專利名稱：具有一氧化氮合酶抑制劑作用的蝶啶衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到設計與合成具有控制體內一氧化氮自由基(NO·，簡寫為NO)過多產生的蝶啶衍生物，尤其是具有誘導型NO合成酶抑制劑作用的蝶啶衍生物，用以制備預防和治療體內因NO水平升高而介導疾病的藥物。
本項發(fā)明研究工作得到國家自然科學基金的資助(項目編號39870822)。
背景技術：
NO是一個低分子量和具有疏水性質的生物活性分子，可以自由穿過細胞膜，作用于細胞內的靶分子，理論上NO可以到達細胞和組織內任何部位，故能在體內調控多種細胞功能和產生廣泛的生物效應。NO是通過內源性的一氧化氮合酶(NO Synthase，簡寫為NOS)產生的，NOS以L-精氨酸(L-Arginine，簡寫為L-Arg)和分子氧為底物，催化L-Arg中的兩個等價胍基氮之一，經氧化反應而生成NO和L-瓜氨酸(L-Citrulline，簡寫為L-Cit)。
至今三種結構獨特的NOS異構酶已被分離、克隆和確定(參見Foerstermann U，GathI，et al，Biochem Pharmacol，1995，501321-1332)，根據(jù)這三種NOS亞型來源于細胞或組織的不同和其表達方式而分別給予不同的命名，如集中于血管內皮細胞中的亞型稱為內皮型NOS(endothelial NOS，eNOS或NOS-III)，它涉及到調節(jié)血管的緊張程度和抗血栓作用；存在于神經組織中的稱為神經元型NOS(neuronal NOS，nNOS或NOS-I)，它涉及到神經調節(jié)等；這兩種異構酶在細胞處于生理狀態(tài)下即有表達，一般來說，它們是通過機體對Ca2+水平的控制而維持在低水平的持續(xù)表達狀態(tài)，使含這兩種酶的部位NO保持在低濃度下而發(fā)揮生理功能，故常又將eNOS和nNOS合稱為結構型NOS(constitutive NOS，cNOS)。第三種異構酶即所謂的誘導型NOS(inducible NOS，iNOS或NOS-II)，它在巨噬細胞和許多暴露在細胞素下的細胞中表達，并且在對細胞毒素物質產生的早期免疫應答方面起到關鍵作用。一般認為iNOS在生理狀態(tài)下不表達，不依賴于體內的Ca2+水平和調鈣蛋白，重要的是它通過誘導后被合成，如敗血癥休克，感染性、免疫性疾病，以及細胞因子、內毒素等許多因素均誘導iNOS大量合成，一旦合成即大量地產生NO，導致NO在體內泛濫成災，產生廣泛的損害，故應用選擇性NOS抑制劑來預防和抑制iNOS的合成，是具有重大的治療前景。
至今，NOS抑制劑的研究已有近十年的歷史，初期的NOS抑制劑主要是內源性底物L-Arg的類似物，結構修飾了的L-Arg。另外在生物化學水平上NOS的一些輔因子已經鑒明，它們包括還原性尼克酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)、血紅素和四氫生物蝶呤(BH4)。故除以上L-Arg型的NOS抑制劑外，NOS其它的結合位置也可被作為藥理學上的靶點，如考慮干擾NOS還原酶區(qū)黃素輔酶的結合位點，有人開發(fā)了二亞苯基碘鎓(DPI)(參見以上Griffith OW，Gross SS的文章)和一些喹唑啉化合物(Fujisawa Pharm Co Ltd.，WO 970225，1997)；在NOS氧化酶區(qū)內，Griffith和Gross合成出不同類型的吲唑和咪唑作為配體結合到血紅素輔基上，來達到抑制NOS的目的。
以上所述及的抑制劑，缺乏相當明顯的對NOS異構酶的抑制選擇性。

發(fā)明內容
BH4雖是第一個被鑒定的NOS重要輔酶，它在NOS中的作用仍沒完全闡明，但研究已表明BH4對NOS的穩(wěn)定性有關，促進NOS達到最大催化活性，因此，BH4與其NOS的結合區(qū)可作為理想的用于選擇性的藥理干預靶點?；诖怂枷?，我們合成具有與BH4相同母核(蝶啶)的一大批化合物，化合物的結構式可用分子式I表示，在蝶啶的4-和6-位用多種其它基團進行修飾，以這類化合物和BH4競爭，結合到NOS的BH4結合區(qū)中，改變NOS結構或電學性質，達到干擾或抑制NOS的活性目的。這些合成的化合物經用iNOS進行生物活性測試，發(fā)現(xiàn)這類蝶啶衍生物具有抑制NO產生的作用，可以用作處理NO體內升高而引發(fā)的疾病的治療藥物。
下述通式(I)表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽
R代表氫；羥基取代或無取代基的C1-C8直鏈或支鏈的烷基；C1-C8直鏈或支鏈的烷氧基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的芳基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的胺基；-NHC6H4COOR5或-N(CH3)C6H4COOR5，R5為C1-C4直鏈或支鏈烷基；-NHC6H4COGlu或-N(CH3)C6H4COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；-NHC6H4COR6或-N(CH3)C6H4COR6，R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；R1代表H；苯基、C1-C5直鏈或支鏈的烷基；C1-C5直鏈或支鏈的烷氧基；羥基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；R2和R3相同或不同，各自獨立地表示C1-C6直鏈或支鏈的烷基；芐基；R2和R3不同時為H；R2為H或甲基時，R3代表三元～六元環(huán)烷基；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10、-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10，R9和R10相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基；或者NR2R3代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪或三元～五元脂肪環(huán)單或二胺基；通式(I)不包括當NR2R3為N(CH2CH3)2或六氫吡啶基時，R為C6H5或p-H3COC6H4的化合物。
前述蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽，其中較好的是R代表氫、羥基單取代或無取代基的C1-C5直鏈或支鏈的烷基；苯基、對甲基苯基；對甲氧基苯基；-CH2OH；(C1-C5)烷氧基；胺基；-NHC6H4COOR5或-N(CH3)C6H4COOR5，R5為甲基、乙基、異丙基；-NHC6H4COGlu或-N(CH3)C6H4COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；NHC6H4COR6或N(CH3)C6H4COR6，R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；R1代表氫，甲基，乙基、羥基，甲氧基，氨基；R2與R3相同，為甲基、乙基、丙基、芐基；R2代表H時，R3為乙基、異丙基、環(huán)丙基、-C6H4CO-谷氨酸二甲(或乙)酯，-C6H4CH2CO-谷氨酸二甲(或乙)酯，-C6H4COOMe/Et，C6H4CH2COOMe/Et；R2為甲基時，R3代表乙基、C6H4COGluMe2/Et2、C6H4CH2COGluMe2/Et2、C6H4COOMe/Et、C6H4CH2COOMe/Et；或者NR2R3代表環(huán)丙胺基、環(huán)丁胺基、1，2-環(huán)丁二胺基。
前述蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽，其中更為合適的R代表乙基、丙基、苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、C2-C4烷氧基、NHCHCOOR5，R5為甲基、乙基；R1代表氫、甲基、羥基。
由下述通式(II)表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抑制誘導性一氧化氮合成酶藥物中的應用， R代表氫；羥基取代或無取代基的C1-C8直鏈或支鏈的烷基；C1-C8直鏈或支鏈的烷氧基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的芳基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的胺基；-NHC6H4COOR5或-N(CH3)C6H4COOR5，R5為C1-C4直鏈或支鏈烷基；-NHC6H4COGlu或-N(CH3)C6H4COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；NHC6H4COR6或N(CH3)C6H4COR6，R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；R1代表H；C1-C5直鏈或支鏈的烷基；C1-C5直鏈或支鏈的烷氧基；羥基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；
R2和R3相同或不同，各自獨立地表示H；C1-C6直鏈或支鏈的烷基；芐基；R2為H或甲基時，R3代表三元～六元環(huán)烷基；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10、-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10，R9和R103相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基；或者NR2R3代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪或三元～五元脂肪環(huán)單或雙胺基。
所述通式(II)表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抑制誘導性一氧化氮合成酶藥物中的應用，是制備在敗血性和/或出血性休克或用細胞毒素進行腫瘤化學治療和肝硬化或肝萎縮和/或肝功能衰退時所引起的血壓下降或/和止血障礙藥物。更具體的應用，是制備預防和治療炎癥疾病藥物；是制備預防和治療異體器官和組織移植的排斥反應藥物以及胰島素依賴型糖尿病藥物；是制備預防和治療細胞毒素進行腫瘤的化學治療、化學物質或藥物以及慢性肝炎引發(fā)的多種肝損傷、肝功能衰退以及預防和治療心肌梗塞損傷、病毒性心肌炎藥物。所述的應用，是制備預防和治療病毒性神經退化、變化疾病及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛藥物。
藥物組合物，其中含有治療有效量的通式(I)表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽，并含有常規(guī)藥用載體。
四氫生物蝶呤(BH4) 蝶啶本發(fā)明具有抑制iNOS的蝶啶化合物以通式II所表示
其中，4-位為氨基或者是多種型式的胺基，取代胺基；所述通式(II)化合物，其特征在于R＝H；烷基(如甲基，乙基，丙基等C1-C5的正烷基和異構烷基)；芳基(包括苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基等)；CH2R4，這里R4＝H；OH；(C1-C5)烷氧基；有機胺基；NHC6H4COOR5或N(CH3)C6H4COOR5，其中R5＝C1-C4烷基等；NHC6H4COGlu[注Glu＝NHCH(COOH)CH2CH2COOH(谷氨酸)，這里羧酸中的H可被Me、Et取代，可分別表示為GluMe2和GluEt2]，N(CH3)C6H4COGlu(Glu中的羧酸H可被Me、Et取代)；NHC6H4COR6或N(CH3)C6H4COR6，這里R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基等氨基酸基。
R1＝H，甲基，羥基，甲氧基，苯基，氨基等。
R2R3(1)R2＝R3＝H，甲基，乙基，丙基，芐基等；(2)R2＝H，R3＝乙基，異丙基，環(huán)丙基等C2-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，C6H4COGluMe2[或Et2，GluMe2或Et2即為谷氨酸二甲(或乙)酯]，C6H4CH2COGluMe2/Et2，C6H4COOMe/Et，C6H4CH2COOMe/Et。
(3)R2＝CH3，R3＝乙基，C6H4COGluMe2/Et2，C6H4CH2COGluMe2/Et2，C6H4COOMe/Et，C6H4CH2COOMe/Et等。
或NR2R3哌啶基，哌嗪基，甲基哌嗪等脂肪環(huán)胺；所述通式(II)化合物，其特征在于以上所述及的烷基、烷氧基和胺基中的烷基可以是直鏈烷基，或是有側鏈的烷基，或是環(huán)狀烷基。在分子式中如果出現(xiàn)有立體異構體和互變異構體，則本發(fā)明中的化合物包括這些全部的互變異構體和立體異構體。
所述通式(II)化合物，其特征還在于
對于R所代表的基團和原子，較優(yōu)的有乙基、丙基，芳基中較優(yōu)的有對甲基苯基、對甲氧基苯基，CH2R4中R4優(yōu)先代表(C2-C4)烷氧基、NHC6H4COOR5，R5優(yōu)先基團為甲基、乙基。
對于R1優(yōu)先代表H、甲基、羥基。
本發(fā)明所用的通式II表示的化合物可以它們的中性形式，也可以和無機酸或有機酸加成形成相應的鹽使用，對藥物中所能用的酸包括有如鹽酸、溴化氫、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸等。通式I表示的化合物可和多摩爾的酸加成形成鹽，這些多摩爾的酸可以是單一的也可以是組合的，這主要根據(jù)需要用相應的溶劑或稀釋劑的情況來決定。這些加成的鹽可通過陰離子交換而去除。對于通式II中含有酸性組分的化合物，也可和相應的無機或有機堿、或堿性氨基酸組成相應的鹽，例如對于這些鹽有堿金屬的鹽，特別有效的是鈉、鉀和銨鹽，以及與有機胺和堿性氨基酸等組成相應的鹽。
本發(fā)明所涉及的蝶啶衍生物和它們相應的鹽類可和適合輔料(包括相應的醫(yī)藥上準許應用的賦形劑、粘合劑、緩釋劑、穩(wěn)定劑、香料、調味劑、色素等)做成片劑或膠囊口服，也可做成相應的針劑用于臨床。
對本發(fā)明中的通式II型的化合物抑制iNOS活性的測定，根據(jù)已知的測定方法(參見鐘慈聲，孫安陽主編一氧化氮的生物醫(yī)學，上海上海醫(yī)科大學出版社，1997，p.361-363，381-385)因NO水平升高而引起的疾病和病癥，主要包括病理性血壓下降，例如敗血癥或出血性休克；用細胞毒素進行腫瘤的化學治療、化學物質或藥物以及慢性肝炎引發(fā)的多種肝損傷(即化學性，病毒性和免疫性肝損傷)，肝硬化或肝萎縮，和肝功能衰退；也包括進行性炎癥，如類風濕性關節(jié)炎和潰瘍性結腸炎，以及胰島素依賴型糖尿病和器官移植排斥反應，以上這些疾病和病癥可用本發(fā)明如通式I表示的化合物進行治療和預防。
另外，下列一些疾病也與誘導產生的NO水平升高有關，可用本發(fā)明的通式I的化合物來預防和治療，在心血管循環(huán)方面，如心肌梗塞損傷、病毒性感染引起的心肌炎；在神經和中樞神經方面，如病毒性神經退化(變性)疾病，以及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛等?？傊?，過量NO產生與許多疾病有關，iNOS的激活產生過多NO是重要的致病因素，研制iNOS選擇抑制劑是十分必要的。
各種蝶啶衍生物廣泛地存在生物體內，在生物體中起著多種功能，有代表性的如葉酸和生物蝶呤，它們在生物體中均以各自的四氫還原型而起作用，如四氫葉酸是體內一碳單位的供體，參與DNA和RNA的合成，對細胞分裂有促進作用；四氫生物蝶呤(BH4)已發(fā)現(xiàn)它既是芳香氨基酸羥化酶的輔酶，對神經系統(tǒng)的細胞生長，神經遞質的傳導和相應疾病均有預防和治療作用，BH4又是被發(fā)現(xiàn)的第一個NOS輔酶，BH4的這兩種輔酶作用是完全不一致的。經iNOS和BH4共結晶的X光衍射晶體結構分析，可以看到在iNOS的氧化酶區(qū)有一個帶有血紅素、L-Arg和Phe470、Ser112、Trp457等氨基酸所形成供嵌入BH4的iNOS的蝶啶結合區(qū)，在這里BH4分子中的N-3、O4、N-5、C6側鏈和血紅素上的丙酸基、Arg375、Phe470、Ser112等有親水或/和親酯的相互作用(參見Crane BR，et al，Science，1998，2792121-2126)，BH4的輔助作用主要是在iNOS發(fā)生催化作用的第一步，即L-Arg轉變?yōu)镹ω-羥基-L-Arg(NHA)時，向血紅素的丙?；峁┮粋€電子和BH4的3，4-酰胺上的一個氫質子(參見Crane BR，et al，Biochemistry，2000，394608-4621)。以BH4為靶點，合成iNOS的抑制劑必須滿足以下的可能性(1)抑制劑應是蝶啶類衍生物，和BH4是同類物，這樣才有可能適應NOS中的蝶啶結合區(qū)的結構上的需求；(2)所合成的蝶啶衍生物可以是非還原型的蝶啶衍生物，并且在的蝶啶的4位和6位有較多的修飾取代基的變化，其作用與(1)一致，以發(fā)生與BH4競爭和NOS結合，并且由于其無BH4的輔助作用，以及它們的結構和電性變化，而使NOS失活。根據(jù)這兩點一般通式為I的蝶啶衍生物都是在4位上為氨基衍生物的取代基，氧化還原或/和質子化作用不同于BH4，故能成為iNOS抑制劑。
更進一步的機理在于，在細胞中BH4的水平越高，iNOS的表達和作用越易發(fā)生(參見Gross SS，Levi RJ，Biol Chem，1992，26725722)。在生物體內有從頭合成和補救兩條途徑來合成BH4，而BH4的從頭合成的首要酶GTPCH1(GTP環(huán)水解酶1)和iNOS一樣，其表達也受到內毒素或細胞因子的誘導，從而會增加細胞中的BH4產生和水平升高；另外，iNOS二聚體的裝配依賴于BH4的作用，這進一步說明選擇BH4為靶點對抑制iNOS的重要性。
本發(fā)明通式I所表示的化合物是本次發(fā)明新合成的化合物，新合成的化合物均經過各種物理方法進行了結構鑒定，包括1H-NMR、MS和元素分析。所有化合物都是按照或者參照已發(fā)表的方法進行合成。所有蝶啶化合物的合成方法包括有Gabriel-Isay或Taylor方法(參見Brown DJ，edFused Pyrimidine，Part III，Pteridine.；John Wiley Sons，NewYork，1988)，Taghari-Pfleiderer方法(參見Taghari MS，Pfleiderder W，Tetrahedron Lett，1997，386835-6838)，少量化合物按照Traub方法(參見Traub HM，Pfleiderder W，J Med Chem，1987，3040-45)。
通式II化合物的合成有以下步驟1、2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)的合成 式中NR2R3＝NH2；N(CH2CH3)2；HN(CH2)5；N(CH2C6H5)2；HNCH(CH3)2；N(CH3)C6H4COOCH3；HNC6H4COOC2H5；HNC6H4CONHCH(COOCH3)CH2CH2COOCH3；HNC6H4CONHCH(COOC2H5)CH2CH2COOC2H5；N(CH3)C6H4CONHCH(COOC2H5)CH2CH2COOC2H5等。
首先將對氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶結合生成2，6-二氨基-4-氯-5-對氯苯偶氮嘧啶，接著用胺取代氯，所得到的化合物用鋅粉在酸性條件下還原偶氮基得化合物(A)(嘧啶衍生物的合成方法參考Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121)。
2、取代酮肟的合成2.1肟基丙酮(B)的合成 乙酰乙酸乙酯先在氫氧化鉀的水溶液中水解脫去酯基，然后在活潑亞甲基上發(fā)生亞硝化反應，經脫二氧化碳，重排，得肟基丙酮(B)。
2.2 2-肟基苯乙酮(C)的合成 式中R”＝H；CH3；CH3O等。
相應的取代苯乙酮在二氧六環(huán)和水的混合溶液中用二氧化硒氧化α-甲基得二羰基化合物，接著和丙酮肟反應，可選擇性地得到化合物(C)。
3、對甲氨基苯甲酰谷氨酸二甲(或乙)酯(D)的合成
式中R＝Me，Et。
化合物(D)的合成參考了肽類物質的合成，先用碳酸二叔丁酯保護對甲胺基苯甲酸的甲胺基，將谷氨酸的羧基成酯保護后，用DCC縮合到對甲胺基苯甲酸上，再以三氟醋酸酸解除去Boc基，可得化合物(D)，D用于部分A化合物的合成。
4、目的化合物的合成4.1.化合物5、9、14、30-32的合成 4.2.化合物4、6-8、10-13、15-28的合成 在4.1.和4.2.中，將2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)分別和取代肟B、C于甲醇中回流，可以區(qū)域選擇性地得到6位取代的蝶啶化合物，因為嘧啶中間體A極易在空氣中氧化，所以此反應需在氮氣保護條件下進行。
實施例1、化合物制備2-氨基-4-[N-(對氨基苯甲酸乙酯)-基]-6-苯基蝶啶(6)將0.68g(1.65mmol)化合物A(式中NR2R3＝HNC6H4COOC2H5)加入到無水甲醇15mL中使之完全溶解，在氮氣保護、攪拌、油浴回流條件下，滴加由苯肟(C，R”＝H)0.37g(2.48mmol)和6mL甲醇組成的溶液，回流反應4h，停止加熱，冷卻至室溫后以氨水調pH值為7-8，有固體析出，放人冰箱過夜后過濾得粗品，經乙醚和乙醇混合液重結晶得0.22g橙黃色固體6，產率34.6％，m.p.275～277℃.1H-NMRδ9.32(s，1H，7-H)，9.23(s，1H，4-NH)，8.13-7.97(m，6H，Ph-H)，7.55(m，3H，Ph-H)，6.06(bs，2H，2-NH2)，4.39(q，J＝6.9Hz，2H，CH2)，1.41(t，J＝6.9Hz，3H，CH3).ESI-MS387.2[M+H]+.Anal.Calcd for C21H18N6O2*H2O(404.4)C62.37，H4.98，N20.78；FoundC62.07，H5.20，N20.75.
2-氨基-4-[N-(對氨基苯甲酸乙酯)-基]-6-對甲基苯基蝶啶(7)按照制備化合物6的方法，投入0.68g(1.65mmol)化合物A(式中NR2R3＝HNC6H4COOC2H5)，對甲基苯肟(C，R”＝CH3)0.40g(2.45mmol)，反應完畢，得0.21g黃色固體7，產率31.7％，m.p.262～264℃.1H-NMRδ9.16(s，1H，7-H)，8.99(bs，1H，4-NH)，8.00(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，7.87(d，J＝4.6Hz，2H，Ph-H)，7.84(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，7.26(d，J＝4.6Hz，2H，Ph-H)，5.96(bs，2H，2-NH2)，4.34(q，J＝7.0Hz，2H，CH2)，2.94(s，3H，Ph-CH3)1.38(t，J＝7.0Hz，3H，CH3).ESI-MS401.1[M+H]+.Anal.Calcd for C22H20N6O2*0.5HCl*0.5H2O(427.68)C61.78，H5.07，N19.65；FoundC61.29，H4.97，N19.832-氨基-4-[N-(對氨基苯甲酸乙酯)-基]-6-對甲氧基苯基蝶啶(8)按照制備化合物6的方法，投入0.68g(1.65mmol)化合物A(式中NR2R3＝HNC6H4COOC2H5)，對甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O)0.44g(2.45mmol)，反應完畢，得0.23g黃色固體8，產率33.5％，m.p.263～265℃.1H-NMRδ9.24(s，1H，7-H)，9.11(bs，1H，4-NH)，8.07(m，2H，Ph-H)，7.98(m，4H，Ph-H)，7.05(m，2H，Ph-H)，5.60(bs，2H，2-NH2)，4.37(q，J＝7.0Hz，2H，CH2)，3.89(s，3H，Ph-CH3)1.40(t，J＝7.0Hz，3H，CH3).ESI-MS417.3[M+H]+.Anal.Calcd for C22H20N6O3*0.5HCl(434.69)C60.83，H4.75，N19.33；FoundC60.43，H4.60，N19.43.
2-氨基-4-[N-(對甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-甲基蝶啶(9)
按照制備化合物6的方法，投入0.71g(1.73mmol)化合物A(式中NR2R3＝N(CH3)C6H4COOCH3)，甲肟(B)0.23g(2.67mmol)，回流反應5h，蒸去甲醇，殘留物經硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝20∶1]得粗品，經乙醚和乙醇混合液重結晶得0.20g淺黃色固體9，產率35.6％，m.p.264～266℃.1H-NMRδ8.45(s，1H，7-H)，8.20(d，J＝8.6Hz，2H，Ph-H)，7.21(d，J＝8.6Hz，2H，Ph-H)，5.65(bs，2H，2-NH2)，3.93(s，3H，O-CH3)，3.67(s，3H，N-CH3)，2.09(s，3H，CH3).ESI-MS325.1[M+H]+.Anal.Calcd for C16H16N6O2(324.3)C59.25，H4.97，N25.91；FoundC58.93，H4.75，N25.94.
2-氨基-4-[N-(對甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-苯基蝶啶(10)按照制備化合物6的方法，投入0.71g(1.73mmol)化合物A(式中NR2R3＝N(CH3)C6H4COOCH3)，苯肟(C，R”＝H)0.40g(2.67mmol)，反應完畢，蒸去甲醇，殘留物經硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝20∶1]得粗品，經乙醚和乙醇混合液重結晶得0.25g淺黃色固體10，產率37.4％，m.p.268～270℃.1H-NMRδ9.10(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-H)，7.56～7.16(m，7H，Ph-H)，5.36(bs，2H，2-NH2)，3.96(s，3H，O-CH3)，3.68(s，3H，N-CH3)。ESI-MS387.2[M+H]+。Anal.Calcd for C21H18N6O2(386.41)C65.27，H4.69，N21.75；FoundC65.17，H4.51，N22.12.
2-氨基-4-[N-(對甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-對甲基苯基蝶啶(11)按照制備化合物6的方法，投入0.71g(1.73mmol)化合物A(式中NR2R3＝N(CH3)C6H4COOCH3)，對甲基苯肟(C，R”＝CH3)0.44g(2.67mmol)，反應完畢，得0.35g褐黃色固體11，產率50.4％，m.p.273～275℃.1H-NMRδ9.08(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-H)，8.03(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，7.37(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，7.23(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-H)，5.41(bs，2H，2-NH2)，3.97(s，3H，O-CH3)3.68(s，3H，N-CH3)2.45(s，3H，CH3).ESI-MS401.2[M+H]+.Anal.Calcd for C22H20N6O2(400.40)C65.99，H5.03，N21.01；FoundC65.54，H4.74，N21.29.
2-氨基-4-[N-(對甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-對甲氧基苯基蝶啶(12)按照制備化合物6的方法，投入0.44(1.06mmol)化合物A(式中NR2R3＝N(CH3)C6H4COOCH3)，對甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O)2.00g(1.12mmol)，反應完畢，得0.15g黃色固體12，產率33.9％，m.p.240～242℃.1H-NMRδ9.06(s，1H，7-H)，8.12(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.31(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，7.16(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，6.75(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，5.66(bs，2H，2-NH2)，3.96(s，3H，O-CH3)，3.87(s，3H，O-CH3)3.70(s，3H，N-CH3).ESI-MS417.1[M+H]+，439.1[M+Na]+.Anal.Calcd forC22H20N6O3(416.41)C63.45，H4.87，N20.18；FoundC63.53，H4.44，N20.13.
2-氨基-4-[N-(對甲氨基苯甲酰谷氨酸酸二乙酯)-基]-6-對甲氧基苯基蝶啶(13)按照制備化合物6的方法，加入0.93g(1.6mmol)化合物A(式中NR2R3＝N(CH3)C6H4CONHCH(COOEt)CH2CH2COOEt)和0.47g甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O，2.6mmol)，反應畢，所得粗品用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.42g純產品13，產率44.7％，m.p.193～195℃.1H-NMR δ8.99(s，1H，7-H)，8.02(d，J＝6.5Hz，2H，Ph-H)，7.56(bs，2H，2-NH2)，7.32(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，7.01(d，J＝6.5Hz，2H，Ph-H)，6.92(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，6.71(bm，1H，NH-Glu)，4.79(m，1H，CH-Glu)，4.20～4.40(m，4H，2CH2)，3.68(s，3H，O-CH3)，3.65(s，3H，N-CH3)，2.53(m，2H，CH2-Glu)，2.35-2.31(m，2H，CH2-Glu)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，1.20(t，J＝7.0Hz，3H，CH3).ESI-MS588.2[M+H]+，586.3[M-H]+.Anal.Calcd for C30H33N7O6(587.3)C61.30，H5.66，N16.69；FoundC61.20，H5.40，N16.792-氨基-4-[N-(對氨基苯甲酰谷氨酸酸二甲酯)-基]-6-甲基蝶啶(14)按照制備化合物6的方法，加入1.42g(2.35mmol)化合物A(式中NR2R3＝HNC6H4CONHCH(COOCH3)CH2CH2COOCH3)和0.42g甲基肟(B，4.83mmol)，反應畢，所得粗品用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.24g純產品14，產率22,5％，m.p.200～202℃.1H-NMR δ9.02(s，1H，7-H)，8.67(s，1H，4-NH)，7.93(d，J＝8,4Hz，2H，Ph-H)，7.84(d，J＝8,4Hz，2H，Ph-H)，7.19(bs，1H，NH-Glu)，5.71(bs，2H，2-NH2)，4.81(m，1H，CH-Glu)，3.79(s，3H，O-CH3)，3.66(s，3H，O-CH3)，2.67(s，3H，Ph-CH3)，2.57(m，2H，CH2-Glu)，2.19(m，2H，CH2-Glu).ESI-MS454.1[M+H]+.Anal.Calcd for C21H23N7O5(453.5)C55.62，H5.11，N21.62；FoundC55.61，H5.08，N21.40.2-氨基-4-[N-(對氨基苯甲酰谷氨酸酸二乙酯)-基]-6-對甲基苯基蝶啶(15)按照制備化合物6的方法，加入1.12g(1.85mmol)化合物A(式中NR2R3＝HNC6H4CONHCH(COOEt)CH2CH2COOEt)和0.31g甲基苯肟(C，R”＝CH3，1.90mmol)，反應畢，所得粗品用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.31g純產品.15，產率30％，m.p.235～237℃.1H-NMRδ9.19(s，1H，7-H)，9.05(bs，1H，4-NH)，7.90(m，6H，Ph-H)，7.30(m，3H，Ph-H，NH-Glu)，5.88(bs，2H，2-NH2)，4.79(m，1H，CH-Glu)，4.25(q，J＝7.0Hz，2H，CH2)，4.12(q，J＝7.0Hz，2H，CH2)，2.53(m，2H，CH2-Glu)，2.41(s，3H，Ph-CH3)，2.20-2.15(m，2H，CH2-Glu)，1.31(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，1.23(t，J＝7.0Hz，3H，CH3).ESI-MS558.3[M+H]+.Anal.Calcd for C29H31N7O5(557.6)C62.46，H5.60，N17.58；FoundC62.06，H5.59，N17.52.
2-氨基-4-[N-(對氨基苯甲酰谷氨酸酸二乙酯)-基]-6-對甲基苯基蝶啶(16)按照制備化合物6的方法，加入1.12g(1.85mmol)化合物A(式中NR2R3＝HNC6H4CONHCH(COOEt)CH2CH2COOEt)和0.34g甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O，1.90mmol)，反應畢，所得粗品用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.42g純產品16，產率39.6％，m.p.237～239℃.1H-NMR δ9.12(s，1H，7-H)，9.79(bs，1H，4-NH)，7.94(m，6H，Ph-H)，7.45(m，2H，Ph-H)，7.21(bm，1H，NH-Glu)，6.50(bs，2H，2-NH2)，4.73(m，1H，CH-Glu)，4.24(q，J＝7.0Hz，2H，CH2)，4.12(q，J＝7.0Hz，2H，CH2)，3.71(s，3H，Ph-CH3)，2.48(m，2H，CH2-Glu)，2.20-2.15(m，2H，CH2-Glu)，1.30(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)，1.23(t，J＝7.0Hz，3H，CH3).ESI-MS574.2[M+H]+.Anal.Calcdfor C29H31N7O6(573.6)C60.72，H5.45，N17.09；FoundC60.53，H5.51，N17.27.
2-氨基-4-二乙胺基-6-甲基蝶啶(30)將3.1mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2CH3)2]加入到無水甲醇15mL中，使之完全溶解，在氮氣保護、攪拌、油浴回流條件下，滴加以6mL甲醇和0.41g甲基肟(B，4.7mmol)組成的溶液，回流5h，反應完畢，蒸去甲醇，用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得到0.2g黃色固體30，產率27.8％，m.p.211～213℃.1H-NMRδ8.51(s，1H，7-H)，5.11(bs，2H，2-NH2)，3.95(q，J＝6.9Hz，4H，2CH2)2.54(s，1H，6-CH3)，1.27(t，J＝6.9Hz，6H，2CH3).ESI-MS233.2[M+H]+.Anal.Calcd for C11H16N6(232.29)C56.88，H6.94，N36.18；FoundC56.94，H7.01，N36.14.
2-氨基-4-二乙胺基-6-苯基蝶啶(17)按照制備化合物30的方法，投入3.13mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2CH3)2]和0.69g(4.66mmol)苯肟(C，R”＝H)，得0.53g黃色固體17，產率57.8％，m.p.209～211℃，熔點與其它物理數(shù)據(jù)和文獻Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121中一致。
2-氨基-4-二乙胺基-6-對甲基苯基蝶啶(18)按照制備化合物30的方法，投入3.13mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2CH3)2]和0.76g(4.66mmol)對甲基苯肟(C，R”＝CH3)，得0.41g黃色固體18，產率42.5％，m.p.236～238℃.1H-NMRδ9.11(s，1H，7-H)，7.84(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.29(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，5.19(bs，2H，2-NH2)，4.00(m，4H，2CH2)，2.40(s，3H，Ph-CH3)，1.36(m，6H，2CH3).ESI-MS639.2[2M+Na]+，331.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C17H20N6(308.38)C66.21，H6.54，N27.25；FoundC66.17，H6.55，N27.51.
2-氨基-4-二乙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(19)按照制備化合物30的方法，投入3.13mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2CH3)2]和0.84g(4.66mmol)對甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O)，得0.57g黃色固體19，產率56.4％，m.p.220～222℃，熔點與其它物理數(shù)據(jù)和文獻Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121中一致。
2-氨基-4-哌啶基-6-苯基蝶啶(20)按照制備化合物30的方法，投入3mmol化合物A[式中NR2R3＝HN(CH2)5]和0.67g(4.5mmol)苯肟(C，R”＝H)，得到0.42g黃色固體20，產率45.9％，m.p.210～212℃，熔點與其它物理數(shù)據(jù)和文獻Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121中一致。
2-氨基-4-哌啶基-6-對甲基苯基蝶啶(21)按照制備化合物30的方法，投入2.3mmol化合物A[式中NR2R3＝HN(CH2)5]和0.56g(3.45mmol)對甲基苯肟(C，R”＝CH3)，得到0.58g黃色固體21，產率78.8％，m.p.210～212℃。1H-NMRδ9.13(s，1H，7-H)，7.88(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.29(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.09(bs，2H，2-NH2)，4.35(m，4H，2CH2)，2.42(s，3H，CH3)，1.79(s，6H，3CH2).ESI-MS663.3[2M+Na]+，343.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C18H20N6(320.40)C67.48，H6.29，N26.23；FoundC67.15，H6.27，N26.56.
2-氨基-4-哌啶基-6-對甲氧基苯基蝶啶(22)按照制備化合物30的方法，投入2.3mmol化合物A[式中NR2R3＝HN(CH2)5]和0.61g(3.45mmol)對甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O)，得到0.32g黃色固體22，產率41.6％，m.p.211～213℃，熔點與其它物理數(shù)據(jù)和文獻Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121中一致。
2-氨基-4-二芐胺基-6-甲基蝶啶(31)按照制備化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2C6H5)2]和0.3g(3.37mmol)甲基肟(B)，反應完畢，蒸去甲醇，用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得到0.12g黃色固體31，產率15.0％，m.p.216～218℃。1H-NMRδ8.51(s，1H，7-H)，7.34-7.27(m，10H，2Ph-H)，5.62(s，2H，CH2)，5.26(bs，2H，2-NH2)，5.11(s，2H，CH2)，2.36(s，3H，6-CH3).ESI-MS357.2[M+H]+.Anal.Calcd for C21H20N6(356.43)C70.77，H5.66，N23.58；FoundC70.44，H5.61，N23.76.
2-氨基-4-二芐胺基-6-苯基蝶啶(23)按照制備化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2C6H5)2]和0.5g(3.37mmol)苯肟(C，R”＝H)，得0.47g黃色固體23，產率49.9％，m.p.225～227℃，熔點與其它物理數(shù)據(jù)和文獻Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121中一致。
2-氨基-4-二芐胺基-6-對甲基苯基蝶啶(24)按照制備化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2C6H5)2]和0.55g(3.37mmol)對甲基苯肟(C，R”＝CH3)，得0.80g黃色固體24，產率82.3％，m.p.284～286℃.1H-NMR(DMSO-d6)δ9.11(s，1H，7-H)，7.54-7.31(m，14H，3Ph-H)，7.07(bs，2H，2-NH2)，5.68(s，2H，CH2)，4.79(s，2H，CH2)，2.31(s，3H，Ph-CH3).ESI-MS433.3[M+H]+.Anal Calcd for C27H24N6.1.5HCl(487.22)C66.56，H5.28，N17.25；FoundC66.47，H5.18，N17.11.
2-氨基-4-二芐胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(25)按照制備化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中NR2R3＝N(CH2C6H5)2]和0.6g(3.37mmol)對甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O)，得0.31g黃色固體25，產率30.8％，m.p.245～247℃，熔點與其它物理數(shù)據(jù)和文獻Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，JMed Chem，1999，424108-4121中一致。
2-氨基-4-異丙胺基-6-甲基蝶啶(33)按照制備化合物30的方法，投入3.5mmol化合物A[式中NR2R3＝HNCH(CH3)2]和0.46g(4.50mmol)甲基肟(B)，反應完畢，蒸去甲醇，用硅膠柱層析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得到0.30g黃色固體32，產率39.3％，m.p.220～222℃.1H-NMRδ8.59(s，1H，7-H)，6.78(bm，1H，4-NH)，5.35(bs，2H，2-NH2)，4.38(m，1H，CH)，2.57(s，3H，6-CH3)，1.31(m，6H，2CH3).ESI-MS219.1[M+H]+，C10H14N6.(MW218.1).Anal.Calcd forC10H14N6·1/4CH3OH(226.27)C54.44，H6.68，N37.14；FoundC54.93，H6.64，N37.13.
2-氨基-4-異丙胺基-6-苯基蝶啶(26)將3mmol化合物A[式中NR2R3＝HNCH(CH3)2]加入到無水甲醇15mL中，使之完全溶解，在氮氣保護、攪拌、油浴回流條件下，滴加由6mL甲醇和0.67g(4.5mmol)苯肟(C，R”＝H)組成的溶液，回流反應5h，停止加熱，有黃色固體析出，以調節(jié)pH至9，在冰箱中放置過夜，過濾，用乙醇重結晶，得0.42g黃色固體26，產率62.3％，m.p.＞300℃(dec.).1H-NMRδ9.23(s，1H，7-H)，8.02(m，2H，Ph-H)，7.59(m，3H，Ph-H)，7.52(m，1H，4-NH)，6.22(bs，2H，2-NH2)，4.56(m，1H，CH)，1.42(d，J＝6.5Hz，6H，2CH3).ESI-MS281.1[M+H]+，C15H16N6.(MW280.3).Anal.Calcd for C15H16N6·1/4C2H5OH·2H2O(327.88)C56.80，H6.60，N25.63；FoundC57.26，H6.20，N25.33.
2-氨基-4-異丙胺基-6-對甲基苯基蝶啶(27)按照制備化合物26的方法，投入3mmol化合物A[式中NR2R3＝HNCH(CH3)2]和0.73g(4.50mmol)對甲基苯肟(C，R”＝CH3)，得0.55g黃色固體27，產率62.4％，m.p.318～320℃(dec.).1H-NMRδ9.19(s，1H，7-H)，7.91(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.51(bm，1H，4-NH)，7.39(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.91(bs，2H，2-NH2)，4.55(m，1H，CH)，4.01(s，3H，Ph-CH3)，1.42(d，J＝6.5Hz，6H，2CH3).ESI-MS295.1[M+H]+，C16H18N6.(MW294.4).Anal.Calcd for C16H18N6·H2O(312.37)C61.52，H6.45，N26.90；FoundC61.07，H6.09，N27.15.
2-氨基-4-異丙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(28)按照制備化合物26的方法，投入3mmol化合物A[式中NR2R3＝HNCH(CH3)2]和0.80g(4.50mmol)對甲氧基苯肟(C，R”＝CH3O)，得0.31g黃色固體28，產率33.3％，m.p.298～300℃.1H-NMR δ9.17(s，1H，7-H)，7.97(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，7.48(bm，1H，4-NH)，7.39(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，5.91(bs，2H，2-NH2)，4.55(m，1H，CH)，3.91(s，3H，O-CH3)，1.42(d，J＝6.5Hz，6H，2CH3).ESI-MS311.1[M+H]+，C16H18N6O.(MW310.3).Anal.Calcd for C16H18N6O.HCl.1/2CH3OH(362.84)C54.62，H5.97，N23.16；FoundC54.18，H5.98，N22.78.
2、生物活性測定(1)蝶啶衍生物抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制百分率和相應的ID50測定a、測定原理與基本方法利用誘導型一氧化氮合酶催化NO生成時必需輔助因子四氫生物蝶呤(BH4)的原理，在體外固定了反應中iNOS和BH4的濃度，加入不同的藥物(即蝶啶衍生物)，測定一氧化氮(NO)的生成量，算出抑制百分率。用同樣的方法測定不同藥物濃度對反應的抑制率，用回歸方法計算出ID50。
合成的通式I部分蝶啶衍生物，以及由浙江臺州康多利藥業(yè)公司提供的MTX(1)和AMT(氨基蝶呤，29)計29個，臨用前用雙蒸水溶解，部分藥物溶解度低時，加入0.1M HCl溶解后，用1M NaOH調至pH值為7左右備用。
誘導型一氧化氮合酶 Inducible Nitric Oxide Synthase；Recombinant enzymeexpressed in E.Coli；130KDa/subunit.homodimer；100,000xg supematant由Cayman chemical公司提供四氫生物蝶呤 MW＝314.2，純度＞99％由Cayman chemical公司提供一氧化氮合酶試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供藥物體外抑制誘導型一氧化氮合酶百分率的測定(參見鐘慈聲，孫安陽主編一氧化氮的生物醫(yī)學，上海醫(yī)科大學出版社，1997，p.28-30.361-363，381-385)在一氧化氮合酶試劑盒的1號試劑中不加入四氫生物蝶呤(BH4)，按試劑盒方法分別在其它試管中加入試劑1、試劑2、試劑3、iNOS樣品、BH4、受試藥物后混勻，37℃水浴準確反應20分鐘，加入試劑4終止反應，再加入終止液后混勻，530nm處，1cm光徑，蒸餾水調零，比色測定吸光值。
測定BH4的飽和濃度 按照試劑盒方法按步驟加入試劑，各試管中分別加入不同濃度的BH4，測定各管吸光值，并計算其飽和濃度(為1.2μM)。
測定化合物的抑制百分率根據(jù)文獻，配置藥物濃度為BH4飽和濃度的48倍，同樣按試劑盒方法測定吸光值，并計算出抑制百分率。
抑制百分率＝(標準管吸光值-空白管吸光值)/(測定管吸光值-空白管吸光值)×100％蝶啶衍生物半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定根據(jù)前一次試驗BH4飽和濃度測定結果，以及藥物的抑制百分率達100％的藥物濃度，向下推幾個藥物劑量，分別為32倍、24倍、18倍、13.5倍(劑量比為1；0.75)。實驗中每個試管中加入的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和BH4的濃度是固定的。測得各管在530nm處的吸光度，用直線回歸的方法計算出各自的半數(shù)抑制濃度。
所測定的29個蝶啶衍生物的分子結構與它們對iNOS的抑制率、ID50列于下表1，其中絕大多數(shù)化合物均為未見文獻報道的首次合成的新化合物。帶有*號的三個化合物為新化合物，它們用于第二、第三部分的動物細胞、動物體內以及動物疾病模型的研究。其中化合物1-5、17、19、20、22、23、29為已知化合物，其余均為本發(fā)明合成的新化合物。蝶啶衍生物用于測定抑制iNOS活性，未見文獻報道；同樣，以下帶有*號的三個蝶啶化合物用于動物細胞、動物體內以及動物疾病模型的研究，也未見文獻報道，均為首次測定研究。
表1 蝶啶類衍生物對iNOS的抑制活性編號 R R1NR2R3抑制率(％)ID50(μM)1 CH2N(CH3)C6H4COGlu H NH2100 20.482 H H NH2100 26.813 C6H5C6H5NH20 ND4 p-H3CC6H5H NH2100 33.61
5 CH3H NH20 ND6 C6H5H HNC6H4COOEt 67 ND7 p-H3CC6H4H HNC6H4COOEt29 ND8 p-H3COC6H4H HNC6H4COOEt10027.619 CH3H H3CNC6H4COOCH310031.5710 C6H5H H3CNC6H4COOCH310033.6211* p-H3CC6H4H H3CNC6H4COOCH310027.6212 p-H3COC6H4H H3CNC6H4COOCH30ND13 p-H3COC6H4H H3CNC6H4COGluEt2100ND14 CH3H HNC6H4COGluMe210031.5815 p-H3CC6H4H HNC6H4COGluEt210031.0116 p-H3COC6H4H HNC6H4COGluEt210028.1417 C6H5H N(CH2CH3)2100ND18* p-H3CC6H4H N(CH2CH3)210014.8519 p-H3COC6H4H N(CH2CH3)210014.4520 C6H5H N(CH2)510016.0221 p-H3CC6H4H N(CH2)510023.0222 p-H3COC6H4H N(CH2)510015.2223 C6HH N(CH2C6H5)267 13.7724 p-H3CC6H4H N(CH2C6H5)290 ND25 p-H3COC6H4H N(CH2C6H5)210012.3926 C6H5H HNCH(CH3)2100ND27 p-H3CC6H4H HNCH(CH3)2100ND28* p-H3COC6H4H HNCH(CH3)210016.9229 CH2NHC6H4COGlu H NH210016.46注(1)表中化合物1-29的結構如下圖，圖中R、R1、NR2R3見表頭； (2)符號說明ND-沒測定；GluMe2或GluEt2分別為谷氨酸二甲酯基或谷氨酸二乙酯基；(3)化合物1為甲氨蝶呤(MTX)，化合物29為氨基蝶呤(AMT)。
表1結果表明，僅有3個通式II蝶啶類化合物對iNOS沒有抑制作用，絕大多數(shù)通式II蝶啶類化合物對iNOS有抑制效果，其中23個化合物在一定濃度下可完全抑制iNOS的活性。
(2)蝶啶類衍生物對敗血癥性休克大鼠升壓作用的研究a、利用盲腸結扎穿刺后的大鼠敗血癥模型，觀察通式I蝶啶類衍生物對敗血癥性休克大鼠的升高血壓的作用(金惠銘 盲腸結扎穿刺后的大鼠敗血癥模型 中國病理生理雜志1990；6(2)126)。
b、材料和方法1.1三個通式I蝶啶類衍生物(為表1中帶*號者)1.2氨基胍(下簡稱AG)常州市華隆化工有限公司1.3肝素 上海綠島科技有限公司實驗動物SD大鼠，雌雄兼?zhèn)?，體重150-300g，由江寧區(qū)青龍山動物繁殖場合格證號SXCK(蘇)2002-0018藥物對大鼠敗血癥性休克升壓作用實驗4.1大鼠敗血癥性休克模型制備采用盲腸結扎穿孔的方法制備該模型(參見楊軍珂，吳賽珠等，新型一氧化氮合酶抑制劑對敗血性休克大鼠升壓作用的研究，廣州醫(yī)藥，1999，30(4)1～3；金惠銘，盲腸結扎穿刺后的大鼠敗血癥模型，中國病理生理雜志，1990，6(2)126；蔣建新，汪江淮等，敗血癥大鼠肝、腎、心、肺線粒體功能的變化，中國病理生理雜志，1993，9(2)183～186)。健康大鼠體重150-300g，實驗前一周飼養(yǎng)于實驗室，實驗當天清晨開始對大鼠禁食。當天下午開始手術，乙醚麻醉，常規(guī)消毒腹部，切口長約2cm，打開腹腔后小心分離盲腸。然后用3～0號絲線環(huán)形結扎盲腸，在與腸系膜相對的盲腸腸壁漿膜面用9號針頭穿刺數(shù)次，第一個針孔距盲腸盲端約3mm。輕輕將腸子放回原處，關閉腹腔，逐層縫合。術后即刻皮下注射生理鹽水，補充手術過程中體液的丟失，劑量為5ml/100g體重。回籠自然喂養(yǎng)。
4.2測定敗血癥性休克模型大鼠的血壓盲腸結扎穿孔術后18小時，把存活動物隨機分為生理鹽水組、氨基胍組、19號藥物組、22號藥物組和29號藥物組，共5組。在戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉下，常規(guī)消毒頸部皮膚，切開頸部皮膚，小心分離右側頸靜脈及左側頸動脈，各插入導管并保留，肝素生理鹽水溶液(50μ/ml)抗凝，將頸動脈導管連接到傳感器，接到多道生理記錄儀上，待血壓穩(wěn)定后，從頸靜脈導管分別注入生理鹽水、氨基胍、11號藥物、18號藥物、28號藥物，藥物濃度均為50mg/kg。描記給藥前及給藥后5、10、20、30、40、50、60分鐘的血壓值，包括收縮壓、舒張壓，并計算平均動脈壓。
平均動脈壓＝舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓)統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)表示X±SD，計量資料用student’st檢驗比較差異的統(tǒng)計學意義。實驗結果體征改變造模12小時后病變逐漸明顯，如活動減少，不再合群取暖，嗜睡，豎毛，不飲水，有時出現(xiàn)呼吸急促、膿尿、腹瀉、眼角出現(xiàn)滲出物等，并有少部分動物死亡。各組平均動脈壓的改變各組血壓在給藥前無明顯差異，給藥后可見各組血壓逐漸上升，5分鐘開始就有變化，10分鐘后可見各組血壓與生理鹽水組相比均有顯著性差異，P＜0.01，具體測定數(shù)據(jù)見表2。
表2用藥前和用藥后不同時間間隔的血壓(n＝8，X±SmmHg)MAP(mmHg)組0min 5min 10min 20min對照組 70.41±9.22 73.83±8.63 73.13±9.17 72.79±7.7973.75± 85.79± 91.46±96.17±AG10.6311.86*10.39**9.17**89.50±95.58±No11 67.33±5.27 83.99±6.25*3.99**4.01**87.04±91.58±No18 68.46±3.78 81.04±6.365.88**5.17**88.75±91.17± 98.83±No28 70.25±5.627.89**8.49**4.69**30min40min 50min 60min對照組 74.58±8.62 74.08±6.82 77.71±7.26 72.17±7.48100.29±102.33± 102.71± 104.34±AG7.52**9.18**5.64**7.27**99.88± 100.71± 104.21± 102.29±No112.14**3.03**2.45**2.83**92.63± 97.38± 99.42± 100.29±No185.01**3.72**3.09**3.21**98.46± 104.62± 102.71± 103.04±No284.47**5.36**4.55**4.08***P＜0.05vs對照組group**P＜0.01vs對照組group
給藥前(0min)各組動物頸動脈平均血壓較低，這種持續(xù)低血壓的一個主要原因正是在腹腔感染的基礎上iNOS被激活產生大量NO所致。經給予不同藥物處理后，發(fā)現(xiàn)通式I蝶啶類衍生物(11、18、28)和陽性對照藥(AG)的效能相似，有明顯升高大鼠平均動脈壓的作用，而給予生理鹽水的大鼠(對照組)由于病程還在繼續(xù)，血壓有繼續(xù)下降的趨勢。(3)通式I蝶啶類衍生物對小鼠免疫型肝損傷的作用研究a、原理與方法給小鼠注射短小棒狀桿菌或卡介苗可使多核中性粒細胞或巨噬細胞聚集于肝臟，繼后再用低劑量大腸肝菌脂多糖攻擊注射，可激發(fā)這些細胞釋放對肝細胞有毒性作用的可溶性因子，造成免疫性肝損傷(參見T.R.Billiar，R.D.Curran，D.J.Stuegr，et al，Inducible cytosolic enzyme for the production of nitric oxides from L-arginine in hepatocytes，Biochemical and biophysical research communications，1990，168(3)1034～1040；HarbrechtBG，Billiar TR，Stadler J，et al，Nitric oxide synthesis serves to reduce hepatic damage duringacute murine endotoxemia，Crit Care Med，1992，201568～1574；Curran RD，F(xiàn)errari FK，Kispert PH，et al，Nitric oxide and nitric oxide-generating compounds inhibit hepatocyte proteinsynthesis，F(xiàn)ASEB J，1991，52085～2092)。實驗可見血中谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)以及一氧化氮(NO)濃度顯著升高(參見AndreasAK，Silvio MD，LiuZZ，F(xiàn)urthercharateriaztion and comparison of inducible nitric oxide synthase in mouse rat and humanhepatocytes，Hepatology，1995，211552～1560；Geller DA，Lowenstein CJ，Shapiro RA，et al.Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes，Proc Natl Acad Sci USA，1993，903491～3495)。通過與正常對照組相比較，如果給藥組動物血清中升高的轉氨酶顯著降低，肝臟病理損傷明顯減輕，指標顯示有顯著性差異，則可判斷此種藥物有效(參見徐淑云，卞如濂等，藥理實驗方法學，北京人民衛(wèi)生出版社，19931400)。
三個通式I蝶啶類衍生物(為表1中帶*號者)和氨基胍(AG)。
短小棒狀桿菌(CP) 由常州藥業(yè)延申生物技術有限公司提供細菌脂多糖(LPS) 南京生興生物技術有限公司 進口分裝谷丙轉氨酶試劑盒、谷草轉氨酶試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供昆明種小鼠，雄性，體重18-22g由江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供合格證號SXCK(蘇)2002-0027小鼠免疫性肝損傷模型的制備小鼠隨機分組每組10只，分為模型組、環(huán)磷酰胺(CY)組、氨基胍組、11號藥物組、18號藥物組、28號藥物組、生理鹽水組。
正常對照組和模型組都給予等體積的溶劑。由尾靜脈注射短小棒狀桿菌(LP)0.5mg/只一次，于給藥后第5、7、9天分別腹腔注射各組藥物，劑量都為30mg/kg。并于給短小棒狀桿菌的第10天給予細菌脂多糖(LPS)10μg/只一次，12小時后處死小鼠，取血清測定谷丙轉氨酶活性、谷草轉氨酶活性、及一氧化氮濃度。
實驗數(shù)據(jù)表示成X±SD，計量資料用student′st檢驗比較差異的統(tǒng)計學意義。
實驗結果經尾靜脈注射短小棒狀桿菌5-7天后，各組小鼠出現(xiàn)攻擊性增強，激惹易怒，相互撕打、嚙咬，全身皮膚粘膜紅腫，多處潰瘍，尤以足跖部及尾部明顯。從給CP后第5天開始給各組藥物，給藥組癥狀有所減輕。在給予LPS后模型組部分小鼠出現(xiàn)死亡。
與正常對照組相比，模型組NO、GPT、GOT都有顯著性差異P＜0.01；與模型組相比，各給藥組的NO、GPT、GOT都有明顯差異P＜0.01(見Tab 3.1、3.2、3.3)。
表3.1 NO濃度(n＝8，X±S 10-5mol/L)組別 NO(1E-5mol/L)對照組 1.819±0.179模型組 5.003±0.893##CY 1.542±0.452**AG 2.075±0.168**No11 2.749±0.293**No18 3.157±0.351**No28 3.032±0.327**##P＜0.01vs對照組group**P＜0.01vs模型組group表3.2 GPT的活性(n＝8，X±Su/ml)組別GPT(u/ml)對照組 25.895±9.875模型組 136.812±16.139##
CY 33.299±7.212**AG 49.129±6.542**No11 52.271±5.122**No18 53.473±2.220**No28 53.669±4.339**##P＜0.01vs對照組group**P＜0.01vs模型組group表.3 GOT的活性(n＝8，X±Su/ml)組別 GOT(u/ml)對照組 27.908±12.506模型組 140.583±9.632##CY 49.735±13.563**AG 71.006±4.166**No11 70.338±10.334**No18 68.215±14.159**No28 73.379±6.692**##P＜0.01vs對照組group**P＜0.01vs模型組group以上結果顯示，通式II蝶啶類衍生物和氨基胍的作用一致，能明顯減輕小鼠免疫性肝損傷的程度，降低血清中一氧化氮濃度、谷丙轉氨酶活性和谷草轉氨酶活性。
權利要求
1.下述通式(I)表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽 R代表氫；羥基取代或無取代基的C1-C8直鏈或支鏈的烷基；C1-C8直鏈或支鏈的烷氧基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的芳基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的胺基；-NHC6H4COOR5或-N(CH3)C6H4COOR5，R5為C1-C4直鏈或支鏈烷基；-NHC6H4COGlu或-N(CH3)C6H4COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；-NHC6H4COR6或-N(CH3)C6H4COR6，R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；R1代表H；苯基、C1-C5直鏈或支鏈的烷基；C1-C5直鏈或支鏈的烷氧基；羥基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；R2和R3相同或不同，各自獨立地表示C1-C6直鏈或支鏈的烷基；芐基；R2和R3不同時為H；R2為H或甲基時，R3代表三元～六元環(huán)烷基；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10、-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10，R9和R10相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基；或者NR2R3代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪或三元～五元脂肪環(huán)單或二胺基；通式(I)不包括當NR2R3為N(CH2CH3)2或六氫吡啶基時，R為C6H5或p-H3COC6H4的化合物。
2.權利要求1表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽，其中R代表氫、羥基單取代或無取代基的C1-C5直鏈或支鏈的烷基；苯基、對甲基苯基；對甲氧基苯基；-CH2OH；(C1-C5)烷氧基；胺基；-NHC6H4COOR5或-N(CH3)C6H4COOR5，R5為甲基、乙基、異丙基；-NHC6H4COGlu或-N(CH3)C6H4COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；NHC6H4COR6或N(CH3)C6H4COR6，R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；R1代表氫，甲基，乙基、羥基，甲氧基，氨基；R2與R3相同，為甲基、乙基、丙基、芐基；R2代表H時，R3為乙基、異丙基、環(huán)丙基、-C6H4CO-谷氨酸二甲(或乙)酯，-C6H4CH2CO-谷氨酸二甲(或乙)酯，-C6H4COOMe/Et，C6H4CH2COOMe/Et；R2為甲基時，R3代表乙基、C6H4COGluMe2/Et2、C6H4CH2COGluMe2/Et2、C6H4COOMe/Et、C6H4CH2COOMe/Et；或者NR2R3代表環(huán)丙胺基、環(huán)丁胺基、1，2-環(huán)丁二胺基。
3.權利要求2表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽，其中R代表乙基、丙基、苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、C2-C4烷氧基、NHCHCOOR5，R5為甲基、乙基；R1代表氫、甲基、羥基。
4.下述通式(II)表示的蝶啶化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抑制誘導性一氧化氮合成酶藥物中的應用， R代表氫；羥基取代或無取代基的C1-C8直鏈或支鏈的烷基；C1-C8直鏈或支鏈的烷氧基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的芳基；C1-C5直鏈或支鏈的烷基或烷氧基取代或無取代基的胺基；-NHC6H4COOR5或-N(CH3)C6H4COOR5，R5為C1-C4直鏈或支鏈烷基；-NHC6H4COGlu或-N(CH3)C6H4COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；NHC6H4COR6或N(CH3)C6H4COR6，R6為Nω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；R1代表H；C1-C5直鏈或支鏈的烷基；C1-C5直鏈或支鏈的烷氧基；羥基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；R2和R3相同或不同，各自獨立地表示H；C1-C6直鏈或支鏈的烷基；芐基；R2為H或甲基時，R3代表三元～六元環(huán)烷基；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR7)CH2CH2COOR8，R7與R8相同或不同，各自獨立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10、-C6H4COOR9R10、-C6H4CH2COOR9R10，R9和R103相同或不同，各自獨立地表示H、甲基、乙基；或者NR2R3代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪或三元～五元脂肪環(huán)單或雙胺基。
5.權利要求4所述的應用，是制備在敗血性和/或出血性休克或用細胞毒素進行腫瘤化學治療和肝硬化或肝萎縮和/或肝功能衰退時所引起的血壓下降或/和止血障礙藥物。
6.權利要求4所述的應用，是制備預防和治療炎癥疾病藥物。
7.權利要求4所述的應用，是制備預防和治療異體器官和組織移植的排斥反應藥物以及胰島素依賴型糖尿病藥物。
8.權利要求4所述的應用，是制備預防和治療細胞毒素進行腫瘤的化學治療、化學物質或藥物以及慢性肝炎引發(fā)的多種肝損傷、肝功能衰退以及預防和治療心肌梗塞損傷、病毒性心肌炎藥物。
9.權利要求4所述的應用，是制備預防和治療病毒性神經退化、變化疾病及痛覺過敏、癲癇、偏頭痛藥物。
10.藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1的蝶啶化合物或其藥用鹽，并含有常規(guī)藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)所表述的蝶啶衍生物，為NO合成酶，特別是誘導型NO合成酶的抑制劑，用以制備預防和治療體內由于NO水平升高而介導疾病的藥物。
文檔編號A61P3/10GK1546491SQ200310106588
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權日2003年12月10日
發(fā)明者姚其正, 王秋娟, 呂剛, 周衛(wèi)芬, 唐鋒, 毛利姆 申請人:中國藥科大學