)定法。將分離的pbmcs在單獨(dú)免疫原性抗原或該抗原和tregitope肽存在下于37℃5％co2培養(yǎng)8天。將待測(cè)抗原以10μg/ml加入并包括1)典型抗原例如破傷風(fēng)毒素肽tt830-844、流感血凝素肽307-319、牛痘肽表位和cef陽(yáng)性對(duì)照肽庫(kù)(網(wǎng)站aidsreagent.org的nihaidsresearch&referencereagentprogram；currier，j.等l.，j.immunol.methods，260：157-72，2002；mwau，m.等，aidsres.hum.retroviruses，18：611-8，2002)，2)蛋白質(zhì)藥物例如肉毒桿菌神經(jīng)毒素a、自體自身抗原例如促甲狀腺激素和補(bǔ)體組分csd。待測(cè)抗原也包括變應(yīng)原：白樺樹(shù)花粉抗原betv1、屋塵螨裂解物和經(jīng)純化的屋塵螨抗原derp2。在第2天將重組il-2(10iu/ml)和il-7(20ng/ml)加入pbmc培養(yǎng)物中。刺激8天后收獲細(xì)胞并用pbs洗滌數(shù)次并根據(jù)下文描述的人細(xì)胞因子釋放測(cè)定法測(cè)定。
人ifn-γelispot。用購(gòu)自mabtech的人ifn-γelispot試劑盒進(jìn)行ifn-γelispot測(cè)定。以10μg/ml將目標(biāo)肽加入包含250000個(gè)人外周血單核細(xì)胞(在含10％人血清的rpmi1640中)的一式三份重復(fù)孔中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。在一式三份重復(fù)孔中加入10μg/ml的pha。六個(gè)不含肽的孔用于背景測(cè)定。如果經(jīng)mann-whitneyu檢測(cè)肽檢測(cè)孔中的斑點(diǎn)數(shù)量與對(duì)照孔具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。一般而言，如果斑點(diǎn)數(shù)量至少為背景的四倍并且每一百萬(wàn)細(xì)胞超過(guò)背景大于50個(gè)斑點(diǎn)(每20000個(gè)脾細(xì)胞有1次應(yīng)答超過(guò)背景)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。結(jié)果記錄為高于背景的平均斑點(diǎn)數(shù)并調(diào)節(jié)至每一百萬(wàn)接種細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。當(dāng)測(cè)定為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著時(shí)，10％或更大的抑制率被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
人ifn-γelispot。用購(gòu)自mabtech的人il-4elispot試劑盒進(jìn)行ifn-γelispot測(cè)定。以10μg/ml將目標(biāo)肽加入包含250000個(gè)人外周血單核細(xì)胞(在含10％人血清的rpmi1640中)的一式三份重復(fù)孔中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。在一式三份重復(fù)孔中加入10μg/ml的pha。六個(gè)不含肽的孔用于背景測(cè)定。如果經(jīng)mann-whitneyu檢測(cè)肽檢測(cè)孔中的斑點(diǎn)數(shù)量與對(duì)照孔具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。一般而言，如果斑點(diǎn)數(shù)量至少為背景的四倍并且每一百萬(wàn)細(xì)胞超過(guò)背景大于50個(gè)斑點(diǎn)(每20000個(gè)脾細(xì)胞有1次應(yīng)答超過(guò)背景)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。結(jié)果記錄為高于背景的平均斑點(diǎn)數(shù)并調(diào)節(jié)至每一百萬(wàn)接種細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。當(dāng)測(cè)定為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著時(shí)，10％或更大的抑制率被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
人il-4elispot。用購(gòu)自mabtech的人il-4elispot試劑盒進(jìn)行il-4elispot測(cè)定。以10μg/ml將目標(biāo)肽加入包含250000個(gè)人外周血單核細(xì)胞(在含10％人血清的rpmi1640中)的一式三份重復(fù)孔中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。在一式三份重復(fù)孔中加入2μg/ml的pha。六個(gè)不含肽的孔用于背景測(cè)定。使用變體排列測(cè)試(variantpermutationtest)(hudgens，m.等，j.immunol.methods，288：19-34，2004)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)。如果肽檢測(cè)孔中的斑點(diǎn)數(shù)量與對(duì)照孔具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。一般而言，如果斑點(diǎn)數(shù)量至少為背景的四倍并且每一百萬(wàn)細(xì)胞超過(guò)背景大于50個(gè)斑點(diǎn)(每20000個(gè)脾細(xì)胞有1次應(yīng)答超過(guò)背景)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。結(jié)果記錄為高于背景的平均斑點(diǎn)數(shù)并調(diào)節(jié)至每一百萬(wàn)接種細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。當(dāng)測(cè)定為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著時(shí)，10％或更大的抑制率被認(rèn)為是顯著的。
人ifn-γelisaspot。以10μg/ml將目標(biāo)肽加入包含添加了10％人血清的rpmi1640中人外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)物中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。用10μg/mlpha刺激或未用肽刺激的培養(yǎng)物作為對(duì)照。使用r&dsystemsquantikineelisa試劑盒進(jìn)行人ifn-γ定量夾心elisas。將特異于ifn-γ的多克隆抗體預(yù)包被至96-孔微量滴定板上。將試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品和包括pha的細(xì)胞上清樣品和無(wú)肽對(duì)照(100μl)加入孔中并且任何存在的ifn-y被固定化抗體在室溫下經(jīng)2小時(shí)結(jié)合。洗去未結(jié)合物質(zhì)之后，在孔中加入特異于ifn-γ的酶聯(lián)多克隆抗體并于室溫下溫育2小時(shí)。洗去任何未結(jié)合抗體酶試劑后，在孔中加入底物溶液30分鐘，與結(jié)合ifn-γ的量成正比顯色。停止顯色并在wallacvictor3上于450nm測(cè)定顏色強(qiáng)度。通過(guò)從450nm值減去540nm的強(qiáng)度進(jìn)行板子光學(xué)缺陷的修正。通過(guò)t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同試驗(yàn)組之間細(xì)胞因子水平的差異。如果在試驗(yàn)和對(duì)照孔之間所觀察到的細(xì)胞因子表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)則該應(yīng)答被認(rèn)為是陽(yáng)性的。
多路人細(xì)胞因子/趨化因子elisa。用searchlightmultiplexelisa技術(shù)評(píng)價(jià)pbmc培養(yǎng)物上清的細(xì)胞因子和趨化因子水平。所測(cè)定的人細(xì)胞因子包括il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12p40、il-12p70、tnfα和tgfβ。所測(cè)定的人趨化因子包括mcp-1、mip-1α和mip-1β。searchlightproteomicarrays為定量多路夾心elisa，其包含點(diǎn)樣于96孔聚苯乙烯微量滴定板底部的多至16種不同的捕獲抗體。各抗體捕獲由生物素化抗體檢測(cè)的特異蛋白質(zhì)，然后加入鏈霉親和素-hrp，最后用電荷耦合裝置(ccd)照相機(jī)檢測(cè)supersignalelisafemto化學(xué)發(fā)光底物。通過(guò)t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同試驗(yàn)組之間細(xì)胞因子水平的差異。如果所觀察到的試驗(yàn)和對(duì)照孔之間的細(xì)胞因子表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)則該應(yīng)答被認(rèn)為是陽(yáng)性的。
細(xì)胞分離/排除方法。使用invitrogendynabeads系統(tǒng)(用于人cd4和cd25)根據(jù)使用說(shuō)明(invitrogen，carlsbad，california)從pbmc中排除或陽(yáng)性分離人treg細(xì)胞群。
(5)體內(nèi)抑制對(duì)聯(lián)合給予抗原的應(yīng)答的方法
為了測(cè)定在生命體系中tregitopes對(duì)蛋白質(zhì)-誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的免疫抑制作用，使用鼠類模型進(jìn)行試驗(yàn)。用單獨(dú)的抗原、抗原和tregitope的混合物或與tregitope融合的抗原免疫數(shù)組小鼠。也評(píng)價(jià)陰性對(duì)照組(溶劑組)。最后一次注射后一周，根據(jù)所有的機(jī)構(gòu)和聯(lián)邦指南處死小鼠并收獲脾。使用新鮮分離的小鼠脾細(xì)胞測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答。制備單個(gè)脾細(xì)胞混懸液并用于下文的測(cè)定法中。心臟穿刺獲得全血并收集血清用于定量對(duì)聯(lián)合給予抗原的抗體應(yīng)答。
鼠ifn-γelispot.用購(gòu)自mabtech的鼠ifn-γelispot試劑盒進(jìn)行ifn-γelispot測(cè)定。以10μg/ml將目標(biāo)肽加入包含300000個(gè)鼠脾細(xì)胞(含10％fcs的rpmi1640中)的一式三份重復(fù)孔中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。在一式三份重復(fù)孔中加入10μg/ml的cona。六個(gè)不含肽的孔用于背景測(cè)定。如果經(jīng)mann-whitneyu檢測(cè)肽檢測(cè)孔中的斑點(diǎn)數(shù)量與對(duì)照孔具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。一般而言，如果斑點(diǎn)數(shù)量至少為背景的四倍并且每一百萬(wàn)細(xì)胞超過(guò)背景大于50個(gè)斑點(diǎn)(每20000個(gè)脾細(xì)胞有1次應(yīng)答超過(guò)背景)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。結(jié)果記錄為高于背景的平均斑點(diǎn)數(shù)并調(diào)節(jié)至每一百萬(wàn)接種細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。
鼠il-4elispot。用購(gòu)自mabtech的鼠il-4elispot試劑盒進(jìn)行il-4elispot測(cè)定。以10μg/ml將目標(biāo)肽加入包含300000個(gè)鼠脾細(xì)胞(含10％fcs的rpmi1640中)的一式三份重復(fù)孔中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。在一式三份重復(fù)孔中加入10μg/ml的cona。六個(gè)不含肽的孔用于背景測(cè)定。用變體排列測(cè)試(variantpermutationtest)(hudgens，m.等，j.immunol.methods，288：19-34，2004)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)。如果肽檢測(cè)孔中的斑點(diǎn)數(shù)量與對(duì)照孔具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。一般而言，如果斑點(diǎn)數(shù)量至少為背景的四倍并且每一百萬(wàn)細(xì)胞超過(guò)背景大于50個(gè)斑點(diǎn)(每20000個(gè)脾細(xì)胞有1次應(yīng)答超過(guò)背景)則認(rèn)為是陽(yáng)性應(yīng)答。結(jié)果記錄為背景上的平均斑點(diǎn)數(shù)并調(diào)節(jié)至每一百萬(wàn)接種細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。
鼠ifn-γelisa。將目標(biāo)肽以10μg/ml加入包含人外周血單核細(xì)胞(添加了10％人血清的rpmi1640中)的培養(yǎng)物中并于37℃5％co2氣氛下溫育十八至二十二小時(shí)。用10μg/mlpha刺激的或未用肽刺激的培養(yǎng)物作為對(duì)照。使用r&dsystemsquantikineelisa試劑盒進(jìn)行鼠ifn-γ定量夾心elisas。將特異于ifn-γ的多克隆抗體預(yù)包被至96-孔微量滴定板上。將試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品和包括pha的細(xì)胞上清樣品和無(wú)肽對(duì)照(100μl)加入孔中并且任何存在的ifn-γ被固定化抗體在室溫下經(jīng)2小時(shí)結(jié)合。洗去未結(jié)合物質(zhì)之后，在孔中加入特異于ifn-γ的酶聯(lián)多克隆抗體并于室溫下溫育2小時(shí)。洗去任何未結(jié)合抗體酶試劑后，在孔中加入底物溶液30分鐘，與結(jié)合ifn-γ的量成正比顯色。停止顯色并在wallacvictor3上于450nm測(cè)定顏色強(qiáng)度。通過(guò)從450nm值減去540nm的強(qiáng)度進(jìn)行板子光學(xué)缺陷的修正。通過(guò)t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同試驗(yàn)組之間細(xì)胞因子水平的差異。如果所觀察到的試驗(yàn)和對(duì)照孔之間的細(xì)胞因子表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)則該應(yīng)答被認(rèn)為是陽(yáng)性的。
流式細(xì)胞計(jì)量法。將脾細(xì)胞以2×106細(xì)胞/孔加入含添加10％fcs、100u/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的rpmi1640的96-孔組織培養(yǎng)板中。各測(cè)定中包括未刺激對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(cona)。將細(xì)胞于37℃5％co2溫育過(guò)夜。溫育后，在包含1％牛血清白蛋白的pbs中洗滌并用表面抗體(例如，cd4、cd25)染色。接著用cytofix/cytoperm試劑盒(bdpharmingen)根據(jù)使用說(shuō)明將細(xì)胞洗滌并固定。固定后，在cytoperm緩沖液中洗滌細(xì)胞兩次并用抗胞內(nèi)標(biāo)記(例如，foxp3、il-10)的抗體染色。染色后用為流式細(xì)胞計(jì)量法制備的包含1％多聚甲醛的pbs洗滌并固定。在bdfacscalibur儀器上分析細(xì)胞。每樣品收集20000個(gè)事件。使用flojo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均減去背景?；趙ilcoxon等級(jí)和檢驗(yàn)進(jìn)行組之間比較。成對(duì)比較應(yīng)用顯著性p＜0.05，多重比較應(yīng)用p＜0.01。
細(xì)胞分離/排除方法。使用invitrogendynabeads系統(tǒng)(用于鼠cd4和cd25)根據(jù)使用說(shuō)明(invitrogen，carlsbad，california)從pbmc中排除或陽(yáng)性分離鼠treg細(xì)胞群。
定量聯(lián)合給予抗原的抗體
通過(guò)抗體-捕獲elisa定量抗原的igg抗體。將抗原(10μg/ml)溶解于碳酸鹽緩沖液中并置于96-孔微量滴定板中4℃過(guò)夜。接著用包含0.05％tween20(pbst)的經(jīng)磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌板子并用5％胎牛血清(fbs；gibco)的pbs溶液于室溫下封閉三小時(shí)。將0.5％fbs/pbs中系列稀釋的血清加入板子中并于室溫下溫育兩個(gè)小時(shí)。接著用pbst洗滌微量滴定板并在各孔中加入以1∶10000稀釋于0.5％fbs/pbs中的與辣根過(guò)氧化酶(southernbiotechnologyassociates)偶聯(lián)的100μl山羊抗-小鼠igg(γ鏈特異)。用pbst洗滌微量滴定板并接著用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb；moss)顯色。在wallacvictor3上于450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。通過(guò)從450nm值減去540nm的強(qiáng)度修正板子的光學(xué)缺陷。
實(shí)施例1.鑒定tregitope組合物
鑒定人igg蛋白表位為調(diào)節(jié)性。評(píng)價(jià)大量抗體的免疫原性潛能后，觀察到一種重復(fù)出現(xiàn)模式。某些表位簇出現(xiàn)在多個(gè)抗體中。不愿受到理論的束縛，據(jù)推斷高度保守的表位簇不太可能促進(jìn)抗-抗體免疫應(yīng)答。進(jìn)一步推斷這些重復(fù)出現(xiàn)模式可被免疫系統(tǒng)被動(dòng)耐受或主動(dòng)地黏附負(fù)責(zé)抑制抗-抗體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。將重復(fù)出現(xiàn)表位簇的序列與genbank的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比較確定了包含于igg抗體序列中既保守又可潛在刺激調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的19個(gè)區(qū)域(見(jiàn)表2)。
根據(jù)epimatrix系統(tǒng)，所有這些19個(gè)區(qū)域具有顯著的免疫刺激潛能，各包含至少一個(gè)至多14個(gè)結(jié)合基序并且在epivax免疫原性等級(jí)上的評(píng)分在1至25之間。此外，若干這些序列包含一個(gè)或多個(gè)“epibars”。epibars為預(yù)期結(jié)合至少4種不同ii類hla的單個(gè)9mer框架。epibars是免疫刺激潛能增加的標(biāo)志。
表2：本發(fā)明tregitopes及其epimatrix分值
保守。將所有igg衍生的推定tregitope序列與igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igd和igm的種系序列經(jīng)視覺(jué)檢查比較。發(fā)現(xiàn)igg-衍生的tregitopes在igg1、igg2、igg3和igg4的種系序列中高度保守。在iga、ige、igd或igm的種系序列中未發(fā)現(xiàn)同源性。其他tregitopes序列也高度保守(在人蛋白質(zhì)變異體中)并通常大量存在于循環(huán)中。
種。進(jìn)行igg-衍生的tregitopes與非人物種的同源性分析。將序列經(jīng)ncbi網(wǎng)站(ncbi.nlmnih.gov/blast)上傳至basiclocalalignmentsearchtool(blast)。blast程序?qū)⒌鞍踪|(zhì)序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性以發(fā)現(xiàn)序列之間局部相似性區(qū)域。發(fā)現(xiàn)igg-衍生的tregitopes在非人物種例如小鼠、大鼠、貓、駱駝、奶牛和非人靈長(zhǎng)類中是保守的。表3顯示了tregitope-289(seqno：4)的blast報(bào)告。
在普通循環(huán)人蛋白質(zhì)中鑒定調(diào)節(jié)性表位。在后續(xù)的分析中epivax鑒定出一組可能也包含tregitopes的普通循環(huán)蛋白。被分析的蛋白質(zhì)組包括人體分離物：肌動(dòng)蛋白、白蛋白、膠原、纖維蛋白原、觸珠蛋白、角蛋白、肌球蛋白、骨鈣素、前列腺素、超氧化物歧化酶、肌聯(lián)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。如上所述用epimatrix和clustimer分析各蛋白質(zhì)的普通分離物并篩選一組高評(píng)分并且高度保守的推定t細(xì)胞表位用于進(jìn)一步分析。見(jiàn)表2，seqidnos：38-58。
實(shí)施例2.通過(guò)與hlaii類分子的結(jié)合合成和鑒定tregitope組合物
根據(jù)上文所述方法在合成iggtregitope上進(jìn)行可溶性mhc結(jié)合測(cè)定。從強(qiáng)結(jié)合對(duì)照肽的六點(diǎn)抑制曲線得到ic50值(μm)。計(jì)算機(jī)(insilico)分析鑒定的tregitopes與人mhc分子結(jié)合。見(jiàn)下文的表4。
與氨基和羧基端的結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)的附加測(cè)定。對(duì)肽的氨基和羧基端的修飾已顯示可改變mhc結(jié)合、蛋白水解降解和t細(xì)胞活化(maillère，b.等，mol.immunol.，32：1377-85，1995；allen，p.等，int.immunol.，1：141-50，1989)。如果所觀察到的ntregs活化確實(shí)由tregitope-特異tcr識(shí)別，那么對(duì)tregitope肽羧基端的細(xì)微改變應(yīng)導(dǎo)致不同的抑制作用。合成包含和不包含c-端酰胺帽的相同tregitope肽序列。在hla結(jié)合測(cè)定法中評(píng)價(jià)不加帽肽與drb1*0101和drb1*1501的親和力并顯示以比加帽肽更高的親和力與兩個(gè)等位基因結(jié)合。使用來(lái)自drb1*0101受試者的pbmc研究tregitope肽(加帽和不加帽)抑制對(duì)聯(lián)合溫育的cef、mhci類免疫原性肽庫(kù)的免疫應(yīng)答的能力。在第1天刺激細(xì)胞并培養(yǎng)6天。在第7天收集細(xì)胞并將其一半用cd4、cd25和cd127染色并用流式細(xì)胞儀分析。剩余的細(xì)胞加入ifn-γelispot板中并用cef再刺激。與不加帽tregitope-289相比，與c-端酰胺加帽tregitope的共培養(yǎng)導(dǎo)致cd4+cd25+cd127lowtregs增加(圖2，左圖)。與之前顯示cd4+cd25+cd127lowtregs是高度抑制性的研究一致，加帽tregiotpe-289而不是不加帽tregiotpe-289可抑制cef-特異ifn-γ分泌(圖2，右圖)。
后續(xù)分析顯示加帽和不加帽tregitope-289(seqno：4)之間小1道爾頓的改變。經(jīng)質(zhì)譜分析tregitope-289酰胺化肽小1道爾頓。本文例證tregitope-289c-端酰胺化改變了其結(jié)合和功能特性。由于加帽tregitope-289肽顯示更好的功能性，在所有的后續(xù)測(cè)定中使用加帽(酰胺化)肽。在進(jìn)一步的報(bào)告中，本文顯示的tregitope-289結(jié)果指加帽形式。本文描述的tregitopes的加帽和不加帽形式均涵蓋于本發(fā)明中。
實(shí)施例3.通過(guò)天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞刺激鑒定tregitope組合物
在單獨(dú)破傷風(fēng)毒素肽tt830-844、單獨(dú)tregitope、單獨(dú)植物凝血素(促有絲分裂陽(yáng)性對(duì)照)存在下或無(wú)刺激物條件下離體直接刺激人pbmcs4天。用抗-cd4-fitc(克隆rpa-t4；ebioscience)和抗-cd25-apc(克隆bc96；ebioscience)抗體在冰上在流式染色緩沖液(ebioscience)中將1×106個(gè)細(xì)胞染色30分鐘并用緩沖液洗滌兩次。細(xì)胞表面染色后，根據(jù)使用手冊(cè)將細(xì)胞固定并透化處理(ebioscience)，并對(duì)foxp3胞內(nèi)染色(克隆pch101；ebioscience)。在不同培養(yǎng)條件下foxp3陽(yáng)性cd4+/cd25+t細(xì)胞的頻率由flowjo分析軟件列出。破傷風(fēng)毒素-和tregitope-刺激樣品中cd25表達(dá)相似的增加表明兩種肽對(duì)t細(xì)胞的活化(圖3；顯示了tregitope-289的結(jié)果)。然而cd4+cd25+亞群中foxp3的表達(dá)存在顯著差異，取決于所使用的刺激物。破傷風(fēng)毒素刺激導(dǎo)致foxp3表達(dá)降低7％，而tregitope刺激導(dǎo)致表達(dá)增加大于兩倍，分別表明th和ntreg活化。
實(shí)施例4.通過(guò)體外抑制聯(lián)合給予抗原鑒定tregitope組合物
4a：tregitope-167和tregitope-134在體外下調(diào)對(duì)聯(lián)合給予抗原的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答并上調(diào)其調(diào)節(jié)性應(yīng)答
將pbmcs與a)單獨(dú)免疫原性肽庫(kù)，或b)含htregitope-167免疫原性肽的庫(kù)，或c)含htregitope-134的免疫原性肽庫(kù)一起培養(yǎng)8天。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。將細(xì)胞(2×105細(xì)胞/孔)加入96-孔板中并用單獨(dú)免疫原性肽庫(kù)、免疫原性肽庫(kù)和tregitope或無(wú)肽(陰性對(duì)照)再刺激65小時(shí)。根據(jù)如上所述的多路elisa分析法分析上清。在初始刺激中與tregitope共溫育導(dǎo)致調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子(il-10和mcp-1)的分泌增加以及輔助t細(xì)胞細(xì)胞因子和趨化因子(il-5、il-6、ifn-γ和mip-1α)分泌減少，證明了tregitopes黏附并活化調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的能力(圖4)。
4b：tregitope-289在體外下調(diào)對(duì)聯(lián)合給予抗原的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答并上調(diào)其調(diào)節(jié)性應(yīng)答。
將pbmcs與a)單獨(dú)免疫原性肽庫(kù)，或b)含tregitope-289的免疫原性肽庫(kù)，或c)含tregitope-289的免疫原性肽庫(kù)一起培養(yǎng)8天。免疫原性肽庫(kù)中的肽衍生自c3d，一種免疫原性自體蛋白(knopf，p.等，immunol.cellbiol.，2008jan8；doi：10.1038/sj.icb.7100147)。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。如上所述，將細(xì)胞(2×105細(xì)胞/孔)加入96-孔板中并在一式三份重復(fù)孔中在各條件下再刺激65小時(shí)：?jiǎn)为?dú)c3d庫(kù)、c3d庫(kù)+tregitope、pha對(duì)照或無(wú)肽(陰性對(duì)照)。用多路elisa分析法分析上清。兩種培養(yǎng)條件之后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答是強(qiáng)效的。在初始刺激中與tregitope共溫育導(dǎo)致調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子il-10的分泌增加、調(diào)節(jié)性趨化因子tgfβ略微增加以及輔助t細(xì)胞細(xì)胞因子和趨化因子ifnγ和mip1α分泌增加，進(jìn)一步證明了tregitopes黏附并活化調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的能力(圖5)。
4c：tregitopes庫(kù)體外下調(diào)對(duì)聯(lián)合給予抗原的效應(yīng)細(xì)胞自身免疫應(yīng)答
與衍生自tshr(格雷夫斯病的目標(biāo)抗原)的表位共溫育抑制對(duì)格雷夫斯病患者pbmc表位的免疫應(yīng)答。將prmcs與含有或不含tregitope肽庫(kù)(tregitope-134、tregitope-167、tregitope-289)的tshr肽庫(kù)一起培養(yǎng)8天。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。如上所述，在il-4elispot板中用1)個(gè)體tshr表位+tregitope-134、tregitope-167和tregitope-289的庫(kù)，2)tshr表位庫(kù)+tregitope-134、tregitope-167和tregitope-289的庫(kù)，或3)無(wú)刺激物對(duì)照再刺激2.5×105個(gè)細(xì)胞。兩種培養(yǎng)條件后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答是強(qiáng)效的。
在再刺激中抗原(tshr肽)與tregitope共溫育導(dǎo)致il-4斑點(diǎn)形成細(xì)胞的顯著減少。這一數(shù)據(jù)顯示tregitopes抑制效應(yīng)t細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌(圖6)。
4d：個(gè)體tregitopes體外下調(diào)對(duì)cef(免疫顯性聯(lián)合給予肽抗原的庫(kù))的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答。
與tregitope共溫育抑制對(duì)cef(衍生自普通病原體的免疫顯性肽表位庫(kù))的免疫應(yīng)答。將pbmcs與或不與單個(gè)的tregitope肽(tregitope-289、tregitope294、tregitope-029、tregitope-074、tregitope-009)一起培養(yǎng)8天。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。如上文所述，在ifn-γelispot板中用單獨(dú)cef、pha陽(yáng)性對(duì)照(未顯示)或無(wú)刺激物對(duì)照再刺激2.5×105個(gè)細(xì)胞。兩種培養(yǎng)條件后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答均是強(qiáng)效的。
在溫育期間將tregitope與抗原(cef)共溫育導(dǎo)致響應(yīng)cef再刺激ifn-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞的顯著減少。這些數(shù)據(jù)顯示tregitopes抑制效應(yīng)t細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌。
4e：tregitopes庫(kù)下調(diào)對(duì)聯(lián)合給與治療性蛋白質(zhì)抗原的體外效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答
與tregitope共溫育抑制對(duì)衍生自肉毒桿菌神經(jīng)毒素(用于治療張力障礙(運(yùn)動(dòng)失調(diào))的蛋白質(zhì))的肽表位的免疫應(yīng)答。在有證據(jù)證明抑制劑(抗-bont抗體)存在下將受試者的pbmcs與或不與tregitope肽庫(kù)(tregitope-167、tregitope-134和tregitope-289)一起培養(yǎng)8天。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。如上文所述，在ifn-γelispot板中用單個(gè)bont肽、bont肽庫(kù)、陽(yáng)性pha對(duì)照(未顯示)或無(wú)刺激物對(duì)照再刺激2.5×105個(gè)細(xì)胞。未顯示不具有顯著基線應(yīng)答的肽。兩種培養(yǎng)條件后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答均是強(qiáng)效的。
在溫育期間將抗原(cef)與tregitope共溫育導(dǎo)致響應(yīng)cef再刺激ifn-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞顯著減少。這些數(shù)據(jù)顯示tregitopes響應(yīng)免疫原性治療性蛋白質(zhì)抑制效應(yīng)t細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌(圖8和表5)。
4f：tregitope-289和tregitope-134響應(yīng)聯(lián)合給予的免疫顯性抗原體外下調(diào)增殖
cef是可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的來(lái)自普通病原體的免疫顯性肽表位。將pbmcs與單獨(dú)cef、cef+tregitope-134或cef+tregitope-289一起培養(yǎng)8天。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案將2×106個(gè)細(xì)胞用cfse染料(invitrogen)預(yù)標(biāo)記并用cef庫(kù)或無(wú)肽(陰性對(duì)照)或pha分裂素對(duì)照再刺激65小時(shí)；收集上清并如上所述進(jìn)行hifn-γelisas。兩種培養(yǎng)條件后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答均是強(qiáng)效的。再刺激期間與tregitope共溫育導(dǎo)致ifn-γ形成顯著減少(左圖)，其與效應(yīng)t細(xì)胞增殖減少相關(guān)(圖9，右圖)。
4g：tregitope-289響應(yīng)聯(lián)合給與抗原體外下調(diào)增殖
將之前用牛痘免疫的受試者的pbmcs與單獨(dú)的免疫原性牛痘肽或含如上所述tregitope-289的免疫原性牛痘肽一起培養(yǎng)8天。收獲細(xì)胞并用pbs洗滌。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案將2×106個(gè)細(xì)胞用cfse染料(invitrogen)預(yù)標(biāo)記并用牛痘肽、牛痘肽和tregitope-289或無(wú)肽(陰性對(duì)照)再刺激65小時(shí)。溫育期間與tregitope共溫育導(dǎo)致效應(yīng)t細(xì)胞增殖顯著降低，進(jìn)一步證明了由tregitope活化的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞降低效應(yīng)t細(xì)胞增殖的能力(圖10)。
4h：tregitope抑制由具有調(diào)節(jié)性表型的細(xì)胞(cd4+cd25hit細(xì)胞)和il-10上調(diào)介導(dǎo)。
制備來(lái)自單個(gè)塵螨-過(guò)敏性個(gè)體的兩個(gè)pbmc樣品。一個(gè)樣品用抗-cd4和抗-cd25抗體染色并用流式細(xì)胞儀分析。在這一樣品中通過(guò)上文所述方法從剩余的pbmc中排除cd4+cd25hi細(xì)胞亞群。另一樣品保持不動(dòng)。接著用含有或不含tregitope-289的hdm裂解物協(xié)同刺激兩個(gè)樣品。排除cd4+cd25hi的pbmc抑制ifn-γ的能力小于未排除pbmc，表明tregitope的抑制作用由cd4+cd25hi細(xì)胞介導(dǎo)。在(完整)pbmcs的輔助分析中，與單獨(dú)hdm裂解物溫育相比，與hdm裂解物和tregitope-289共溫育之后對(duì)hdm裂解物的cd4+增殖性應(yīng)答被抑制。
圖11證明了初始共溫育中對(duì)cd4+/cd25hit細(xì)胞的要求。在cd4+/cd25hit細(xì)胞存在下，與tregitope-289和hdm協(xié)同刺激引起單獨(dú)hdm再刺激后γ-干擾素釋放的抑制；在cd4+/cd25hit細(xì)胞不存在下(溫育之前已分揀)，與用單獨(dú)hdm再刺激后更大量的抑制(65％：33.5至11.8pg/ml)相比，tregitope-289和hdm協(xié)同刺激與更低量的抑制(16％：16.5至12.4pg/ml)相關(guān)。圖11顯示包含tregs的細(xì)胞亞群對(duì)于誘導(dǎo)對(duì)抗原的耐受是必需的。
4i：tregitope共溫育引起具有調(diào)節(jié)性表型細(xì)胞(cd4+cd25hit細(xì)胞)的增殖和響應(yīng)變應(yīng)原的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子il-10的上調(diào)。
適應(yīng)性耐受的誘導(dǎo)：為了測(cè)定tregitopentreg活化是否可導(dǎo)致變應(yīng)原特異-atreg的生成，分析首先與單獨(dú)塵螨(dm)抗原、塵螨抗原+tregitope-289或塵螨抗原+tregitope-167溫育8天的pbmc(來(lái)自塵螨敏感性個(gè)體)。如上圖顯示(圖12)，與dm抗原和tregitope-289共溫育pbmc導(dǎo)致cd4+cd25hi細(xì)胞擴(kuò)增近四倍；與dm抗原和tregitope-167共溫育pbmc也具有相同的結(jié)果(1.6至7.5％)。在兩種tregitope共溫育中，也發(fā)現(xiàn)il-10分泌增加了五倍(圖12，下圖)；這一發(fā)現(xiàn)與增加的cd4+cd25hi細(xì)胞可為hdm-特異性適應(yīng)性treg的可能性一致。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在這一體內(nèi)測(cè)定法中驗(yàn)證擴(kuò)增的cd4+cd25hi群分泌il-10。在擴(kuò)增的cd4+cd25hi調(diào)節(jié)性細(xì)胞群存在下，響應(yīng)聯(lián)合給與抗原的il-10分泌，表明在與抗原的共溫育中誘導(dǎo)了適應(yīng)性tregs。
這些數(shù)據(jù)顯示了在相同的患者和相同的實(shí)驗(yàn)中與tregitope-289和dm抗原共溫育后和與tregitope-167和dm抗原共溫育后的cd4cd25hit細(xì)胞擴(kuò)增；以及用單獨(dú)hdm再刺激后由共溫育細(xì)胞分泌的il-10的量。
4j：tregitope共溫育引起抗原特異變應(yīng)性th2應(yīng)答的抑制
tregitope共溫育也可導(dǎo)致ccr4、cd30、crth2和ccr6表達(dá)的顯著減少，其已顯示與th2應(yīng)答相關(guān)。接著評(píng)價(jià)在延長(zhǎng)tregitope協(xié)同刺激后變應(yīng)原-特異性cd4+t細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子應(yīng)答的調(diào)節(jié)。培養(yǎng)30天后，tregitope協(xié)同刺激促進(jìn)betv11141-1155-特異性cd4+t細(xì)胞混合群的產(chǎn)生。用抗原和tregitope延長(zhǎng)刺激后，42％的這些表位-特異性細(xì)胞既不是il5陽(yáng)性也不是ifn-γ陽(yáng)性，并且44％在這一延長(zhǎng)的溫育中顯示出轉(zhuǎn)換至th-1-樣增加的干擾素應(yīng)答(圖13)。
眾所周知，篩選研究受試者是否存在hladr*11501以增加四聚體結(jié)合機(jī)會(huì)；tregitope-167(treg誘導(dǎo)增加五倍)的作用比tregitope-289(三倍增加)更顯著。在hlb結(jié)合測(cè)定法中tregitope-289未顯示與dr1501結(jié)合。相反tregitope-167可高親和力地地結(jié)合至hla1501(50μm時(shí)結(jié)合抑制為87％)。
實(shí)施例5.通過(guò)體內(nèi)抑制聯(lián)合給予抗原鑒定tregitope組合物
5a：聯(lián)合給予tregitope引起對(duì)聯(lián)合給與蛋白質(zhì)藥物的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)抑制
本文顯示tregitope抑制對(duì)細(xì)菌來(lái)源的治療性蛋白質(zhì)(稱作“antigen-xx”)的應(yīng)答(圖14)。在未公開(kāi)的研究中antigen-xx已引起人體中顯著的免疫原性。研究本發(fā)明tregitope是否可以體內(nèi)抑制對(duì)蛋白質(zhì)的效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。給hladr4轉(zhuǎn)基因小鼠(4-6周，雌性)每周三次皮下(頸背)注射1)單獨(dú)的50μgantigen-xx，2)50μgantigen-xx+25μg鼠tregitope-167和25μg鼠tregitope106或3)pbs假對(duì)照。收獲脾細(xì)胞并如上所述加入鼠il-4elispot板子中。
通過(guò)如上文所述的抗體-捕獲elisa測(cè)定antigen-xx的igg抗體定量。將antigen-xx(10μg/ml)溶于碳酸鹽緩沖液中(10mmna2co3和35mmnahco3[ph9])并置于96-孔微量滴定板中4℃過(guò)夜。接著用包含0.05％tween20(pbst)的經(jīng)磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌板子并用pbs中5％胎牛血清(fbs；gibco)于室溫下封閉3小時(shí)。將0.5％fbs/pbs中系列稀釋的血清加入板子中并于室溫下溫育兩個(gè)小時(shí)。接著用pbst洗滌微量滴定板并在各孔中加入以1∶10000稀釋于0.5％fbs/pbs中的與辣根過(guò)氧化酶(southernbiotechnologyassociates)偶聯(lián)的100μl山羊抗-小鼠igg(γ鏈特異)。用pbst洗滌微量滴定板并接著用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb；moss)顯色。在wallacvictor3上于450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。通過(guò)從450nm值減去540nm的強(qiáng)度修正板子的光學(xué)缺陷。兩種免疫條件后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答均為強(qiáng)效的，并且兩個(gè)測(cè)定法均可讀出。
該研究驗(yàn)證了與抗原聯(lián)合給予的人tregitopes的鼠同源物的體內(nèi)抑制作用。
5b：tregitopes聯(lián)合給予引起對(duì)聯(lián)合給予變應(yīng)原的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)抑制。
塵螨在人體中引起顯著的變應(yīng)性應(yīng)答，使用屋塵螨裂解物(hdml)的小鼠模型可作為與人類相似的模型。研究本發(fā)明tregitope是否可以體內(nèi)抑制對(duì)hdml的效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。給hladr4轉(zhuǎn)基因小鼠(4-6周，雌性)每周三次皮下(頸背)注射1)50μg單獨(dú)hdml，2)50μghdml+50μgtregitope-289鼠同源物或3)pbs假對(duì)照。在第四臂，通過(guò)每周三次注射50μg使小鼠首先對(duì)hdml預(yù)致敏，接著同時(shí)注射hdml(50μg)和tregitope-289處理小鼠。最后一次注射后一周將小鼠處死。
收獲脾細(xì)胞并如上所述加入鼠il-4elispot板中；向加入板中的細(xì)胞加入(一式三份)：pbs(無(wú)刺激物對(duì)照)、hdm裂解物、純化的hdm抗原derp2和pha。hdmderp2為hdm裂解物的組分。
心臟穿刺獲得血清。通過(guò)上文所述的抗體捕獲elisa測(cè)定hdm抗原的igg抗體定量。將hdm抗原derp2(10μg/ml)置于96-孔微量滴定板中于4℃過(guò)夜。接著用包含0.05％tween20(pbst)的經(jīng)磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌板子并用pbs中5％胎牛血清(fbs；gibco)于室溫下封閉3小時(shí)。將0.5％fbs/pbs中系列稀釋的血清加入板子中并于室溫下溫育兩個(gè)小時(shí)。接著用pbst洗滌微量滴定板并在各孔中加入以1∶10000稀釋于0.5％fbs/pbs中的與辣根過(guò)氧化酶(southernbiotechnologyassociates)偶聯(lián)的100μl山羊抗-小鼠igg(γ鏈特異)。用pbst洗滌微量滴定板并接著用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb；moss)顯色。在wallacvictor3上于450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。通過(guò)從450nm值減去540nm的強(qiáng)度修正板子的光學(xué)缺陷。兩種免疫條件后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pha的應(yīng)答均為強(qiáng)效的，并且兩個(gè)測(cè)定法均可讀出(圖15)。
該研究驗(yàn)證了與dm抗原聯(lián)合給予的人tregitopes的鼠等價(jià)物的體內(nèi)抑制作用。
5c：tregitopes共給予引起對(duì)聯(lián)合給與藥物的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)抑制。
為了檢測(cè)體內(nèi)聯(lián)合給予tregitopes是否能夠抑制對(duì)免疫原性治療性蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，給小鼠每周三次注射hladrb1*0401，用單獨(dú)的50μg免疫原性蛋白藥物制劑(“ipt”)或與50μg的tregitope-289聯(lián)用的制劑或ipt與鼠fc聯(lián)用的制劑。與鼠fc區(qū)聯(lián)合給予ipt可降低il-4應(yīng)答，然而體內(nèi)聯(lián)合給予“ipt”和鼠同源物tregitope-289導(dǎo)致il-4減少更多(由elispot測(cè)定)(圖16)。
實(shí)施例6.fviii-tregitope構(gòu)建體的生成
tregitope與免疫原性蛋白的融合可引起對(duì)免疫原性蛋白外周耐受的誘導(dǎo)。凝血因子viii在患有嚴(yán)重a型血友病的患者中具有免疫原性。生產(chǎn)由凝血因子viii和tregitope的編碼序列組成的嵌合構(gòu)建體(sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress，(1989))。簡(jiǎn)略而言，通過(guò)復(fù)性重疊寡聚核苷酸生成融合于tregitope羧基端的凝血因子viii的編碼區(qū)并亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至dg44cho細(xì)胞并篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)免疫親和柱純化嵌合蛋白并評(píng)價(jià)致耐受性。表6顯示了該嵌合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案。
實(shí)施例7.fviii-多個(gè)-tregitope構(gòu)建體的生成
多個(gè)tregitope可存在于高免疫原性蛋白質(zhì)中以促進(jìn)適應(yīng)性耐受。制備由凝血因子viii和多個(gè)tregitope(s)的編碼序列組成的嵌合構(gòu)建體(sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress，(1989))。簡(jiǎn)略而言，通過(guò)復(fù)性重疊寡聚核苷酸t(yī)regitope生成融合于tregitope羧基端的凝血因子viii編碼區(qū)并亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至dg44cho細(xì)胞并篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)免疫親和柱純化嵌合蛋白并評(píng)價(jià)致耐受性。表7顯示了該嵌合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案。
實(shí)施例8.強(qiáng)化疫苗遞送載體的產(chǎn)生
fc結(jié)合至fc受體增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞遞呈至t和b淋巴細(xì)胞的攝取。位于igg分子fc結(jié)構(gòu)域的tregitope-289可作為遞送抑制信號(hào)。修飾fc以致tregitope-289不再結(jié)合mhc分子和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞使得可以有效靶向候選疫苗而避免抑制作用。降低tregitopes與mhc分子結(jié)合的修飾是可用的。表8顯示了這種修飾。設(shè)計(jì)由各種蛋白或所關(guān)注的表位假蛋白和tregitope修飾的miggfc組成的嵌合構(gòu)建體(sambrook等.，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress，(1989))。簡(jiǎn)略而言，通過(guò)復(fù)性重疊寡聚核苷酸生成蛋白質(zhì)或所關(guān)注的表位假蛋白并亞克隆至tregitope修飾的fc融合表達(dá)質(zhì)粒中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至dg44cho細(xì)胞并篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)蛋白a柱純化嵌合蛋白同聚物并評(píng)價(jià)其免疫原性。表8顯示了該嵌合蛋白的一個(gè)實(shí)例，其中所關(guān)注的假蛋白為衍生自與經(jīng)修飾的fc蛋白融合的epsteinbarr病毒(ebv)的一串免疫原性t細(xì)胞表位，其中tregitope已被修飾而不再結(jié)合mhcii類分子并不能刺激天然調(diào)節(jié)性t細(xì)胞。表8中ebv-tregitope修飾的fcsequence(kbsignalsequence)由下劃線文本表示。tregitope以粗體文本表示。tregitope修飾的氨基酸以陰影文本表示。人fc區(qū)以斜體文本指明。
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等同方案
盡管已聯(lián)系其具體的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解的是其可進(jìn)一步修改。此外，本申請(qǐng)預(yù)期涵蓋本發(fā)明的任何變化、應(yīng)用或調(diào)整，包括本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)實(shí)踐之內(nèi)以及屬于本發(fā)明附加權(quán)利要求范圍的與本公開(kāi)的偏離。
cpch1662968d序列表
<110>epivax,inc.
<120>regulatorytcellepitopes,compositionsanduses
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thralaphelyslyslysaspthrileleuserleuasnalacys
161016151620
gluserasnhisalailealaalaileasngluglyglnasnlys
162516301635
progluilegluvalthrtrpalalysglnglyargthrgluarg
164016451650
leucysserglnasnproprovalleulysarghisglnargglu
165516601665
ilethrargthrthrleuglnseraspglnglugluileasptyr
167016751680
aspaspthrileservalglumetlyslysgluasppheaspile
168516901695
tyraspgluaspgluasnglnserproargserpheglnlyslys
170017051710
thrarghistyrpheilealaalavalgluargleutrpasptyr
171517201725
glymetserserserprohisvalleuargasnargalaglnser
173017351740
glyservalproglnphelyslysvalvalpheglngluphethr
174517501755
aspglyserphethrglnproleutyrargglygluleuasnglu
176017651770
hisleuglyleuleuglyprotyrileargalagluvalgluasp
177517801785
asnilemetvalthrpheargasnglnalaserargprotyrser
179017951800
phetyrserserleuilesertyrglugluaspglnargglngly
180518101815
alagluproarglysasnphevallysproasngluthrlysthr
182018251830
tyrphetrplysvalglnhishismetalaprothrlysaspglu
183518401845
pheaspcyslysalatrpalatyrpheseraspvalaspleuglu
185018551860
lysaspvalhisserglyleuileglyproleuleuvalcyshis
186518701875
thrasnthrleuasnproalahisglyargglnvalthrvalgln
188018851890
gluphealaleuphephethrilepheaspgluthrlyssertrp
189519001905
tyrphethrgluasnmetgluargasncysargalaproserasn
191019151920
ileglnmetgluaspprothrphelysgluasntyrargphehis
192519301935
alaileasnglytyrilemetaspthrleuproglyleuvalmet
194019451950
alaglnaspglnargileargtrptyrleuleusermetglyser
195519601965
asngluasnilehisserilehispheserglyhisvalphethr
197019751980
valarglyslysgluglutyrlysmetalaleutyrasnleutyr
198519901995
proglyvalphegluthrvalglumetleuproserlysalagly
200020052010
iletrpargvalglucysleuileglygluhisleuhisalagly
201520202025
metserthrleupheleuvaltyrserasnlyscysglnthrpro
203020352040
leuglymetalaserglyhisileargasppheglnilethrala
204520502055
serglyglntyrglyglntrpalaprolysleualaargleuhis
206020652070
tyrserglyserileasnalatrpserthrlysglupropheser
207520802085
trpilelysvalaspleuleualaprometileilehisglyile
209020952100
lysthrglnglyalaargglnlyspheserserleutyrileser
210521102115
glnpheileilemettyrserleuaspglylyslystrpglnthr
212021252130
tyrargglyasnserthrglythrleumetvalphepheglyasn
213521402145
valaspserserglyilelyshisasnilepheasnproproile
215021552160
ilealaargtyrileargleuhisprothrhistyrserilearg
216521702175
serthrleuargmetgluleumetglycysaspleuasnsercys
218021852190
sermetproleuglymetgluserlysalaileseraspalagln
219522002205
ilethralasersertyrphethrasnmetphealathrtrpser
221022152220
proserlysalaargleuhisleuglnglyargserasnalatrp
222522302235
argproglnvalasnasnprolysglutrpleuglnvalaspphe
224022452250
glnlysthrmetlysvalthrglyvalthrthrglnglyvallys
225522602265
serleuleuthrsermettyrvallysglupheleuileserser
227022752280
serglnaspglyhisglntrpthrleuphepheglnasnglylys
228522902295
vallysvalpheglnglyasnglnaspserphethrprovalval
230023052310
asnserleuaspproproleuleuthrargtyrleuargilehis
231523202325
proglnsertrpvalhisglnilealaleuargmetgluvalleu
233023352340
glycysglualaglnaspleutyrglugluglntyrasnserthr
234523502355
tyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpglu
236023652370
gluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval
237523802385
leuhisglnasptrpglugluglntyrasnserthrtyrargval
239023952400
valservalleuthrvalleuhisglnasptrpglugluglntyr
240524102415
asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln
242024252430
asptrp
2435
<210>3
<211>628
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>來(lái)源
<223>/注="人工序列描述:
合成結(jié)構(gòu)"
<400>3
metvalprocysthrleuleuleuleuleualaalaalaleualapro
151015
thrglnthrargalagluasnlysglyglyaspglnglyproproleu
202530
metthraspglyglyglyglyproglyproglyproleuserserser
354045
leuglyleualaleuleuleuleuleuleualaleuleuphetrpleu
505560
tyrilevalmetserasptrpthrglyglyalaleuleuvalleutyr
65707580
serphealaleumetleuileileileileleuileilepheilephe
859095
argargaspleuleucysproleuglyalaleucysileleuleuleu
100105110
metilethrleuleuleuilealaleutrpasnleuhisglyglnala
115120125
leupheleuglyilevalleupheilepheglycysleuleuvalleu
130135140
glyiletrpiletyrleuleuglumetleutrpargleuglyalathr
145150155160
iletrpglnleuleualaphepheleualaphepheleuaspleuile
165170175
leuleuileilealaleutyrleuglnglnasntrptrpthrleuleu
180185190
valaspleuleutrpleuleuleupheleualaileleuiletrpmet
195200205
tyrtyrhisglyglnarghisseraspgluhishishisaspaspser
210215220
leuprohisglyproglyproglyglyproarghisargaspglyval
225230235240
argargproglnlysargprosercysileglycyslysglyprogly
245250255
proglyilealagluglyleuargalaleuleualaargserhisval
260265270
gluargthrglyproglyproglyalaglyvalphevaltyrglygly
275280285
serlysthrserleutyrasnleuargargglythralaleualaile
290295300
glyproglyproglythrserleutyrasnleuargargglythrala
305310315320
leualaileproglncysargleuthrproleuserargleuglypro
325330335
glyproglyarggluserilevalcystyrphemetvalpheleugln
340345350
thrhisilephealagluvalleuglyproglyproglyalailelys
355360365
aspleuvalmetthrlysproalaprothrcysasnileargvalgly
370375380
proglyproglyglyproglnargargglyglyaspasnhisglyarg
385390395400
glyargasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu
405410415
leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr
420425430
leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval
435440445
serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval
450455460
gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnasnasnser
465470475480
thrasnargalavalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu
485490495
asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala
500505510
proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro
515520525
glnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasngln
530535540
valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala
545550555560
valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr
565570575
proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu
580585590
thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser
595600605
valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser
610615620
leuserprogly
625
<210>4
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>4
glugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval
151015
leuhisglnasptrp
20
<210>5
<211>26
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>5
proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval
151015
thrvalproserserserleuglythrgln
2025
<210>6
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>6
proglyleuvalargproserglnthrleuserleuthrcysthr
151015
<210>7
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>7
glyglyleuvalglnproglyglyserleuargleusercysalaala
151015
serglyphethrphe
20
<210>8
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>8
glyglyleuvalglnproglyargserleuargleusercysalaala
151015
serglyphethrphe
20
<210>9
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>9
glyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe
151015
<210>10
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>10
trpsertrpvalargglnproproglyargglyleuglutrpile
151015
<210>11
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>11
trpsertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile
151015
<210>12
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>12
methistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
151015
<210>13
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>13
methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
151015
<210>14
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>14
valaspthrserlysasnglnpheserleuargleuserservalthr
151015
alaalaaspthrala
20
<210>15
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>15
asnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthrala
151015
valtyrtyrcysala
20
<210>16
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>16
pheglnhistrpglyglnglythrleuvalthrvalserser
1510
<210>17
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>17
pheaspleutrpglyargglythrleuvalthrvalserser
1510
<210>18
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>18
pheaspiletrpglyglnglythrmetvalthrvalserser
1510
<210>19
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>19
pheasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser
1510
<210>20
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>20
pheaspprotrpglyglnglythrleuvalthrvalserser
1510
<210>21
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>21
metaspvaltrpglyglnglythrleuvalthrvalserser
1510
<210>22
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>22
metaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserser
1510
<210>23
<211>24
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>23
leuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplysvalasp
151015
asnalaleuglnserglyasnser
20
<210>24
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>24
lysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser
1510
<210>25
<211>13
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>25
aspileglnmetthrglnserproserserleuserala
1510
<210>26
<211>13
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>26
gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleu
1510
<210>27
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>27
glyaspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileser
151015
<210>28
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>28
leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleu
1510
<210>29
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>29
leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleu
1510
<210>30
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>30
leuleuiletyrglyalaserserargalathrglyileproasp
151015
<210>31
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>31
glythraspphethrleuthrileserserleuglnprogluasp
151015
<210>32
<211>13
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>32
sertyrgluleuthrglnproproservalservalser
1510
<210>33
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>33
glyglnserilethrilesercysthrglythrserseraspval
151015
<210>34
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>34
valsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
1510
<210>35
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>35
valhistrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleu
1510
<210>36
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>36
valsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleu
1510
<210>37
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>37
leumetiletyrgluvalserasnargproserglyvalproasp
151015
<210>38
<211>19
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>38
leulyslystyrleutyrgluilealaargarghisprotyrphetyr
151015
alaproglu
<210>39
<211>22
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>39
alaprogluleuleuphephealalysargtyrlysalaalaphethr
151015
glucyscysglnalaala
20
<210>40
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>40
hisproasptyrservalvalleuleuleuargleualalysthrtyr
151015
gluthrthrleuglu
20
<210>41
<211>15
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>41
hisproasptyrservalvalleuleuleuargleualalysthr
151015
<210>42
<211>14
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>42
leuleuleuargleualalysthrtyrgluthrthrleuglu
1510
<210>43
<211>25
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>43
leuglyglutyrlyspheglnasnalaleuleuvalargtyrthrlys
151015
lysvalproglnvalserthrprothr
2025
<210>44
<211>22
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>44
proalaaspvalalaileglnleuthrpheleuargleumetserthr
151015
glualaserglnasnile
20
<210>45
<211>19
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>45
thrglyasnleulyslysalaleuleuleuglnglyserasngluile
151015
gluilearg
<210>46
<211>16
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>46
aspglyaspphetyrargalaaspglnproargseralaproserleu
151015
<210>47
<211>25
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>47
serlysglumetalathrglnleualaphemetargleuleualaasn
151015
tyralaserglnasnilethrtyrhis
2025
<210>48
<211>19
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>48
valglnhisileglnleuleuglnlysasnvalargalaglnleuval
151015
aspmetlys
<210>49
<211>23
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>49
glygluphetrpleuglyasnasptyrleuhisleuleuthrglnarg
151015
glyservalleuargvalglu
20
<210>50
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>50
glnserglyleutyrpheilelysproleulysalaasnglnglnphe
151015
leuvaltyrcysglu
20
<210>51
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>51
thrgluphetrpleuglyasnglulysilehisleuileserthrgln
151015
seralaileprotyr
20
<210>52
<211>25
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>52
asnalaasnphelysphethrasphisleulystyrvalmetleupro
151015
valalaaspglnaspglncysilearg
2025
<210>53
<211>26
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>53
glysergluvalvallysargproargargtyrleutyrglntrpleu
151015
glyalaprovalprotyrproaspproleu
2025
<210>54
<211>16
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>54
procysglntrptrpargprothrthrthrserthrargcyscysthr
151015
<210>55
<211>22
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>55
proglygluasppheargmetalathrleutyrserargthrglnthr
151015
proargalagluleulys
20
<210>56
<211>18
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>56
aspglyserleutrpargtyrargalaglyleualaalaserleuala
151015
glypro
<210>57
<211>21
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>57
valthrglyvalvalleupheargglnleualaproargalalysleu
151015
aspalaphepheala
20
<210>58
<211>19
<212>prt
<213>人（homosapiens）
<400>58
lysalasertyrleuaspcysileargalailealaalaasngluala
151015
aspalaval
<210>59
<211>9
<212>prt
<213>人流感病毒
<400>59
proargtyrvallysglnasnthrleu
15
<210>60
<211>9
<212>prt
<213>人流感病毒
<400>60
argtyrvallysglnasnthrleulys
15
<210>61
<211>9
<212>prt
<213>人流感病毒
<400>61
tyrvallysglnasnthrleulysleu
15
<210>62
<211>9
<212>prt
<213>人流感病毒
<400>62
vallysglnasnthrleulysleuala
15
<210>63
<211>9
<212>prt
<213>人流感病毒
<400>63
lysglnasnthrleulysleualathr
15
<210>64
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>來(lái)源
<223>/注="人工序列描述:
合成引物"
<400>64
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<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>來(lái)源
<223>/注="人工序列描述:
合成引物"
<400>65
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<210>66
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>來(lái)源
<223>/注="人工序列描述:
合成引物"
<400>66
ctagcctctggaatcctttctcttg25
<210>67
<211>21
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>來(lái)源
<223>/注="人工序列描述:
合成肽"
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alapheileglutyr
20
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<213>人工序列
<220>
<221>來(lái)源
<223>/注="人工序列描述:
合成肽"
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20
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<213>大鼠（rattusnorvegicus）
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151015
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20
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<213>狒狒（papioanubisanubis）
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20
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<213>小鼠（mussp.）
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20
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<213>泛類人猿（pantroglodytes）
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valhisglnasptrp
20
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<213>白瞼猴（cercocebustorquatusatys）
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<213>泛類人猿（pantroglodytes）
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151015
leuhisglnasptrp
20
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<213>貓（feliscatus）
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leuhisglnasptrp
20
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<213>泛類人猿（pantroglodytes）
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valhisglnasptrp
20
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<213>駱駝（camelusdromedarius）
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<213>白瞼猴（cercocebustorquatusatys）
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<213>猩猩（pongopygmaeus）
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valhisglnasptrp
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<213>野豬（susscrofa）
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20
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<213>白瞼猴（cercocebustorquatusatys）
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<213>馬（equuscaballus）
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<213>狒狒（papioanubisanubis）
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151015
glnasptrp
<210>84
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<213>馬（equuscaballus）
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<213>海豚（tursiopstruncatus）
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<213>大鼠（rattusnorvegicus）
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<213>馬（equuscaballus）
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glualaglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuproile
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glnhisglnasptrp
20
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<213>牛（bostaurus）
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<213>狗（canisfamiliaris）
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gluhisglnasptrp
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<213>倉(cāng)鼠（cricetulusmigratorius）
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glnasptrp
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<213>小鼠（musmusculus）
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methisglnasptrp
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<213>狗（canisfamiliaris）
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glyhisglnasptrp
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<213>鼬鼠（mustelavison）
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<211>21
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<213>海豚（tursiopstruncatus）
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<213>綿羊（ovisaries）
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glnhisglnasptrp
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