本發(fā)明涉及中藥提取領(lǐng)域，具體是一種菊花中多酚氧化酶快速高效提取測定方法。
背景技術(shù)：
：多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，簡稱PPO)是核編碼的銅金屬酶，在植物組織中，多酚氧化酶是與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起的，天然狀態(tài)無活性，但將組織勻漿或損傷后酶活被活化，從而表現(xiàn)出活性。多酚氧化酶催化多酚氧化成醌，醌聚合并與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，結(jié)果發(fā)生黑色素沉淀，這就是新鮮花類藥材的褐化原因。藥材褐化，直接影響美觀；藥商從經(jīng)濟利益考慮，為節(jié)約成本，多采用硫磺熏，硫磺燃燒產(chǎn)生SO2，污染藥材，影響藥質(zhì)。2015版中國藥典一部菊花規(guī)定，“本品按干燥品計算，含綠原酸(C16H18O9)不得少于0.2％”，新鮮采摘菊花藥材擠壓受損后，多酚氧化酶發(fā)生催化作用，藥材顏色褐化，綠原酸屬于反應(yīng)底物，含量顯著降低。通過對多酚氧化酶的研究發(fā)現(xiàn)許多條件能影響花類藥材褐化的發(fā)生。必需具備的條件有三個，底物(多酚類物質(zhì))、氧和多酚氧化酶。準確測定多酚氧化酶的活性，對預(yù)防藥材褐化的發(fā)生及尋找有效保障藥材質(zhì)量的加工方法，具有實際重要性。多酚氧化酶活性測定的方法，一般有四種方法，分別為減壓法、氧電極法、比色法、碘量滴定法。其中比色法操作簡便，結(jié)果較準確。比色法又分為終止法(反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜分析)和記時法(測定反應(yīng)的動力學(xué)分析。終止法，一般是利用終止劑三氯乙酸將反應(yīng)終止的方法，記時法，則要求在單位時間內(nèi)完成。終止法簡單易行，但準確性不如記時法，記時法則對實驗條件要求較高。具體如下：1、粗酶液的制備方法一：稱取馬鈴薯植物組織20g，加入2g不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和100mL0.1mmol/LL磷酸緩沖液(pH6.5)，于勻漿機中打碎成勻漿，用尼龍網(wǎng)袋(或紗布袋)過濾，濾液中加入30％飽和度硫酸銨，離心除去沉淀，上清液再加硫酸銨使達60％飽和度，離心收集沉淀，將所得沉淀溶于少量0.01％mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)中，即為粗酶液。上述實驗方法出處《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》中國科學(xué)院上海植物生理研究所、上海市植物生理學(xué)會編；《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》周祖富、黎兆安主編廣西大學(xué)。方法二：稱取4g馬鈴薯植物組織，加入5倍量(m/v)的0.1mol/LpH6.8檸檬酸-磷酸緩沖液及0.8g聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨，4層紗布過濾，10000r/min離心15min，上清液用于酶活力測定。上述實驗方法出處《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》二版，陳建勛、王曉峰主編的《生科學(xué)與工程系列教材》。2、酶活性測定：采用比色法測定。終止法，配置酶的反應(yīng)體系中，包括3.9mL0.05mol/L、pH5.5磷酸緩沖液、1.0mL/L兒茶酚和0.1mL酶液。以煮過失活的酶液為對照，做兩組重復(fù)實驗，反應(yīng)體系加入酶液后，于37℃中保濕10min，迅速放入冰浴中，立即加入2mL20％三氯乙酸，以5000轉(zhuǎn)速離心10min，收集上清液，并適當(dāng)?shù)南♂?，?25nm波長下測定其光密度。上述實驗方法出處《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》中國科學(xué)院上海植物生理研究所、上海市植物生理學(xué)會編；《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》周祖富、黎兆安主編廣西大學(xué)。記時法1，3mL酶活力測定反應(yīng)液，測定OD398值的變化，以每minΔOD398變化0.01表示一個酶活力單位。上述實驗方法出處《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》二版，陳建勛、王曉峰主編的《生物科學(xué)與工程系列教材》。記時法2，在試管中加入3.9ml0.05mol·L-1pH5.5磷酸緩沖液，1.0ml0.1mol·L-1兒茶酚在37℃恒溫水浴中保溫10min，然后加入0.5ml酶液(可視酶活性增減用量)，迅速搖勻，倒入比色杯內(nèi)，于525nm波長處以時間掃描方式，在1～2min內(nèi)測定吸光度變化(A)值。《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》周祖富、黎兆安主編廣西大學(xué)。3、上述兩種粗酶液的制備實驗方法存在缺陷：(1)粗酶液制備方法一存在缺陷植物組織用量過多；磷酸緩沖液量過大；勻漿時必須用液氮冷凍勻漿機，大多數(shù)實驗室都不具備該項設(shè)備；硫酸銨反復(fù)去除雜蛋白，此項操作過于繁瑣，實際運用中，沉淀很難獲得，實驗因此中斷無法繼續(xù)。(2)粗酶液制備方法二存在缺陷植物組織用量多，緩沖鹽用量大，研缽小，實際操作中需要分次進行，相對一次操作，誤差增多；4層紗布過濾，實際操作中繁瑣，粗酶液損耗大；離心機轉(zhuǎn)速過高，時間過長。(3)植物組織局限于馬鈴薯4、酶的活性比色法測定存在缺陷(1)終止法存在缺陷生物化學(xué)教材指出，酶反應(yīng)迅速，3min之內(nèi)反應(yīng)基本完成。另有實驗證明反應(yīng)產(chǎn)物410nm波長吸光度最大。(2)記時法存在缺陷記時法1，根據(jù)《生物化學(xué)》酶相關(guān)章節(jié)要求沒有明確酶反應(yīng)的最適溫度，沒有記錄酶活力計算相關(guān)公式。記時法2，酶反應(yīng)底物緩沖液PH值5.5與粗酶液制備緩沖液pH6.5，pH值不一致，增加實驗復(fù)雜程度；另有實驗證明410nm波長吸光值最大；緩沖液，反應(yīng)底物，酶液合計4.9ml，比色皿試驗容積3mI，實際操作傾倒液體時誤差大，另外酶液用量過高；另有實驗證明410nm波長吸光值最大；根據(jù)《生物化學(xué)》酶相關(guān)章節(jié)要求測定酶活力，應(yīng)測定酶促反應(yīng)的初速率，實驗證明1-2min反應(yīng)速率相對1min內(nèi)已降低，不屬于初速率時間范圍。針對以上多酚氧化酶的提取測定方式存在各種缺點，本發(fā)明提出一種新的提取測定方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種菊花中多酚氧化酶快速高效提取測定方法，以解決上述
背景技術(shù)：
中提出的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種菊花中多酚氧化酶快速高效提取測定方法，步驟如下：(1)多酚氧化酶粗酶液的提?。喝【栈?，加入石英砂、聚乙烯吡咯烷酮以及檸檬酸-磷酸緩沖液，冰浴上混合均勻研磨成勻漿后，倒入離心管；然后用剩余的檸檬酸-磷酸緩沖液沖洗研缽，再次倒入離心管，混合均勻；然后放置3～5℃的冰箱中冷藏浸置22～26h；取出后，放入冷凍離心機中進行離心5～7min，冷凍離心機溫度為3～5℃；靜置3～5min；提取上清液至離心管中再次離心5～7min，再靜置3～5min，取上清液，即為粗酶液；以上操作條件溫和，全部操作在0～5℃間進行；(2)多酚氧化酶活力測定：將含反應(yīng)底物鄰苯二酚的緩沖液移入離心管中，與上述的粗酶液分別放入36～38℃的水浴鍋保溫5～7min；移取粗酶液，迅速加入鄰苯二酚緩沖液中，搖勻后迅速倒入比色皿，同步開始記時；同時將粗酶液放入99～101℃的水中煮4～6min，將煮死的酶液作為對照；測ΔOD410nm波長處值的變化，每隔1min讀數(shù)一次，以每min內(nèi)A410值增加0.01表示一個酶活力單位，記時3min，按照如下公式計算多酚氧化酶的活力，式中：A為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化值；計算A值，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率吸光度的變化值，A＝(吸光度值-初始吸光度值)/min。作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟(1)中，菊花與聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為4.5～5.5∶1，檸檬酸-磷酸緩沖液重研磨用量與沖洗用量的體積比為0.7～1.5∶1。作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟(1)中，勻漿后冷藏浸置的時間22～26h。作為本發(fā)明再進一步的方案：所述步驟(1)中的兩次離心過程，第一次離心的轉(zhuǎn)速為4800～5200r/min，第二次離心的轉(zhuǎn)速為5800～6200r/min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1、多酚氧化酶廣泛存在于植物體的各種組織和器官中?，F(xiàn)有技術(shù)選用的原料，用量大。本發(fā)明選用的原料用量少，采用冰浴研磨，勻漿準確，勿需冰凍勻漿機。2、本發(fā)明聚乙烯吡咯烷酮適量，與多酚化合物形成絡(luò)合物，發(fā)揮穩(wěn)定作用。與現(xiàn)有技術(shù)聚乙烯吡咯烷酮需要天平稱量精確相比，簡化了聚乙烯吡咯烷酮加量的操作程序。3、本發(fā)明4℃勻漿浸置24h，多酚氧化酶可充分浸出。與現(xiàn)有技術(shù)直接過濾相比，保障多酚氧化酶的提取充分。4、本發(fā)明采用兩次離心，分別提取上清液，與原有不同飽和度硫酸銨分級沉淀或者4層紗布過濾相比，簡化了操作程序，避免操作程序多引起的誤差，同時冷凍離心機轉(zhuǎn)速減小，時間縮短，減少了機器損耗。5、多酚氧化酶反應(yīng)時需要溫度在37℃左右，溫度過低酶反應(yīng)慢，溫度過高則酶易失活，本發(fā)明則反應(yīng)迅速。6、通過實驗本發(fā)明適用于任何加工方式的菊花，例如新鮮菊花、不同溫度熱風(fēng)干燥菊花、不同時間段微波干燥菊花、水蒸汽蒸菊花等等加工方式多酚氧化酶的測定。附圖說明圖1-圖4為不同熱風(fēng)溫度加工方式下菊花多酚氧化酶的活性變化趨勢圖。圖5為水蒸氣加工方式下菊花多酚氧化酶的活性變化趨勢圖。圖6為微波加工方式下菊花多酚氧化酶的活性變化趨勢圖。圖7為新鮮菊花的多酚氧化酶在不同加熱溫度下的活性變化趨勢圖。圖8為80℃熱風(fēng)干燥1h的菊花多酚氧化酶在不同溫度下的活性變化趨勢圖。圖9為水蒸氣蒸5s后的菊花多酚氧化酶在不同溫度下的活性變化趨勢圖。圖10為水蒸氣加工方式5s、10s、15s、30s四個不同時間段下菊花多酚氧化酶的活性變化趨勢圖。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。1、實驗材料：菊花2、儀器設(shè)備：-80℃冰箱、研缽、制冰機、14mL離心管、1.5mL離心管、4mL離心管、移液槍、4℃恒溫冰箱、冷凍離心機、水浴鍋、紫外分光光度計；3、試劑藥品：0.1mol/LpH6.8檸檬酸-磷酸緩沖液、鄰苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮；4、實驗步驟(1)多酚氧化酶粗酶液的提?。喝?.5g菊花，加入石英砂、0.1g聚乙烯吡咯烷酮，5mL檸檬酸-磷酸緩沖液(其中2-3mL緩沖液可用于研磨，剩余緩沖液沖洗研缽)冰浴研磨成勻漿后，倒入14mL規(guī)格離心管，放置4℃冰箱冷藏浸置24h；冷凍離心機溫度設(shè)置4℃，轉(zhuǎn)速5000r/min離心6min；提取上清液至1.5mL離心管，6000r/min再次離心6min，上清液即為粗酶液。(2)多酚氧化酶活力測定：水浴鍋溫度設(shè)置37℃，將含反應(yīng)底物10mmol鄰苯二酚的緩沖液2.9mL移入4mL離心管；將上述緩沖液及粗酶液分別放入水浴鍋保溫6min；移100μL粗酶液，迅速加入上述緩沖液中，搖勻后迅速倒入比色皿，同步開始記時；將粗酶液放入100℃水中煮5min，煮死的酶液作為對照；測ΔOD410nm波長處值的變化，每隔1min讀數(shù)一次，以每min增加0.01表示一個酶活力單位，記時3min。酶活力計算公式以每min內(nèi)A410值增加0.01為1個酶活力單位，按下式計算多酚氧化酶的活力，公式中：A為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化值。計算A值，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率吸光度的變化值，A＝(吸光度值-初始吸光度值)/min。具體實驗例實驗例1：50℃熱風(fēng)干燥加工方式菊花不同時間段多酚氧化酶的活性測定取樣時間分別為15min、30min、1h、2h、1h、4h、6h、8h、10h，每個時間段分別取0.5g藥材，提取粗酶液，測定酶的活性，于410nm波長處以時間掃描方式，每隔1min計數(shù)一次，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率的吸光度的變化值。根據(jù)公式計算酶的活力。結(jié)果顯示加工時間達到10h，酶的活性相對較高。取樣時間酶活15min150030min10001h15002h3004h5006h6508h190010h1200實驗例2：60℃熱風(fēng)干燥加工方式菊花不同時間段多酚氧化酶的活性測定取樣時間分別為15min、30min、1h、2h、1h、4h、6h、8h，每個時間段分別取0.5g藥材，提取粗酶液，測定酶的活性，于410nm波長處以時間掃描方式，每隔1min計數(shù)一次，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率的吸光度的變化值。根據(jù)公式計算酶的活力。結(jié)果顯示加工時間達到8h，酶的活性仍然高。實驗例3：70℃熱風(fēng)干燥加工方式菊花不同時間段多酚氧化酶的活性測定取樣時間分別為2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h，每個時間段分別取0.5g藥材，提取粗酶液，測定酶的活性，于410nm波長處以時間掃描方式，每隔1min計數(shù)一次，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率的吸光度的變化值，根據(jù)公式計算酶的活力。結(jié)果與前兩組數(shù)據(jù)比較溫度升高酶活相對降低。取樣時間酶活2min4505min55015min45030min3501h4502h6504h6506h900實驗例4：80℃熱風(fēng)干燥加工方式菊花不同時間段多酚氧化酶的活性測定取樣時間分別為2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h，每個時間段分別取0.5g藥材，提取粗酶液，測定酶的活性，于410nm波長處以時間掃描方式，每隔1min計數(shù)一次，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率吸光度的變化值，根據(jù)公式計算酶的活力。結(jié)果顯示加工時間達到6h，酶失活。取樣時間酶活2min3505min30015min35030min2001h3002h1504h506h0實驗例5：水蒸汽加工方式菊花不同時間段多酚氧化酶的活性測定取樣時間分別為5s、10s、30s、45s、60s、90s、2min，每個時間段分別取0.5g藥材，提取粗酶液，測定酶的活性，于410nm波長處以時間掃描方式，每隔1min計數(shù)一次，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率的吸光度的變化值，根據(jù)公式計算酶的活力。結(jié)果顯示加工時間30s以上，酶失活。取樣時間酶活5s50010s70015s30030s060s090s02min0實驗例6：微波加工方式菊花不同時間段多酚氧化酶的活性測定取樣時間分別為15s、30s、45s、60s、2min、4min、6min、8min、10min、12min每個時間段分別取0.5g，提取粗酶液，測定酶的活性，于410nm波長處以時間掃描方式，每隔1min計數(shù)一次，取1min內(nèi)反應(yīng)初速率的吸光度的變化值，根據(jù)公式計算酶的活力。結(jié)果顯示加工時間12min，酶失活。取樣時間酶活15s20030s50045s35060s5002min2504min1006min1508min10010min10012min0實驗例7：最適多酚氧化酶反應(yīng)溫度測定隨機抽取3組粗酶液，水浴鍋溫度分別設(shè)置為17℃、27℃、37℃、47℃、57℃。將裝有2.9ml反應(yīng)底物及待測酶液100μL的離心管分別放入不同設(shè)置溫度時的水浴鍋保溫6min后，混勻倒入比色皿，同時計時，讀取吸光值。具體操作同上。結(jié)果顯示37℃酶活性最大。新鮮菊花提取的多酚氧化酶粗酶液及反應(yīng)底物不同溫度保溫后反應(yīng)，結(jié)果顯示37℃吸光值最大。取樣溫度酶活17℃45027℃60037℃65047℃50057℃400菊花80℃熱風(fēng)干燥1h后提取的多酚氧化酶粗酶液及反應(yīng)底物不同溫度保溫后反應(yīng)，結(jié)果顯示37℃吸光值最大。取樣溫度酶活17℃25027℃25037℃30047℃25057℃250菊花水蒸氣蒸5s后提取的多酚氧化酶粗酶液及反應(yīng)底物不同溫度保溫后反應(yīng)，結(jié)果顯示37℃吸光值最大。取樣溫度酶活17℃40027℃45037℃50047℃35057℃200實驗例8：水蒸氣加工方式5s、10s、15s、30s四個不同時間段菊花多酚氧化酶粗酶液制備及活性測定序號取樣時間初始值1min2min3min酶活15s0.2490.3490.3850.388500210s0.2180.3580.3970.392700315s0.1060.1660.1720.170300430s0.0770.0850.090.0890本發(fā)明明確了藥材取用量0.5g，多酚氧化酶與底物反應(yīng)最適溫度37℃，最適緩沖液pH6.8，最適反應(yīng)底物濃度10mmol，粗酶液勻漿浸置時間24h，提取粗酶液上清液采取2次離心，410nm處測1min內(nèi)初速率的光吸收變化。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3