本發(fā)明涉及引入外來遺傳物質(zhì)修飾細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種CAR修飾的NK細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)：

自然殺傷 (Natural Killer，縮寫NK)細(xì)胞是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，先天免疫系統(tǒng)反應(yīng)的關(guān)鍵性介質(zhì)細(xì)胞。NK細(xì)胞是一種廣譜免疫細(xì)胞，具有快速發(fā)現(xiàn)和摧毀異常細(xì)胞(如癌癥或病毒感染的細(xì)胞)的特異功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示強(qiáng)大的溶解異常細(xì)胞的活性。使用免疫細(xì)胞（包括NK細(xì)胞）來治療癌癥是近年來新趨勢(shì)，這種新療法有望為對(duì)傳統(tǒng)手術(shù)、化療和放療無效的腫瘤提供了新的治愈希望。

嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor，縮寫CAR）修飾的免疫細(xì)胞使用遺傳生物工程手段修飾免疫細(xì)胞使其表達(dá)外源性抗腫瘤基因。CAR基因主要包括細(xì)胞外識(shí)別域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：前者用于識(shí)別腫瘤表面特異性分子和后者用于啟動(dòng)識(shí)別腫瘤表面分子后的免疫細(xì)胞應(yīng)答，發(fā)揮細(xì)胞毒作用。其主要以T-細(xì)胞為載體，但CAR-T細(xì)胞存在細(xì)胞因子風(fēng)暴，靶向/脫靶毒性和神經(jīng)毒性等問題.

抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity，縮寫ADCC）是抗體首先結(jié)合到癌靶細(xì)胞上，然后抗體的另一端與免疫效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞殺死被抗體結(jié)合的癌靶細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種CAR修飾的NK細(xì)胞的制備方法，使自然殺傷細(xì)胞同時(shí)具有嵌合抗原受體修飾，以及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

CAR修飾的NK細(xì)胞的制備方法，構(gòu)建成含特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員的嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞；

所述CAR基因的cDNA構(gòu)建在病毒載體中，并轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞，再將NK細(xì)胞培養(yǎng)到第21天，獲得CAR-NK細(xì)胞；通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)，轉(zhuǎn)染了CAR病毒載體的NK細(xì)胞其表達(dá)CAR基因高于未轉(zhuǎn)染的NK細(xì)胞為50倍以上；

所獲得的CAR-NK細(xì)胞能高表達(dá)CAR基因，可特異結(jié)合表達(dá)信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員的腫瘤細(xì)胞，并抑制NK細(xì)胞抑制性受體表達(dá)，阻止了腫瘤細(xì)胞免疫逃避，同時(shí)激活第一信號(hào)和共刺激信號(hào)；其高表達(dá)其特異標(biāo)志物CD16，陽性率高于80％以上，激活性受體陽性率超過80％以上，而抑制性受體陽性率低于10％以下。

所述的含特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員7的單鏈抗體并串聯(lián)了兩個(gè)共刺激分子胞內(nèi)域和CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的基因片段；所述兩個(gè)共刺激分子為CD28和CD137。

所述NK細(xì)胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個(gè)核細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果是：

1）NK細(xì)胞是先天性細(xì)胞，非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有強(qiáng)大的腫瘤細(xì)胞溶解活性，不需要提前致敏或HLA配型，克服了某些腫瘤逃逸機(jī)制；

2）現(xiàn)有的CAR-T細(xì)胞只依靠CAR來識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞不同，可以同時(shí)通過多種NK細(xì)胞自身表達(dá)的激活型受體激發(fā)細(xì)胞毒性作用。也可以敲除NK細(xì)胞內(nèi)抑制性信號(hào)通路，或通過ADCC作用，來加強(qiáng)NK細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的作用；

3）現(xiàn)有以T細(xì)胞作為CAR基因載體，其異體應(yīng)用時(shí)會(huì)產(chǎn)生移植物抗宿主病 (GVHD）。由于NK細(xì)胞作用是非MHC-限制性，使用上沒有必要與病人個(gè)體的組織相容性復(fù)合物相匹配，也就是NK細(xì)胞可用于異體病人細(xì)胞治療，有可能建立從健康（異體）供體采集擴(kuò)增的off-the-shelf（“拿來即用”）的細(xì)胞藥品，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值；

4) NK細(xì)胞較易浸潤實(shí)體瘤。NK細(xì)胞在體內(nèi)可通過其獨(dú)特的作用機(jī)理，如與樹突狀細(xì)胞的相互作用及大量釋放一些重要的細(xì)胞因子，來修改實(shí)體瘤的免疫環(huán)境；

5）由于NK細(xì)胞在體內(nèi)生存較為短暫的性質(zhì)，臨床應(yīng)用時(shí)不用象CAR-T細(xì)胞那樣添加自殺基因；

6）NK細(xì)胞可利用其專門的IgG低親和力受體CD16與抗體結(jié)合，是體內(nèi)發(fā)揮ADCC作用的主要效應(yīng)細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)西妥昔單抗的治療作用主要是由于NK細(xì)胞的ADCC。因此，刺激NK細(xì)胞的先天免疫應(yīng)答，增強(qiáng)西妥昔單抗的ADCC作用。在西妥昔單抗使用上增強(qiáng)NK細(xì)胞的作用也能增強(qiáng)獲得性免疫（也稱特異性免疫或適應(yīng)性免疫反應(yīng)）反應(yīng)，因?yàn)镹K細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的“對(duì)話”，可導(dǎo)致西妥昔單抗治療中的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。

具體實(shí)施方式

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件（例如參考J. 薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社）或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

CAR修飾的NK細(xì)胞的制備方法，構(gòu)建成含特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員的嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞；所述CAR基因的cDNA構(gòu)建在病毒載體中，并轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞，再將NK細(xì)胞培養(yǎng)到第21天，獲得CAR-NK細(xì)胞；通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)，轉(zhuǎn)染了CAR病毒載體的NK細(xì)胞其表達(dá)CAR基因高于未轉(zhuǎn)染的NK細(xì)胞為50倍以上；所獲得的CAR-NK細(xì)胞能高表達(dá)CAR基因，可特異結(jié)合表達(dá)信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員的腫瘤細(xì)胞，并抑制NK細(xì)胞抑制性受體表達(dá)，阻止了腫瘤細(xì)胞免疫逃避，同時(shí)激活第一信號(hào)和共刺激信號(hào)；其高表達(dá)其特異標(biāo)志物CD16，陽性率高于80％以上，激活性受體陽性率超過80％以上，而抑制性受體陽性率低于10％以下。

其中，所述的含特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員7的單鏈抗體并串聯(lián)了兩個(gè)共刺激分子胞內(nèi)域和CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的基因片段；所述兩個(gè)共刺激分子為CD28和CD137。

進(jìn)一步，所述NK細(xì)胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個(gè)核細(xì)胞。