本發(fā)明克隆表達(dá)了一種L-α-羥酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

L-α-羥酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一種以FMN(FAD)為輔酶的脫氫酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties of crystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a long chain alpha-hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95to glycine.J Biol Chem.1996 8；271(45):28300-28305)。可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學(xué)純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，綠色氣球菌(Aerococcus viridians)，鏈球菌屬(Streptococcus sp.)，片球菌屬(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis),運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和過氧化醋桿菌(Acetobacter peroxidans)等細(xì)菌中克隆表達(dá)得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中檢測到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)

本發(fā)明首次從Kerstersia gyiorum DSM 16618中克隆表達(dá)出一種新型的L-α-羥酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(S)-α-羥酸，而且可以氧化(S)-α-羥酸酯，可應(yīng)用于光學(xué)純(R)-α-羥酸酯和(R)-α-羥酸的制備。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)中克隆得到了一種以FMN為輔酶的L-α-羥酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性，并進(jìn)行了應(yīng)用研究

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明L-α-羥酸氧化酶基因的來源菌株為：Proteus mirabilis ATCC 25933，購自美國ATCC菌種庫。

2、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

提取Proteus mirabilis ATCC 25933菌體基因組總DNA。設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出L-α-羥酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、L-α-羥酸氧化酶表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、L-α-羥酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

以L-乳酸為底物研究pH對本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

以L-乳酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

L-α-羥酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、L-對羥基苯乳酸、L-丹參素、L-扁桃酸。

酶活測定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進(jìn)行。

5、L-α-羥酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(S)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應(yīng)的α-酮酸酯，(R)-α-羥酸酯不被氧化。

產(chǎn)物(R)-α-羥酸酯的光學(xué)純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：

對映體過量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_S為反應(yīng)后(S)-對映體的峰面積，S_R為反應(yīng)后(R)-對映體的液相色譜峰面積，S₀為反應(yīng)前(S)-和(R)-對映體的液相色譜峰面積之和。

產(chǎn)物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進(jìn)樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細(xì)辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細(xì)辛醇酯、對羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)表明的有益之處：從奇異變形桿菌中克隆表達(dá)出一種新型的L-α-羥酸氧化酶，該酶可以氧化(S)-α-羥酸和(S)-α-羥酸酯，可用于規(guī)模化制備手性純(R)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。

具體實施方式

實施例1

本實施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Proteus mirabilis ATCC 25933DNA的提取

將Proteus mirabilis ATCC 25933菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計

設(shè)計引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAAACATACATTGTTAAAAAC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGATCGTTTTTAACAATGTATGTTTCAT 3'

(2)PCR擴(kuò)增

用以上合成的兩條引物，以Proteus mirabilis ATCC 25933的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本步驟中擴(kuò)增體系為：

擴(kuò)增程序為：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應(yīng)30個循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該L-α-羥酸氧化酶的基因序列，如SEQID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2

本實施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進(jìn)行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進(jìn)行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實施例3

本實施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的最適溫度。以L-乳酸為底物，將底物與pH為8.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定L-α-羥酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。

實施例4

本實施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的最適pH值。以L-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，50℃水浴15min測定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 8.0條件下L-α-羥酸氧化酶酶活最高。

實施例5

本實施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶與不同底物的反應(yīng)特性列于表2中。

表2 L-α-羥酸氧化酶對不同底物的活性

實施例6

根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當(dāng)在反應(yīng)時間充分時，可以得到各類高光學(xué)純的(R)-α-羥酸酯，該酶的光學(xué)專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種氧化酶及其應(yīng)用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1194

<212> DNA

<213> Proteus mirabilis ATCC 25933

<400> 1

atgaaacata cattgttaaa aacgaccgca attgctatgg cattaagtgt gggagttgta 60

caagcagctg aatataaagc aagtaccgca gaaggtccaa tcaaaatagt taatttaaaa 120

gccatggaag cacaggtaga agcaaatatg gataaaggtg ctttcggtta tattcgtggc 180

ggggctgagg atgaaaataa tttaagagca aatactcgag catttgataa aaaatatatt 240

atgccccgtt cattacaagg tattgagttt tcagatatta atctaaaaac agaattttta 300

ggtattaaat tagatacgcc tattattcag gcaccgatgg cagcacaagg gcttgctcat 360

caacaaggcg aagttgccac agcaaaaggt atggcgaaag cgggttctat tttctcatta 420

agtacttatg gtaataaaac cattaaagaa gttgcgcaag cacaaccggg ttatccgttc 480

ttttttcagc tatatatgag taaaaacgac gcgtttaatc agtatatttt atcgcaagca 540

aaacagtatg gcgcgaaagg cattattatg actatcgact cctctgttgg tggttatcgt 600

gaagatgatg tcaaaaacaa ctttcaattt ccgttaggtt ttgccaattt ggaagcattc 660

gccaaaatca gtgatgataa atcaaaaaca ggtaaaggtt cgggtattag tgaaatctat 720

gctcaagcta aacaagcatt tactcctgct gatattcaat atgtgaaaaa gatgtcaggt 780

ttaccagtca ttgtgaaagg tattgaatca cctgaagatg ccgatactgc aattaaagcg 840

ggtgctgatg cgatttgggt gtctaatcat ggtggtcgtc agttagatag tgcaccagca 900

accattgatg tattgccagc tattgctaaa gtcgtgaaca aacgtgttcc tatcgttttc 960

gatagtggtg ttcgtcgtgg ctcacatgtc tttaaagcgt tagcgagtgg tgcagatgtt 1020

gttgctgtgg ggcgtccaat tctttatgga ttaaatttag gcggtgctga aggtgttaat 1080

tcagttatcc agcaattaaa taaagagtta agaattaata tgatgttagg tggtgcaaga 1140

aacgtcaaag aaattcaagc aacgcacttg tatacagatg ctgactttaa ataa 1194

<210> 2

<211> 397

<212> PRT

<213> Proteus mirabilis ATCC 25933

<400> 2

Met Lys His Thr Leu Leu Lys Thr Thr Ala Ile Ala Met Ala Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Val Gln Ala Ala Glu Tyr Lys Ala Ser Thr Ala Glu Gly

20 25 30

Pro Ile Lys Ile Val Asn Leu Lys Ala Met Glu Ala Gln Val Glu Ala

35 40 45

Asn Met Asp Lys Gly Ala Phe Gly Tyr Ile Arg Gly Gly Ala Glu Asp

50 55 60

Glu Asn Asn Leu Arg Ala Asn Thr Arg Ala Phe Asp Lys Lys Tyr Ile

65 70 75 80

Met Pro Arg Ser Leu Gln Gly Ile Glu Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys

85 90 95

Thr Glu Phe Leu Gly Ile Lys Leu Asp Thr Pro Ile Ile Gln Ala Pro

100 105 110

Met Ala Ala Gln Gly Leu Ala His Gln Gln Gly Glu Val Ala Thr Ala

115 120 125

Lys Gly Met Ala Lys Ala Gly Ser Ile Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly

130 135 140

Asn Lys Thr Ile Lys Glu Val Ala Gln Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Phe

145 150 155 160

Phe Phe Gln Leu Tyr Met Ser Lys Asn Asp Ala Phe Asn Gln Tyr Ile

165 170 175

Leu Ser Gln Ala Lys Gln Tyr Gly Ala Lys Gly Ile Ile Met Thr Ile

180 185 190

Asp Ser Ser Val Gly Gly Tyr Arg Glu Asp Asp Val Lys Asn Asn Phe

195 200 205

Gln Phe Pro Leu Gly Phe Ala Asn Leu Glu Ala Phe Ala Lys Ile Ser

210 215 220

Asp Asp Lys Ser Lys Thr Gly Lys Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ile Tyr

225 230 235 240

Ala Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Pro Ala Asp Ile Gln Tyr Val Lys

245 250 255

Lys Met Ser Gly Leu Pro Val Ile Val Lys Gly Ile Glu Ser Pro Glu

260 265 270

Asp Ala Asp Thr Ala Ile Lys Ala Gly Ala Asp Ala Ile Trp Val Ser

275 280 285

Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Ser Ala Pro Ala Thr Ile Asp Val

290 295 300

Leu Pro Ala Ile Ala Lys Val Val Asn Lys Arg Val Pro Ile Val Phe

305 310 315 320

Asp Ser Gly Val Arg Arg Gly Ser His Val Phe Lys Ala Leu Ala Ser

325 330 335

Gly Ala Asp Val Val Ala Val Gly Arg Pro Ile Leu Tyr Gly Leu Asn

340 345 350

Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Asn Ser Val Ile Gln Gln Leu Asn Lys

355 360 365

Glu Leu Arg Ile Asn Met Met Leu Gly Gly Ala Arg Asn Val Lys Glu

370 375 380

Ile Gln Ala Thr His Leu Tyr Thr Asp Ala Asp Phe Lys

385 390 395