本發(fā)明涉及用于針對高致病性禽流感H5病毒的不同分支誘導(dǎo)廣泛抗體應(yīng)答的嵌合病毒樣顆粒疫苗。

背景技術(shù)：

1996年中國首先出現(xiàn)了高致病性禽流感(HPAI)亞洲H5N1病毒，這導(dǎo)致了動物疾病的爆發(fā)并被認(rèn)為是近百年來世界范圍內(nèi)最大的流行性疾病。繼而，亞洲H5N1病毒蔓延到亞洲、中東、歐洲和非洲，并由此致使超過4億家禽死亡或?qū)ζ溥M(jìn)行強(qiáng)制性處理。

HPAI H5病毒已經(jīng)獨立地演化為各種各樣的從基因?qū)W角度和抗原學(xué)角度分類的分支(Donis,R.O.,和G.J.Smith.2015.Nomenclature updates resulting from the evolution of avian influenza A(H5)virus clades 2.1.3.2a,2.2.1,and 2.3.4 during 2013-2014.Influenza and other respiratory viruses.doi 10.1111/irv.12324)，并由此已變得難以根除。此外，HPAI H5N1的持續(xù)性人類感染會引起人類流行性疾病的可能性。

為了降低經(jīng)濟(jì)損失和人類感染的風(fēng)險，家禽業(yè)需要一種針對HPAI H5的新策略。

HPAI H5的疫苗接種已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。然而，目前可獲得的疫苗是受限的，因為這些疫苗沒有展現(xiàn)出針對HPAI H5病毒的許多不同分支的廣泛保護(hù)性作用(Grund,C.,S.M.Abdelwhab el,A.S.Arafa,M.Ziller,M.K.Hassan,M.M.Aly,H.M.Hafez,T.C.Harder,和M.Beer.2011.Vaccine 29:5567-5573.doi 10.1016/j.vaccine.2011.01.006)。

已經(jīng)將病毒樣顆粒(以下簡稱為“VLP”)推薦作為新型的替代疫苗。在病毒學(xué)領(lǐng)域被認(rèn)為是非常重要的VLP是采用免疫原性蛋白質(zhì)制備的，并且VLP疫苗已經(jīng)表現(xiàn)出針對各種病毒性疾病的強(qiáng)保護(hù)性作用(Lee DH,Park JK,Song CS.2014.Clin Exp Vaccine Res 3:133-139；Li TC,Yamakawa Y,Suzuki K,Tatsumi M,Razak MA,Uchida T,Takeda N,Miyamura T.1997.J Virol 71:7207-7213；Buonaguro L,Tornesello ML,Tagliamonte M,Gallo RC,Wang LX,Kamin-Lewis R,Abdelwahab S,Lewis GK,Buonaguro FM.2006.J Virol 80:9134-91438-10)。

然而，尚未進(jìn)行對用于針對HPAI H5病毒的各種分支誘導(dǎo)廣泛免疫應(yīng)答的VLP的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

由此，本發(fā)明已經(jīng)在考慮到相關(guān)技術(shù)中遇到的上述問題，并且本發(fā)明意圖提供用于針對HPAI H5病毒的不同分支誘導(dǎo)廣泛免疫應(yīng)答的VLP。

本發(fā)明提供了嵌合VLP，其含有H5N1病毒分支1的血細(xì)胞凝集素基因(HA)、H5N1病毒分支2的血細(xì)胞凝集素基因(HA)和流感M1基因。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述H5N1病毒分支1的血細(xì)胞凝集素基因具有SEQ ID NO:1的堿基序列，所述H5N1病毒分支2的血細(xì)胞凝集素基因具有SEQ ID NO:2的堿基序列，以及所述流感M1基因具有SEQ ID NO:3的堿基序列，但本發(fā)明并不局限于此。

此外，本發(fā)明提供了抗原制劑，包含本發(fā)明所述的嵌合病毒樣顆粒和助劑或免疫刺激劑。

此外，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述的嵌合病毒樣顆粒的疫苗。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疫苗優(yōu)選具有對禽流感病毒性感染的保護(hù)性作用，但本發(fā)明并不局限于此。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，優(yōu)選地將所述疫苗與佐劑或免疫刺激劑一起配制，但本發(fā)明并不局限于此。

此外，本發(fā)明提供了針對非人動物體內(nèi)的禽流感感染誘導(dǎo)傳染免疫的方法，包含向所述非人動物體給予本發(fā)明所述的抗原制劑。

此外，本發(fā)明提供了針對非人動物體內(nèi)的禽流感病毒性感染誘導(dǎo)傳染免疫的方法，包含向所述非人動物給予本發(fā)明所述的疫苗。

此外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明所述的嵌合病毒樣顆粒的方法，包含：提供含有H5N1病毒分支1的血細(xì)胞凝集素基因和H5N1病毒分支2的血細(xì)胞凝集素基因的載體以及含有流感M1基因的載體，從而利用桿狀病毒表達(dá)體系分別制備出編碼所述分支1的血細(xì)胞凝集素基因和所述分支2的血細(xì)胞凝集素基因的重組桿狀病毒以及編碼所述流感M1基因的重組桿狀病毒；以及用所述重組桿狀病毒對昆蟲細(xì)胞進(jìn)行共感染。

在本發(fā)明中，VLP被用于配制成免疫原性組合物或藥物組合物。為此，將VLP調(diào)整至適當(dāng)?shù)臐舛炔⑴c適當(dāng)?shù)闹鷦?、稀釋劑或載體一起提供為制劑的形式?？梢詫⑸砩峡山邮艿呐囵B(yǎng)基用作載體或稀釋劑。其包含但不限于適當(dāng)?shù)母飨蛲耘囵B(yǎng)基、甘油、乙醇和其它典型溶劑，磷酸鹽緩沖鹽水等。適當(dāng)?shù)闹鷦┑氖纠梢园姿徜X；氫氧化鋁；MPLTM(3-O- 脫酰單磷酰脂A；RIBI免疫化學(xué)研究有限公司，漢密爾頓，MT，購自Corixa公司)；合成脂質(zhì)A類似物，諸如529(Corixa公司)；刺激子TM QS-21(拉奎拉生物制藥，弗雷明漢，MA)；IL-12(遺傳學(xué)研究所，劍橋，MA)；合成多核苷酸，諸如含有CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6,207,646(28))；大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素以及霍亂毒素(野生型或突變形式，例如，其中依據(jù)國際專利公開號WO 00/18434(29)谷氨酸的第29位氨基酸被另一氨基酸(優(yōu)選組氨酸)所代替)，但本發(fā)明并不局限于此。

在本發(fā)明的另一方面，將含有VLP的制劑用作免疫原組合物。可以將病毒與蛋白質(zhì)(例如白蛋白、明膠)、葡萄糖(例如蔗糖、乳糖、山梨醇)、氨基酸(例如谷氨酸鈉)、生理鹽水或低溫保護(hù)添加劑(諸如一些其它保護(hù)劑或穩(wěn)定劑)混合。該混合物被保持在液體狀態(tài)，或?qū)υ摶旌衔镞M(jìn)行干燥或凍干以便運輸和保存并在給藥前立即與水混合。

以下會給出本發(fā)明的詳細(xì)描述。

本發(fā)明的發(fā)明人還開發(fā)了采用桿狀病毒表達(dá)載體體系(BEVS)用于共表達(dá)來自HPAIH5病毒分支1和分支2的HA的嵌合VLP，并且在兩種主要畜禽物種(即雞和鴨)體內(nèi)對H5病毒的四種不同分支的免疫力進(jìn)行了評估。

根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)證明了相對于傳統(tǒng)VLP疫苗，嵌合VLP疫苗可以針對H5病毒的不同分支誘導(dǎo)出廣泛抗體應(yīng)答，從而可以提供用于開發(fā)更好地控制家禽物種體內(nèi)亞洲HPAIH5病毒的改進(jìn)疫苗的策略。

附圖說明

圖1A至1E顯示了含有來源于HPAI H5病毒不同分支的HA蛋白質(zhì)的H5VLP疫苗的產(chǎn)生和特性。其中圖1A展示了編碼分支1HA基因的重組桿狀病毒(rBV)、編碼分支2HA基因的重組桿狀病毒(rBV)、一起編碼分支1HA基因和分支2HA基因的重組桿狀病毒(rBV)、編碼流感M1基因的重組桿狀病毒(rBV)，這些重組桿狀病毒(rBV)用于感染草地夜蛾(Sf9)細(xì)胞；圖1B展示了通過用編碼HA基因的重組桿狀病毒(rBV)的任一個和編碼流感M1基因的重組桿狀病毒(rBV)對Sf9細(xì)胞進(jìn)行共感染而產(chǎn)生分支1VLP、分支2VLP和分支1+2VLP；圖1C展示了具有抗流感M1抗體的抗分支1單克隆抗體；圖1D展示了具有抗流感M1抗體的抗分支2單克隆抗體，其中通過利用圖1C的抗分支1單克隆抗體或圖1D的抗分支2單克隆抗體的免疫印記鑒定出了4微克的分支1VLP(泳道1)、分支2VLP(泳道2)和分支1+2VLP(泳道3)；以及圖1E展示了陰性染色的分支1+2H5VLP的透射型電子顯微鏡(TEM)圖像，標(biāo)尺指定100nm。

圖2A至2C顯示了在6周齡SPF雞(每組n＝10)體內(nèi)交叉分支HI測試結(jié)果，圖2A展示了使用分支1H5VLP疫苗的免疫，圖2B展示了使用分支2H5VLP疫苗的免疫，以及圖2C展示了使用嵌合H5VLP疫苗的免疫(每0.5微升劑量中40微克的VLP)，其中在單次免疫后3周獲取血清樣本并且利用分支1、2.1、2.3.2.1和2.5H5N1病毒確定HPAI H5N1病毒的不同分支的HI效價，以10只雞的平均HI抗體效價(Log2)計。

圖3A至3C顯示了5周齡SPF鴨(每組n＝10)體內(nèi)交叉分支HI測試結(jié)果，圖3A展示了使用分支1H5VLP疫苗的免疫，圖3B展示了使用分支2H5VLP疫苗的免疫，以及圖3C展示了使用嵌合H5VLP疫苗的免疫(每0.5微升劑量中40微克的VLP)，其中在單次免疫后3周獲取血清樣本，繼而以RDE進(jìn)行處理以去除非特異性HI因子，其中利用分支1、2.1、2.3.2.1和2.5H5N1病毒確定HPAI H5N1病毒的不同分支的HI效價，以10只鴨的平均HI抗體效價(Log2)計。

圖4A至4D顯示了以各種VLP疫苗免疫的雞的HI效價之間的統(tǒng)計分析結(jié)果，其中在免疫后3周分別針對圖4A、4B、4C和4D的分支1、分支2.1、分支2.3.2和分支2.5H5N1病毒測量了由分支1、分支2和嵌合VLP疫苗誘導(dǎo)的HI效價，以10只雞的平均HI抗體效價(Log2)計，其中*P<0.05并且***P<0.001(以Tukey-Kramer事后檢驗進(jìn)行方差分析)。

圖5A至5D顯示了以各種VLP疫苗免疫的鴨的HI效價之間的統(tǒng)計分析結(jié)果，其中在免疫后3周分別針對圖5A、5B、5C和5D的分支1、分支2.1、分支2.3.2和分支2.5H5N1病毒測量了由分支1、分支2和嵌合VLP疫苗誘導(dǎo)的HI效價，以10只鴨的平均HI抗體效價(Log2)計，其中**P<0.01并且***P<0.001(以Tukey-Kramer事后檢驗進(jìn)行方差分析)。

【保藏信息】

保藏單位：韓國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：韓國生命工學(xué)研究院；保藏編號：KCTC12845BP；保藏日期：20150612。分類命名：苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus。

具體實施方式

對本發(fā)明更好的理解可以通過以下非限制性示例而獲得，這些非限定性示例用于說明，而不能將其理解為限制本發(fā)明的范圍。

示例1：重組桿狀病毒的產(chǎn)生

為了克隆H5N1病毒分支1的完整長度的HA基因，不采用MBCS(多堿基裂解位點)(Bioneer，韓國)以化學(xué)方式合成A/越南/1194/2004(H5N1)的HA基因。為了克隆H5N1病毒分支2的完整長度的HA基因，從A/鴛鴦/K10-483/2010(H5N1,分支2.3.2.1)提取病毒RNA以擴(kuò)增HA基因(Hoffmann,E.,J.Stech,Y.Guan,R.G.Webster,和D.R.Perez.2001.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.Archives of virology 146:2275-2289)，然后去除MBCS，如Heckman,K.L.,和L.R.Pease.2007.Nature protocols 2:924-932.doi 10.1038/nprot.2007.132中所描述的。

將從病毒分支1或病毒分支2擴(kuò)增的HA基因克隆至pFastBac1載體中(Invitrogen公司,USA)，并將所獲得的質(zhì)粒稱為pFast_分支1和pFast_分支2。通過將pFast_分支2-來源的SnaBI-/HpaI-消化的片段克隆至pFast_分支1的HpaI-消化的位點而構(gòu)建含有來源于H5N1病毒分支1和分支2的HA基因的pFastBac1載體，并將所獲得的質(zhì)粒稱為pFast_分支1+2。通過將A/波多黎各/8/1934(H1N1)的完整長度的M1基因克隆至pFastBac1載體而構(gòu)建含有流感基質(zhì)(M1)基因的pFastBac1載體(Park,J.K.等人,2014.Clinical and vaccine immunology:CVI 21:360-365.doi 10.1128/CVI.00636-13)，并將所獲得的質(zhì)粒稱為pFast_M1。

采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)體系(Invitrogen公司)利用pFast_分支1、pFast_分支2、pFast_分支1+2和pFast_M1產(chǎn)生編碼分支1HA基因、編碼分支2HA基因、共同編碼分支1和分支2HA基因和編碼流感M1病毒的各個重組桿狀病毒(rBV)，并繼而稱為rBV_分支1、rBV_分支2、rBV_分支1+2和rBV_M1。通過采用草地夜蛾(Sf9)昆蟲細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑測定來測量rBV的效價。rBV_分支1+2于2015年6月12日保藏于坐落在南韓大田市儒城區(qū)的韓國人類基因庫，保藏編號KCTC 12845BP。

示例2：H5VLP的產(chǎn)生和特性以及VLP疫苗的產(chǎn)生

為了產(chǎn)生分支1H5VLP，用rBV_分支1和rBV_M1以5MOI(感染倍數(shù))對Sf9細(xì)胞進(jìn)行共感染。為了產(chǎn)生分支2H5VLP，用rBV_分支2和rBV_M1以5MOI(感染倍數(shù))對Sf9細(xì)胞進(jìn)行共感染。

為了產(chǎn)生嵌合H5VLP，用rBV_分支1+2和rBV_M1以5MOI(感染倍數(shù))對Sf9細(xì)胞進(jìn)行共感染。感染72小時后，通過在低RPM(2000×g，30分鐘，4℃)離心收集含有VLP的培養(yǎng)基并進(jìn)行清洗以去除大細(xì)胞碎片，然后使干凈的來源于上清液的VLP沉淀(30,000×g，1.5小時，4℃)。將沉淀物重新懸浮在以20至50％(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度加載的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液(pH 7.2)中，然后以非常高的RPM(150,000×g，1.5小時，4℃)離心并由此被純化。采用透射型電子顯微鏡(TEM，Tecnai G2Spirit,FEI,荷蘭,韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究院)觀察到了VLP的存在。

在各個VLP中，通過免疫印記利用鼠抗分支1H5單克隆抗體(Median diagnostics公司，韓國)、抗分支2H5單克隆抗體(Bionote公司，韓國)和兔抗M1多克隆抗體(免疫科技公司，美國)繼而通過HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠或抗兔IgG(AbD Serotec公司，英國)對HA蛋白質(zhì)和M1蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測。

通過Bradford蛋白檢測(Pierce，美國)根據(jù)制造商的說明書對各個H5VLP的最終蛋白濃度進(jìn)行定量。

為了產(chǎn)生H5VLP疫苗，以30:70(v/v)的比例將各個H5VLP乳化于油乳佐劑Montanide ISA70(SEPPIC，法國)，由此產(chǎn)生0.5毫升劑量中40微克的VLP。

示例3：動物免疫和血清免疫應(yīng)答的測定

將總共30只6周齡的SPF白來亨雞(Namduck Sanitec，韓國)分成3組(每組10只雞)。將總共30只5周齡的北京鴨(莫蘭食品育種公司，韓國)分成3組(每組10只鴨)。使用分支1、分支2或嵌合H5VLP疫苗使各組的雞或鴨經(jīng)受肌肉內(nèi)免疫(0.5mL/每只動物)。

為了測定免疫后的血清免疫應(yīng)答，在免疫后3周從接種了VLP疫苗的雞或鴨采集血清以用于采用H5N1病毒的不同分支進(jìn)行的交叉分支HI(血凝抑制)測試。

如Lee,D.H.等人2013.PloS one 8:e58186.doi 10.1371/journal.pone.0058186中所描述的，采用RG(反向遺傳學(xué))制備含有A/越南/1194/2004(分支1)，A/印度尼西亞/5/2005(分支2.1)，A/鴛鴦/K10-483/2010(分支2.3.2.1)或A/雞/韓國/ES/2003(分支2.5)的無MBCS的HA基因的H5N1病毒。根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)方法采用4個HA單元的H5N1病毒進(jìn)行HI測試。為了去除非特異性HI因子，用3個體積的受體破壞酶(Denka Seiken Co.，日本)在37℃對1體積的鴨血清處理16小時。

在設(shè)計本發(fā)明的過程中進(jìn)行的所有動物試驗是在建國大學(xué)動物倫理委員會的審查、批準(zhǔn)和監(jiān)督下進(jìn)行的。

進(jìn)行Tukey-Kramer事后檢驗的方差分析(ANOVA)以比較組間的血清抗體效價。具有P<0.05的結(jié)果視為統(tǒng)計學(xué)顯著的。

示例的結(jié)果如下。

嵌合H5VLP的表達(dá)和特性

采用BEV在Sf9細(xì)胞中生產(chǎn)含有分支1HA、分支2HA或分支1+HA的H5VLP(圖1A至1E)。在通過以非常高RPM離心的濃縮過程后，采用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化。通過免疫印記顯示位于50％蔗糖密度梯度頂部的條帶同時含有HA蛋白和M1蛋白(圖1B)，并且所鑒定出的條帶為約68kDa和28kDa，其分別指流感HA蛋白和流感M1蛋白。如所預(yù)期的，從分支1特異性單克隆抗體和分支2特異性單克隆抗體均可以檢測到來源于嵌合H5VLP的HA。

在對以TEM的陰性染色的制劑進(jìn)行觀察中，觀察到了直徑約100nm的嵌合H5VLP的存在(圖1D)，指示出具有典型大小的流感VLP。

嵌合H5VLP疫苗接種后的廣泛抗體應(yīng)答

免疫后3周，對H5N1病毒的四種不同分支進(jìn)行交叉分支HI檢測。如圖2A至2C和4A至4D所顯示的，以嵌合H5VLP免疫的雞顯示出針對H5N1病毒分支1和分支2顯著廣泛的免疫應(yīng)答。鴨血清的HI檢測結(jié)果顯示出更顯著廣泛的免疫應(yīng)答。如圖3A至3C和5A至5D所顯示的，以含有分支1HA或分支2HA的標(biāo)準(zhǔn)VLP疫苗免疫的鴨能夠誘發(fā)針對H5N1病毒的不同分支最低水平的抗體應(yīng)答。然而，以嵌合VLP疫苗對鴨進(jìn)行的免疫能夠誘發(fā)針對H5N1病毒的不同分支的廣泛抗體應(yīng)答。

盡管已經(jīng)公開了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案以用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在不脫離如所附權(quán)利要求書公開的本發(fā)明范圍和精神的情況下，可以做出各種修改、增加和替換。