專利名稱：蝶呤類一氧化氮合酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到設(shè)計(jì)與合成具有控制體內(nèi)一氧化氮(NO)過多產(chǎn)生的蝶呤類衍生物，尤其是具有抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶作用的蝶呤類衍生物，是用以制備預(yù)防和治療因體內(nèi)NO水平升高而介導(dǎo)的疾病的藥物。
背景技術(shù)：
NO作為一種新型信號(hào)分子，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等功能；作為—效應(yīng)分子，參與炎癥與組織損傷恢復(fù)，在呼吸、消化、循環(huán)、免疫等全身多系統(tǒng)的生理、病理生理及有關(guān)臨床疾病中起著重要作用。
NO的生物合成是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)作用下與O2結(jié)合，生成左旋瓜氨酸(L-Cit)，并釋放出一氧化氮。NOS含有4個(gè)輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)、血紅素(鐵原IX)和四氫生物蝶呤(BH4)。NOS為一個(gè)雙區(qū)結(jié)構(gòu)，C端為還原酶區(qū)，含有NADPH、FAD、FMN同鈣調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；N端為氧化酶區(qū)，含有血紅素、BH4同左旋精氨酸的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)NOS存在的細(xì)胞類型來分共3種，即一類包括神經(jīng)元性NOS(nNOS)和內(nèi)皮細(xì)胞性NOS(eNOS)，另一類是iNOS，包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)性NOS和巨噬細(xì)胞性NOS(MacNOS)。而其中iNOS是體內(nèi)一氧化氮水平異常增高的最大的元兇，因?yàn)閕NOS可被細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等許多體液性物質(zhì)所誘導(dǎo)，而iNOS是三種一氧化氮合酶中唯一的非鈣依賴型NOS，它與鈣調(diào)節(jié)蛋白有很強(qiáng)的親合力，即使在極低的Ca2+濃度下也能引起快通道開放，啟動(dòng)一氧化氮合成，而且iNOS的mRNA的半衰期特別長(zhǎng)，一旦被誘導(dǎo)合成即可長(zhǎng)時(shí)間翻譯合成iNOS，所以iNOS一旦被誘導(dǎo)即可持續(xù)產(chǎn)生大量的NO，直至底物耗盡。而大量的NO可直接造成組織和細(xì)胞的損害甚至死亡，NO可直接與帶巰基的功能蛋白結(jié)合，從而抑制其正常的生理功能，NO還能抑制ATP的生成，從而影響細(xì)胞的能量代謝，NO還可抑制DNA的合成并誘發(fā)基因突變。
過量的一氧化氮導(dǎo)致了許多疾病的產(chǎn)生，加劇了疾病的病理進(jìn)程，但NO在某些方面也具有保護(hù)作用，例如內(nèi)皮細(xì)胞性NOS釋放出的一氧化氮能舒張血管對(duì)抗交感神經(jīng)興奮引起的血管收縮。研究表明nNOS、eNOS和iNOS在精氨酸和BH4結(jié)合位點(diǎn)上存在差異，這為我們開發(fā)應(yīng)用iNOS的選擇性抑制劑而保留nNOS、eNOS的生理功能提供了方向。
目前NOS抑制劑主要有以內(nèi)源性底物左旋精氨酸為靶點(diǎn)的L-Arg類似物，而以NOS輔助因子FAD、FMN、血紅素、BH4為靶點(diǎn)的化合物亦有文獻(xiàn)報(bào)道。其中BH4在NO的生物合成又扮演了極其重要的角色，它能增加NOS的活性和穩(wěn)定性，因而以BH4為靶點(diǎn)的化合物同其他NOS抑制劑相比在選擇性上有著極大的優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容
巨噬細(xì)胞iNOS為一個(gè)同型二聚體酶，由兩個(gè)相同的130000u(130kDa)亞基組成，亞基二聚體化為iNOS活性所必需。用凝膠濾過分離的iNOS亞基僅可結(jié)合FAD、FMN和CaM，但不含血紅素和BH4，分離所得的亞基不能產(chǎn)生NO，只可催化電子從NADPH向接受體如細(xì)胞色素C傳遞。亞基聚合不能自動(dòng)發(fā)生，而需要BH4、L-精氨酸和血紅素共同存在，上述物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)水平不足，將影響iNOS單體(亞基)聚合成有活性的二聚體。iNOS亞基聚合的一般過程如下合成的酶蛋白起初為單體，含有一個(gè)非功能性的氧化酶區(qū)和一個(gè)功能性的還原酶區(qū)。后者與FAD、FMN及CaM結(jié)合。在L-精氨酸存在的情況下，BH4、血紅素(heme)與兩個(gè)單體的氧化酶區(qū)相互作用形成一個(gè)二聚體。二聚體化才使iNOS具有催化NO合成的功能。在這個(gè)過程中，BH4是必不可缺的，而蝶啶類化合物具有與BH4相同母核，能競(jìng)爭(zhēng)性的與NOS結(jié)合，降低NOS的活性和穩(wěn)定性，從而降低體內(nèi)一氧化氮水平。另外，BH4同時(shí)也是一些芳香氨基酸羥化酶(如苯丙氨酸羥化酶、酪氨酸羥化酶、色氨酸羥化酶等)的輔酶，而這些芳香氨基酸是構(gòu)成神經(jīng)遞質(zhì)的重要組分。但是，BH4作為NOS的輔酶的結(jié)合位點(diǎn)與作為芳香氨基酸羥化酶的輔酶的結(jié)合位點(diǎn)是不同的[Tayeh，M.A.，and Marletta，M.A.(1989)J.Biol.Chem.264，19654-19658]，而且有文獻(xiàn)報(bào)道以BH4為靶點(diǎn)的蝶啶類NOS抑制劑并不抑制苯丙氨酸羥化酶的活性[Bmmel，HM.，Reif.A.，et al，(1998)J.Biol.Chem.273，33142-33179]。在我們先前專利中(姚其正，王秋娟等，中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00310106588.0；2003-12-10)已合成了一批具有iNOS抑制活性的4-氨基和4-取代氨基蝶啶化合物，但是2，4-二氨基和2-氨基-4-取代氨基蝶啶類同抗葉酸的二氫葉酸還原酶和二氫蝶呤還原酶的抑制劑結(jié)構(gòu)非常相似，因此2，4-二氨基和2-氨基-4-取代氨基蝶啶類化合物可能對(duì)葉酸和BH4的生物合成有抑制作用。為此，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成一批2-氨基-4-羰基(或烷氧基)蝶啶(蝶呤)化合物，而2-氨基-4-羰基蝶啶類可作為芳香氨基酸羥化酶中輔酶BH4的替代物[Levine，R.A.；Zoephel，G..P.；Curtius，H.-C.In Biochemical and Clinical Aspect of Pterdines；Curtius，H.-C.，Pfleiderer，W.，Wacher，H.Berline，1985；Vol.4]。另外，2-氨基-4-羰基蝶啶類化合物對(duì)二氫葉酸還原酶和二氫蝶呤還原酶沒有抑制作用，而且其與BH4相似程度較2-氨基-4-氨基蝶啶類更高，從而蝶呤類化合物具有對(duì)NOS更高的親合力，因此蝶呤類較2-氨基-4-氨基蝶啶類具有更高的iNOS抑制選擇性。在iNOS結(jié)構(gòu)中BH4的2-位氨基同血紅素以氫鍵相連，本發(fā)明對(duì)蝶呤2-位氨基用芳香等?；M(jìn)行了修飾，期望能干擾血紅素在NO合成中的電子轉(zhuǎn)移作用，以進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)iNOS抑制活性。這些蝶呤類化合物經(jīng)用iNOS進(jìn)行生物活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)具有抑制NO產(chǎn)生的作用，可用作治療因體內(nèi)NO升高而引發(fā)的疾病的藥物。
下列通式(I)表示的蝶呤類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 R1代表C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；C1-C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代或無取代的芳基或雜環(huán)芳基；R2代表氫；C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；芳基取代的C1-C5直鏈或支鏈的烷烴；氨基或取代氨基取代的C1-C5直鏈或支鏈的烷烴；R3代表氫；羥基取代或無取代基的C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；C1-C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代或無取代的芳基；R4代表氫；苯基、C1-C5直鏈或支鏈烷基；C1-C5直鏈或支鏈烷氧基；羥基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；前述蝶呤類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中較好的是R1代表C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；苯基、對(duì)甲氧基苯基、對(duì)甲基苯基、芐基、β-苯乙基、吡啶基。
R2代表氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、芐基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、二甲氨基丙基、二乙氨基乙基、鄰苯二甲酰亞氨基乙基、丁二酰亞氨基乙基。
R3代表氫、苯基、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、對(duì)甲氧基苯基、對(duì)甲基苯基。
R4代表氫、甲基、乙基、羥基、甲氧基、氨基。
前述蝶呤類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中更為合適的是R1代表苯基、對(duì)甲氧基苯基、吡啶基；R2代表甲基、異丙基、芐基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、鄰苯二甲酰亞氨基乙基、丁二酰亞氨基乙基；R3代表氫、苯基、、對(duì)甲氧基苯基、對(duì)甲基苯基；R4代表氫、甲基、乙基、羥基。
以上所述的烷基、烷氧基和胺基中的烷基可以是直鏈烷基，或是有側(cè)鏈的烷基，或是環(huán)狀烷基。在分子式中如果出現(xiàn)有立體異構(gòu)體和互變異構(gòu)體，則本發(fā)明中的化合物包括這些全部的立體異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。
前述通式(I)表示的蝶呤類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶藥物中的應(yīng)用。
所述通式(I)表示的蝶呤類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶藥物中的較具體的應(yīng)用是制備在敗血性或出血性休克或用細(xì)胞毒素進(jìn)行腫瘤化學(xué)治療和肝硬化或肝萎縮和/或肝功能衰退時(shí)所引起的血壓下降或/和止血障礙藥物。更具體的應(yīng)用，是制備預(yù)防和治療異體器官和組織移植的排斥反應(yīng)藥物以及胰島素依賴型糖尿病藥物；是制備預(yù)防和治療炎癥疾病的藥物；是制備預(yù)防和治療細(xì)胞毒素進(jìn)行腫瘤化學(xué)治療、化學(xué)藥物或化學(xué)物質(zhì)以及慢性肝炎引發(fā)的多種肝損傷、肝功能衰退以及預(yù)防和治療心肌梗塞損傷、病毒型心肌炎的藥物；是制備預(yù)防和治療腦缺血后的炎癥反應(yīng)、病毒性腦炎以及早老性癡呆癥的藥物；是制備預(yù)防和治療病毒性神經(jīng)退化疾病及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛的藥物。
藥物組合物，其中含有治療有效量的通式(I)表示的蝶呤類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，并含有常規(guī)藥用載體。
本發(fā)明所用的通式(I)表示的化合物可以是它們的中性形式，也可以是和無機(jī)酸或有機(jī)酸加成形成相應(yīng)的鹽使用，對(duì)藥物中所用的酸包括有如鹽酸、溴化氫、磷酸硝酸、硫酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、草酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、乙二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、琥珀酸酸、富馬酸、苯丙酸、葡糖酸、異煙酸、抗壞血酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸以及氨基酸等。通式(II)表示的化合物可以和多摩爾的酸加成形成相應(yīng)的鹽，這些多摩爾的酸可以是單一的也可以是組合的，這主要根據(jù)需要用相應(yīng)的溶劑或稀釋劑的情況來定。這些加成的鹽可通過陰離子交換去除。對(duì)于通式(II)表示的化合物中含有酸性組分的化合物，也可和相應(yīng)的無機(jī)堿或有機(jī)堿或堿性氨基酸加成形成相應(yīng)的鹽，例如對(duì)于這些鹽有堿金屬的鹽，特別有效的是鈉、鉀和銨鹽，以及與有機(jī)胺和堿性氨基酸等組成相應(yīng)的鹽。
本發(fā)明所涉及的蝶呤類衍生物和它們相應(yīng)的鹽可和適當(dāng)?shù)妮o料(包括相應(yīng)的醫(yī)藥上允許應(yīng)用的賦形劑、緩釋劑、粘和劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、香料、色素等)作成片劑或膠囊，也可作成相應(yīng)的針劑用于臨床。
本發(fā)明通式(I)表示的蝶呤類化合物是本次發(fā)明新合成的化合物，新合成的化合物均經(jīng)過各種物理方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，包括1H-NMR、MS和元素分析。
通式(I)化合物的合成有以下步驟
1、取代酮肟(A)的合成 式中R3＝H；CH3；CH3O等。
相應(yīng)的取代苯乙酮在二氧六環(huán)和水的混合溶液中，用二氧化硒氧化羰基的α位得二羰基化合物，接著和丙酮肟反應(yīng)得到取代酮肟(A)。
2、2-氨基-4-羥基-6-取代蝶啶(B)的合成 在回流的2，5，6-三氨基嘧啶酮鹽酸鹽甲醇混懸液中，滴加取代酮肟(A)的甲醇溶液，反應(yīng)3小時(shí)后即可區(qū)域選擇性的得到6-取代蝶啶化合物(B)。
3、2-取代酰氨基-4-羥基-6-取代蝶啶(C)的合成 蝶啶化合物(B)與相應(yīng)的酰氯在吡啶中室溫下反應(yīng)即可得到(C)。
4、目標(biāo)化合物(D)的合成
化合物C和相應(yīng)的醇在無水二氧六環(huán)中，加入三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯，即可反應(yīng)得到目標(biāo)化合物(D)。
本發(fā)明可用于制備預(yù)防和治療敗血性或出血性休克、器官移植的排斥反應(yīng)、腦缺血后的炎癥反應(yīng)、病毒性腦炎以及早老性癡呆癥的藥物具體實(shí)施方式
(1)、化合物制備2-乙酰氨基-4-異丙氧基-6-對(duì)甲氧基苯基蝶啶(1)將0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為-對(duì)甲氧基苯基)和三苯基磷1.17g(4.46mmol)加入到無水二氧六環(huán)中，趁熱加入偶氮二甲酸二乙酯0.77g(4.46mmol)，不溶固體逐漸溶解，待溶液澄清后，加入無水異丙醇0.27g(2.23mmol)，攪拌加熱回流24小時(shí)，減壓除去二氧六環(huán)，殘留物經(jīng)硅膠柱層析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]純化，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得0.25g黃色固體1，產(chǎn)率31.7％，m.p.240～242℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.36(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，7.04(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，5.61(m，1H，-CH)，3.88(s，3H，-OCH3)，2.72(s，3H，-COCH3)，1.55(d，6H，-CH3).ESI-MS(70V)376.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C18H19N5O3*0.25H2O(353.38)C60.41，H5.49，N19.57；FoundC60.39，H5.19，N19.83.
2-乙酰氨基-4-異丙氧基-6-對(duì)甲基苯基蝶啶(2)按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為-對(duì)甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和異丙醇，0.20g黃色固體2，產(chǎn)率25.2％；m.p.253～255℃.1HNMR(AV-300 CDCl3)δ9.38(s，1H，7-H)，8.13(bs，1H，2-NH)，8.03(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.34(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.58(m，1H，-CH)，2.72(s，3H，-COCH3)2.43(s，3H，Ph-CH3)，1.55(d，6H，-CH3).ESI-MS360.1[M+Na]+.AnalCalcd for C18H19N5O2*0.25H2O(341.88)C63.23，H5.74，N20.48；FoundC63.03，H5.44，N20.672-乙酰氨基-4-芐氧基-6-對(duì)甲氧基苯基蝶啶(3)。
按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為對(duì)甲氧基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和苯甲醇，得0.28g黃色固體，產(chǎn)率31.3％，m.p.235～236℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.38(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝9.0Hz，2H，Ph-H)，7.58(d，2H，Ph-H)，7.39(m，3H，Ph-H)，7.04(d，J＝9.0Hz，2H，Ph-H)，5.75(s，2H，Ph-CH2)，3.88(s，3H，-OCH3)，2.71(s，3H，-COCH3)ESI-MS424.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C22H19N5O3*0.25H2O(405.92)C65.09，H4.84，N17.25；FoundC65.03，H4.58，N17.232-乙酰氨基-4-芐氧基-6-對(duì)甲基苯基蝶啶(4)按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為對(duì)甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和苯甲醇，得0.28g黃色固體4，產(chǎn)率24.3％，m.p.232～234℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.15(bs，1H，2-NH)，8.03(d，2H，Ph-H)，7.56(m，2H，Ph-H)，7.38(m，5H，Ph-H)，5.71(s，2H，Ph-CH2)，2.71(s，3H，-COCH3)，2.42(s，3H，Ph-CH3).ESI-MS408.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C22H19N5O2*1.25H2O(407.94)C64.77，H5.31，N17.16；FoundC65.21，H4.78，N17.162-乙酰氨基-4-(2-苯基)乙氧基-6-對(duì)甲氧基苯基蝶啶(5)按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為對(duì)甲氧基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和β-苯乙醇，得0.29g黃色固體5，產(chǎn)率31.2％，m.p.236～237℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.25(bs，1H，2-NH)，8.14(d，J＝8.7Hz，2H，Ph-H)，7.37(m，5H，Ph-H)，7.08(d，J＝8.7Hz，2H，Ph-H)，4.85(t，J＝14.4Hz，2H，-OCH2)，3.92(s，3H，-OCH3)，3.29(t，J＝14.4Hz，2H，PhCH2)，2.72(s，3H，-COCH3).ESI-MS416.2[M+H]+.Anal.Calcd for C23H21N5O3*0.5CH3COOH(415.44)C64.71，H5.20，N15.72；FoundC65.19，H5.04，N16.022-乙酰氨基-4-(2-苯基)乙氧基-6-對(duì)甲基苯基蝶啶(6)按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為對(duì)甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和β-苯乙醇，反應(yīng)完經(jīng)硅膠柱層析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.24g黃色固體6，產(chǎn)率25.6％，m.p.264～266℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.41(s，1H，7-H)，8.28(bs，1H，2-NH)，8.06(d，2H，Ph-H)，7.35(m，7H，Ph-H)，4.84(t，J＝14.1Hz，2H，-OCH2)，3.27(t，J＝14.1Hz，2H，Ph-CH2)，2.71(s，3H，-COCH3)2.45(s，3H，Ph-CH3).
ESI-MS422.0[M+Na]+；Anal.Calcdfor C23H21N5O2*0.25H2O(403.94)C68.39，H5.36，N17.34；FoundC68.19 H5.14，N17.232-乙酰氨基-4-(2-鄰苯二甲酰亞氨基)乙氧基-6-對(duì)甲基苯基蝶啶(7)按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為對(duì)甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和鄰苯二甲酰氨基乙醇，反應(yīng)完畢經(jīng)硅膠柱層析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.21g黃色固體7，產(chǎn)率19.4％，m.p.245～248℃..1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.01(m，3H，Ph-H)，7.84(m，2H，Ph-H)，7.73(m，2H，Ph-H)，7.32(m，2H，Ph-H)，4.90(t，J＝11.1Hz，2H，-OCH2)，4.30(t，J＝11.1Hz，2H，-NCH2)，2.69(s，3H，-COCH3)，2.45(s，3H，Ph-CH3)；ESI-MS491.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C25H20N6O4*H2O(486.48)C61.72，H4.55 N17.27；FoundC61.78，H4.28，N17.232-氨基-4-甲氧基-6-對(duì)甲基苯基蝶啶(8)按照化合物(1)的制備方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1為甲基，R3為對(duì)甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和甲醇，反應(yīng)完畢經(jīng)硅膠柱層析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.20g黃色固體，將此黃色固體加入甲醇中，滴加幾滴濃硫酸室溫下攪拌10小時(shí)，濃縮溶液即得黃色固體(8)0.16g產(chǎn)率25.5％，m.p.261～264.1H-NMR(AV-300 CD3OD)δ9.41(s，1H，7-H)，8.07(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.37(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，4.36(s，3H，-OCH3)，2.43(s，3H，Ph-CH3)ESI-MS268.1[M+H]+Anal.Calcd forC14H13N5O*0.5H2SO4*H2O(334.33)C50.29，H4.82，N 20.94；FoundC50.13，H4.57，N20.812-苯甲酰氨基-4-羥基-6-對(duì)甲氧基苯基蝶啶(9)將0.6g(2.64mmol)化合物B(式中R3為-對(duì)甲氧基苯基)加到干燥的吡啶中，向此混合物中滴加苯甲酰氯的吡啶溶液，保持溫度在80～90℃下反應(yīng)4小時(shí)，將反應(yīng)液傾入冰水中，有大量固體析出，過濾，固體經(jīng)硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝20∶1]分離得粗品，用DMF和水混合溶液重結(jié)晶得化合物(9)0.28g產(chǎn)率28.2％，m.p..195～198℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.13(s，1H，7-H)，8.03(m，4H，Ph-H)7.61(m，1H，Ph-H)，7.52(m，2H，Ph-H)，6.94(m，2H，Ph-H)，3.81(s，3H，-OCH3)；ESI-MS372.1[M-H]-Anal.Calcd for C20H15N5O3*0.25DMF*0.25H2O(396.15)C62.91，H4.39，N18.56；FoundC63.01，H3.92，N18.94.
2-(3-吡啶甲?；?氨基-4-羥基-6-對(duì)甲氧基苯基蝶啶(10)將0.6g(2.64mmol)化合物B(式中R3為-對(duì)甲氧基苯基)加到干燥的吡啶中，向此混合物中滴加煙酰氯的吡啶溶液，保持溫度在80～90℃下反應(yīng)4小時(shí)，將反應(yīng)液傾入冰水中，有大量固體析出，過濾，固體經(jīng)硅膠柱層析[乙酸乙酯∶甲醇＝6∶1]分離得0.15g黃色固體10；產(chǎn)率15.6％ m.p..174～177℃.1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ9.51(s，1H，7-H)，9.21(d，1H，Py-H)，8.83(m，1H，Py-H)，8.44(m，1H，Py-H)，8.20(d，J＝8.9Hz，2H，Ph-H)，7.61(m，1H，Py-H)，7.13(d，J＝8.9Hz，2H，Ph-H)，3.86(s，3H，-OCH3)ESI-MS373.0[M-H]-Anal.Calcd for C19H14N6O3*0.5CH3COOC2H5(418.41)C60.28，H4.33，N20.08；FoundC59.98，H4.15，N20.13(2)化合物生物活性的測(cè)試1.樣品與試劑蝶呤類衍生物本論文中合成了10個(gè)化合物，進(jìn)行了iNOS的抑制活性研究，活性測(cè)定是以DMSO作溶劑進(jìn)行。
1.2誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶是由Cayman Chemical公司提供。
1.3四氫生物蝶呤二鹽酸鹽，純度＞99％，由Cayman Chemical公司提供。
1.4一氧化氮試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)200405112.主要儀器2.1 HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司2.2 BS110S分析天平 北京賽多利天平有限公司2.3 752紫外可見光分光光度計(jì)上海分析儀器總廠3.藥物體外抑制誘導(dǎo)型一氧化氮百分率的測(cè)定3.1試驗(yàn)方法在一氧化氮試劑盒的1號(hào)試劑中不加入四氫生物蝶呤(BH4)，按試劑盒方法分別在試管中加入試劑1、試劑2、試劑3、iNOS樣品、BH4、受試藥物后混勻，37攝氏度水浴下準(zhǔn)確反應(yīng)20分鐘，加入試劑4終止反應(yīng)，再加入終止液后混勻，530nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，比色測(cè)定吸光值。
3.2測(cè)定BH4的飽和濃度按照試劑盒方法按步驟加入試劑，各個(gè)試管中分別加入不同濃度的BH4，測(cè)定各管吸光值，并計(jì)算其飽和濃度。
3.3測(cè)定化合物的抑制百分率根據(jù)文獻(xiàn)，我們配制藥物濃度為BH4飽和濃度的48倍，同樣按試劑盒的方法測(cè)定吸光值，并計(jì)算出抑制百分率。
抑制百分率＝(標(biāo)準(zhǔn)管吸光值-測(cè)定管吸光值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光值-空白管吸光值)×100％4.各化合物IC50(半數(shù)抑制濃度)的測(cè)定根據(jù)前一次試驗(yàn)BH4飽和濃度測(cè)定結(jié)果，以及藥物的抑制百分率達(dá)100％的藥物濃度，我們推薦以下幾個(gè)劑量，分別為32倍、24倍、18倍、13.5倍(劑量比為1∶0.75)。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)試管中加入的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的濃度是固定的。測(cè)得各管在530nm處的吸光度，用直線回歸的方法計(jì)算出各自的半數(shù)抑制濃度(見下表)。
表蝶呤類化合物對(duì)iNOS的抑制效果

注(1)表中iNOS活性數(shù)據(jù)測(cè)定時(shí)的抑制劑濃度均為96μmol/L、BH4的濃度為2μmol/L。Vmax為沒有抑制劑時(shí)在2μM(飽和濃度)BH4作用下的iNOS活性；(2)ND表示沒測(cè)定。
權(quán)利要求
1.下述通式(I)表示化合物 R1代表C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；C1-C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代或無取代的芳基或雜環(huán)芳基；R2代表氫；C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；芳基取代的C1-C5直鏈或支鏈的烷烴；氨基或取代氨基取代的C1-C5直鏈或支鏈的烷烴；R3代表氫；羥基取代或無取代基的C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；C1-C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代或無取代的芳基；R4代表氫；苯基、C1-C5直鏈或支鏈烷基；C1-C5直鏈或支鏈烷氧基；羥基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1代表C1-C8直鏈或支鏈的烷烴；苯基、對(duì)甲氧基苯基、對(duì)甲基苯基、芐基、β-苯乙基、吡啶基。R2代表氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、芐基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、二甲氨基丙基、二乙氨基乙基、鄰苯二甲酰亞氨基乙基、丁二酰亞氨基乙基。R3代表氫、苯基、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、對(duì)甲氧基苯基、對(duì)甲基苯基。R4代表氫、甲基、乙基、羥基、甲氧基、氨基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中R1代表苯基、對(duì)甲氧基苯基、吡啶基；R2代表甲基、異丙基、芐基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、鄰苯二甲酰亞氨基乙基、丁二酰亞氨基乙基；R3代表氫、苯基、、對(duì)甲氧基苯基、對(duì)甲基苯基；R4代表氫、甲基、乙基、羥基。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物在制備抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物在制備在敗血性或出血性休克或用細(xì)胞毒素進(jìn)行腫瘤化學(xué)治療和肝硬化或肝萎縮和/或肝功能衰退時(shí)所引起的血壓下降或/和止血障礙藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物在制備預(yù)防和治療異體器官和組織移植的排斥反應(yīng)藥物以及胰島素依賴型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物在制備預(yù)防和治療炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物在制備預(yù)防和治療細(xì)胞毒素進(jìn)行腫瘤化學(xué)治療化學(xué)藥物或化學(xué)物質(zhì)以及慢性肝炎引發(fā)的多種肝損傷、肝功能衰退以及預(yù)防和治療心肌梗塞損傷、病毒型心肌炎的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物在制備預(yù)防和治療腦缺血后的炎癥反應(yīng)、病毒性腦炎以及病毒性神經(jīng)退化疾病、痛覺過敏癲癇、偏頭痛早老性癡呆癥的藥物。
10.一種藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的化合物并含有常規(guī)藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及到具有抑制一氧化氮合酶作用的蝶呤衍生物，它具有通式(I)所述的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明可用于制備預(yù)防和治療敗血性或出血性休克、器官移植的排斥反應(yīng)、腦缺血后的炎癥反應(yīng)、病毒性腦炎以及早老性癡呆癥的藥物。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1583747SQ20041004487
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月26日
發(fā)明者姚其正, 郭平, 馮明聲, 姜力勛, 石靜波 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)