本發(fā)明涉及一種新的AAV血清型，具體涉及一種可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，基因治療已成為人類遺傳性疾病或獲得性疾病治療最有效的方法之一。與傳統(tǒng)治療方法相比，基因治療更接近人體基因表達(dá)的自然狀態(tài)，而其關(guān)鍵是如何將治療基因安全有效的導(dǎo)入人體內(nèi)，并使治療基因能夠長期表達(dá)。與腺病毒、慢病毒載體相比，腺相關(guān)病毒（AAV）憑借著安全性高，免疫原性低，可介導(dǎo)基因長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢，在許多臨床前和臨床研究中已表現(xiàn)出顯著的潛能，在基因治療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。

腺相關(guān)病毒（AAV）屬于依賴病毒屬的細(xì)小病毒科，最初于1965年作為腺病毒實(shí)驗(yàn)制備物中的一種污染成分被發(fā)現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)有12個(gè)天然存在的AAV血清型和100多種病毒變種。野生型AAV是一類包裹著線性單鏈DNA基因組的無包膜病毒，在其兩端含有145bp的堿基末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR）。ITRs序列折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)對于AAV病毒基因組的包裝以及起始單鏈DNA向雙鏈DNA的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要，且為感染性病毒顆粒所需的唯一已知的順式作用元件。ITR元件位于兩個(gè)開放閱讀框的兩側(cè)，左側(cè)Rep基因編碼四個(gè)非結(jié)構(gòu)Rep蛋白-Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78與Rep68調(diào)控病毒的復(fù)制與整合，Rep52與Rep40則發(fā)揮解ATP酶和螺旋酶的活性作用，他們也與Rep78、Rep68共同調(diào)控病毒單鏈基因組的復(fù)制過程；右側(cè)的cap基因編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白-VP1、VP2和VP3，是裝配完整病毒所需的衣殼蛋白，它們在病毒整合、復(fù)制和裝配中起重要作用。AAV的衣殼為二十面體，由60個(gè)病毒殼粒組成，直徑大約為20-25 nm，是動物病毒中最小的病毒。AAV是一種缺陷型病毒,不能單獨(dú)復(fù)制，需要在輔助病毒如腺病毒、單純皰疹病毒存在的條件下，才能在宿主細(xì)胞中復(fù)制合成和組裝蛋白，產(chǎn)生新的病毒顆粒。野生型的AAV感染人的宿主細(xì)胞后，可定點(diǎn)整合到宿主細(xì)胞的AAVS1位點(diǎn)（19號染色體，19q13.4），這可能與野生型腺相關(guān)病毒ITR結(jié)構(gòu)和Rep蛋白的共同作用相關(guān)。

目前通用的AAV病毒載體為1982年建立的感染性克隆AAV血清型2（AAV2），由于AAV2載體幾乎無致病作用，弱免疫原性，宿主范圍比較廣，可感染分裂期的細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞，能夠介導(dǎo)基因長期穩(wěn)定的表達(dá)等優(yōu)勢已廣泛的應(yīng)用于基因治療中。重組AAV2載體已在許多疾病臨床前研究中進(jìn)行了測試，如血友病、α1抗胰蛋白酶缺乏性肝病、囊性纖維化、杜氏肌營養(yǎng)不良癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。但隨著臨床研究的增多，AAV2載體的不足也逐漸顯現(xiàn)出來，如AAV2對組織的感染效率差異較大，在某些組織中的感染效率很高，而在有些組織中的感染效率又很低。另外，在人體中會對AAV的感染產(chǎn)生中和性抗體，在成人中約50-80%都存在針對各種AAV病毒的中和性抗體，抗AAV2的中和性抗體為主要形式。為了提高AAV病毒載體的感染效率和宿主范圍，人們進(jìn)行了多種嘗試，如誘變篩選突變的衣殼蛋白或者構(gòu)建嵌合的AAV病毒載體等方法。近幾年不同血清型AAV病毒載體的組織特異性研究受到廣泛的關(guān)注，利用各種血清型AAV的天然感染特性，獲得對不同組織具有不同轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的AAV病毒載體，對AAV在基因治療的廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。

迄今為止，從腺病毒或人/靈長類動物組織中已分離出若干種AAV血清型和100多種AAV病毒變種。由于AAV血清型的可選擇性，不僅因其潛在的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可以降低載體負(fù)荷量，也有利于規(guī)避自然感染或基于AAV病毒治療產(chǎn)生的中和性抗體。

除了靈長類，AAV的基因組還可以從其他動物中分離獲得。由于不同血清型AAV衣殼蛋白的氨基酸組成不同（Cap的同源性較低），導(dǎo)致它們與靶細(xì)胞表面的不同受體結(jié)合，因而對宿主的各種組織細(xì)胞的親嗜性存在顯著差異。無包膜病毒通過衣殼蛋白與細(xì)胞表面的糖胺聚糖受體相互作用從而進(jìn)入細(xì)胞。接著病毒衣殼與輔受體的二次相互作用決定了細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸途徑，該階段稱為感染途徑（最終轉(zhuǎn)導(dǎo)效率）。AAV血清型的可選擇性對最終轉(zhuǎn)導(dǎo)效率具有顯著的影響?，F(xiàn)有AAV血清型中，AAV2與細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白多糖受體相互作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，接著AAV2與輔受體人成纖維細(xì)胞生長因子受體1（FGFR1），肝細(xì)胞生長因子受體和整聯(lián)蛋白αvβ5/α5β1相互作用對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)也非常重要。AAV6，僅六個(gè)氨基酸殘基不同于AAV1以及與AAV2約85％同源的衣殼序列，結(jié)合硫酸肝素，并且可以使用肝素親和層析進(jìn)行純化。AAV3與AAV2衣殼具有約87％的同源性，同樣可與硫酸肝素受體結(jié)合，但親合力較低。AAV4和AAV5沒有硫酸肝素結(jié)合為點(diǎn)，通過唾液酸受體與細(xì)胞結(jié)合并傳導(dǎo)，因此其組織特異性與AAV2等有很大區(qū)別。近年來，人們已經(jīng)建立了唾液酸介導(dǎo)的AAV1或AAV6對某些細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)。AAV8-10 通過層黏連蛋白受體(LamR)與細(xì)胞表面結(jié)合，而用于其他AAV血清型和AAV病毒變種結(jié)合的細(xì)胞表面受體仍有待確定。

各種血清型AAV病毒載體對不同組織轉(zhuǎn)導(dǎo)效率存在很大差異。已知AAV2可轉(zhuǎn)導(dǎo)大部分的組織類型，包括肝，肌肉，肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有中等轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 AAV9同樣可轉(zhuǎn)導(dǎo)多種組織類型，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比AAV2高。AAV1和AAV7對骨骼肌具有快速感染以及高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)，由于AAV6衣殼僅有六個(gè)氨基酸殘基不同于AAV1，因此也顯示出傾向于對骨骼肌的轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟和肌肉組織中各種血清型AAV病毒載體感染效率由高到低為AAV1>AAV5>AAV3>AAV2>AAV4；在大鼠視網(wǎng)膜中順序是AAV5>AAV4>AAV1>AAV2>AAV3。今后，仍需要更廣泛的研究來闡明其它血清型的組織趨向性以及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

一些AAV血清型顯示了對神經(jīng)系統(tǒng)的不同轉(zhuǎn)導(dǎo)模式。一般情況下，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)注射，與AAV2相比， AAV1和AAV5表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。然而AAV2在整個(gè)中腦中顯示了廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，AAV4則轉(zhuǎn)導(dǎo)特定的細(xì)胞類型，如室管膜下區(qū)的室管膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在肝組織中，AAV8已被證明是一個(gè)高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的載體，可實(shí)現(xiàn)對肝臟接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，AAV6對肝組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也比AAV2和AAV1高。值得注意的是，AAV8不僅可高效率的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝組織，對其他的器官也有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，高劑量的AAV8轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌，對整個(gè)身體包括膜片，心臟，胰臟，平滑肌和腦均具有高的轉(zhuǎn)導(dǎo)性。另一方面，AAV8對骨骼肌高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，需要VEGF同時(shí)給藥，以便穿過血管屏障實(shí)現(xiàn)全身的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。一般情況下，由于血腦和血管屏障的存在全身注射AAV，很難實(shí)現(xiàn)對大腦和骨骼肌的轉(zhuǎn)導(dǎo)，然而，上述的研究表明，AAV8可穿過血管的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)這些組織。因此， AAV血清型的組織親嗜性非常重要（基因的傳遞中可導(dǎo)致非靶組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)），對于其在人類臨床試驗(yàn)中的成功應(yīng)用，需要嚴(yán)格控制和操縱它們的組織趨向性。另一方面，不同血清型最終的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率即轉(zhuǎn)基因表達(dá)的動力學(xué)變化也是很重要的。如AAV2，6和8對均可有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝組織；肝門靜脈注射AAV2病毒載體后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)以一個(gè)相對較慢的速度增加，通常需要6-8周達(dá)到最大的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，與此相反，AAV6和AAV8轉(zhuǎn)導(dǎo)具有快速的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，一般給藥4周后達(dá)到最大水平。由于每個(gè)組織類型對AAV血清型的細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制不同，AAV血清型衣殼之間的結(jié)構(gòu)性差異引起這種血清型之間的效果差異。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，AAV2，AAV5和AAV6可有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)人單核細(xì)胞來源的DCs細(xì)胞（Dendritic cells），對DC細(xì)胞的形態(tài)和功能特性無不利影響，與其他血清型AAV病毒載體相比，AAV5呈現(xiàn)對人DC細(xì)胞高的傾向性，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低；而AAV6對小鼠來源的DC細(xì)胞具有高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。至今沒有發(fā)現(xiàn)可以高效感染免疫細(xì)胞的AAV血清型，為了獲得更高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的AAV病毒變種，更好的用于臨床基因治療，很有必要研制其它血清型的AAV病毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為了提供一種新血清型的AAV病毒，其能夠高效感染免疫細(xì)胞，為AAV作為基因載體的應(yīng)用提供新的途徑，為基因治療提供更廣泛的選擇。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒，包括衣殼蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白以及結(jié)構(gòu)蛋白，其中，所述結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示。

上述技術(shù)方案中，氨基酸序列為SEQ ID NO:1的結(jié)構(gòu)蛋白可以由序列為SEQ ID NO:2的DNA編碼，也可以由序列為SEQ ID NO:3的DNA編碼。

腺相關(guān)病毒（AAV病毒）是一種復(fù)制缺陷型DNA病毒，由三種包被蛋白（衣殼蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白以及結(jié)構(gòu)蛋白）與一條單鏈DNA構(gòu)成，每條DNA單鏈包括ITR元件以及開放閱讀框；本發(fā)明的AAV病毒可以裝載外源基因，并將其攜帶至免疫細(xì)胞，高效感染后將外源基因注入免疫細(xì)胞中，發(fā)揮作用，因此可以作為外源基因載體的應(yīng)用；從而本發(fā)明還公開了基于上述可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒的重組腺相關(guān)病毒。由上述可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒與外源基因組成，其中外源基因?yàn)榫€性單鏈結(jié)構(gòu)；外源基因的大小為6bp～6000bp。

本發(fā)明還公開了上述重組腺相關(guān)病毒的制備方法，包括以下步驟：

（1）合成SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3的DNA序列；然后將合成的DNA序列克隆至pAAV-RC載體中；

（2）然后取步驟（1）的克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，待單克隆菌落長出后，挑單克隆菌落加入SOC培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，將菌液轉(zhuǎn)移至LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素，進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)；最后提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒；

（3）在培養(yǎng)皿中按照3x10⁶個(gè)/10cm的密度接種HEK293T細(xì)胞；48小時(shí)后，在接種HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，利用PEI轉(zhuǎn)染步驟（2）制備的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、攜帶外源基因的pAAV質(zhì)粒以及pHelper質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染48～72小時(shí)后，收集細(xì)胞，離心去掉上清后，加入細(xì)胞裂解液，經(jīng)過3個(gè)凍融循環(huán)后，離心分離得到腺相關(guān)病毒提取液；所述凍融循環(huán)的溫度為-80度～37度；外源基因?yàn)榫€性單鏈結(jié)構(gòu)；外源基因的大小為6bp～6000bp；

（4）將質(zhì)量濃度分別為15%、25%、40%、54%的碘克沙醇溶液依次加入離心管中；然后加入步驟（3）的腺相關(guān)病毒提取液；然后離心處理，去除上清，得到重組腺相關(guān)病毒。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，利用PacI-AscI雙酶切所述合成的DNA序列，回收酶切產(chǎn)物，得到酶切后的DNA片段；利用PacI-AscI雙酶切pAAV-RC載體，回收酶切產(chǎn)物，得到酶切載體；將酶切后的DNA片段與酶切載體配制T4連接反應(yīng)體系，16℃連接過夜；從而將DNA序列克隆至pAAV-RC載體中。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，然后取克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3大腸桿菌感受態(tài)中，待單克隆菌落長出后，挑3-5個(gè)單克隆菌落加入5mL SOC培養(yǎng)基，37度180RPM培養(yǎng)1小時(shí)后，將所有的液體轉(zhuǎn)移至800mL LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素，37度搖瓶培養(yǎng)16小時(shí)進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)；最后使用質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒。

上述技術(shù)方案中，步驟（3）中，在接種HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，加入步驟（2）制備的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、攜帶外源基因的pAAV質(zhì)粒以及pHelper質(zhì)粒，再按照終濃度為9μg/mL的量添加PEI，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞；加入終濃度為50U/mL全能核酸酶（Benzonase），在37度孵育1小時(shí)，然后3000g離心30分鐘；得到腺相關(guān)病毒提取液；所述細(xì)胞裂解液的pH為8.5，包括50mM Tris-HCl和50mM NaHCO₃。

上述技術(shù)方案中，步驟（4）中，離心管中，15%、25%、40%、54%的碘克沙醇溶液以及腺相關(guān)病毒提取液的體積比為5∶7∶5∶5∶15；離心處理時(shí)的參數(shù)為28000RPM、16度離心5個(gè)小時(shí)。

本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒高效感染免疫細(xì)胞后將外源基因注入免疫細(xì)胞中，發(fā)揮作用；因此本發(fā)明還公開了所述重組腺相關(guān)病毒在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明創(chuàng)造性的制備出具有新結(jié)構(gòu)蛋白的新型AAV病毒，其對免疫細(xì)胞具有高效的感染性；可以作為基因載體，與外源基因組成重組腺相關(guān)病毒，將外源基因攜帶至免疫細(xì)胞，高效感染后將外源基因注入免疫細(xì)胞中，從而發(fā)揮外源基因作用；對外源基因的適應(yīng)性廣，并且該AAV病毒不需復(fù)雜的制備工藝，極低的免疫原性，對人體安全，為基因治療提供更廣泛的選擇。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有AAV病毒以及本發(fā)明AAV病毒包裝GFP基因感染免疫細(xì)胞的效果對比圖；

圖2為現(xiàn)有AAV病毒以及本發(fā)明AAV病毒包裝IL15基因感染免疫細(xì)胞后，目的蛋白分泌表達(dá)的效果對比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖以及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例一

（1）采用化學(xué)合成的方法直接合成SEQ ID NO:2所示的DNA序列，稱為hCap基因，并進(jìn)行PacI-AscI雙酶切，得到酶切后的DNA片段；利用PacI-AscI雙酶切pAAV-RC載體，回收酶切產(chǎn)物，得到酶切載體；將酶切后的DNA片段與酶切載體配制T4連接反應(yīng)體系，16℃連接過夜；從而將DNA序列克隆至pAAV-RC載體中，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，將連接后的產(chǎn)物（克隆產(chǎn)物）轉(zhuǎn)化至30uL Stbl3大腸桿菌感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，立即加入1mL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，然后將其轉(zhuǎn)至15mL的離心管中，并加入5mLSOC培養(yǎng)基，37度180RPM培養(yǎng)1小時(shí)后，將所有的液體轉(zhuǎn)移至800mL LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素，37度搖瓶培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，3000g離心收集細(xì)菌沉淀，使用質(zhì)粒大提的試劑盒分離質(zhì)粒DNA并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒。即可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒，零下80度保存。

實(shí)施例二

（1）采用化學(xué)合成的方法直接合成SEQ ID NO:3所示的DNA序列，稱為bCap基因，并進(jìn)行PacI-AscI雙酶切，將其克隆至pAAV-RC中，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，將連接后的產(chǎn)物通過電擊的方法轉(zhuǎn)化至30uL Stbl3大腸桿菌感受態(tài)中。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后，立即加入1mL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，然后將其轉(zhuǎn)至15mL的離心管中，并加入5mLSOC培養(yǎng)基，37度180RPM培養(yǎng)5小時(shí)后，將所有的液體轉(zhuǎn)移至500mL LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素，37度搖瓶培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，2000g離心收集細(xì)菌沉淀，使用質(zhì)粒大提的試劑盒分離質(zhì)粒DNA并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒。即可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒。

實(shí)施例三

（1）采用化學(xué)合成的方法直接合成hCap基因，并進(jìn)行PacI-AscI雙酶切，將其克隆至pAAV-RC中，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，用于后續(xù)的AAV病毒包裝。將連接后的產(chǎn)物通過電擊的方法轉(zhuǎn)化至30uL Stbl3大腸桿菌感受態(tài)中。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后，立即加入1mL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，然后將其轉(zhuǎn)至15mL的離心管中，并加入5mLSOC培養(yǎng)基，37度180RPM培養(yǎng)5小時(shí)后，將所有的液體轉(zhuǎn)移至500mL LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素，37度搖瓶培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，2000g離心收集細(xì)菌沉淀，使用質(zhì)粒大提的試劑盒分離質(zhì)粒DNA并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒。

（2）準(zhǔn)備20個(gè)15cm培養(yǎng)皿，每皿接種4.5x10^6個(gè)HEK293免疫細(xì)胞。48小時(shí)后，使用PEI轉(zhuǎn)染220ug 腺相關(guān)病毒質(zhì)粒及250ug pAAV-IL15和pHelper質(zhì)粒。48小時(shí)后，使用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部收集至離心管中，去掉上清后，使用細(xì)胞裂解液（50mM Tris-HCl,pH8.5,50mM NaHCO3），經(jīng)過3個(gè)凍融循環(huán)（-80度/37度）后，加入50U/mL Benzonase在37度孵育1小時(shí)，然后2000g離心20分鐘。

（3）制備15%、25%、40%、50%的碘克沙醇梯度。在SW28離心管中，依次加入5mL 54%、7mL 40%、5mL 25%、5mL 15%的碘克沙醇梯度、15mLAAV粗提液。28000RPM、16度離心6個(gè)小時(shí)，收集40%的碘克沙醇梯，離心處理，去除上清，得到外源基因?yàn)镮L15基因的重組腺相關(guān)病毒，表示為bCap- IL15。

將步驟（1）的hCap基因替換為bCap基因，可得到外源基因?yàn)镮L15基因的重組腺相關(guān)病毒，表示為hCap- IL15。

將步驟（2）的pAAV-IL15替換為pAAV-EGFP，可得到外源基因?yàn)镚FP基因的重組腺相關(guān)病毒，表示為hCap-GFP。

將步驟（1）的hCap基因替換為bCap基因，步驟（2）的pAAV-IL15替換為pAAV-EGFP，可得到外源基因?yàn)镚FP基因的重組腺相關(guān)病毒，表示為bCap-GFP。

以GFP基因、IL15基因?yàn)橥庠椿?，以上述可高效感染免疫?xì)胞的AAV病毒為載體，以現(xiàn)有AAV2為對比載體（得到的重組腺相關(guān)病毒為AAV2-GFP、AAV2- IL15），制備重組腺相關(guān)病毒，并進(jìn)行熒光測試以及表達(dá)濃度測試。分別使用上述制備的含有綠色熒光蛋白GFP、IL15的AAV病毒感染免疫細(xì)胞，3天后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。使用酶聯(lián)免疫標(biāo)記試劑盒檢測培養(yǎng)基上清中抗體的表達(dá)濃度。

圖1為使用AAV2包裝GFP及本發(fā)明的AAV病毒包裝GFP感染免疫細(xì)胞的效果對比圖，可以看出使用天然的AAV2血清型腺相關(guān)病毒感染免疫細(xì)胞，感染效率較低，GFP綠色熒光蛋白表達(dá)相對較弱；而以本發(fā)明的AAV病毒包裝GFP感染免疫細(xì)胞，感染效率較高，GFP表達(dá)的綠色熒光蛋白亮度顯著提高。

分別使用本發(fā)明的AAV病毒及天然的AAV2攜帶IL15基因，分別感染免疫細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)基上清后，采用ELISA的方法檢測IL15的分泌表達(dá)量，圖2為培養(yǎng)基上清中IL15的表達(dá)，結(jié)果顯示本發(fā)明改良后的AAV血清能夠有效感染免疫細(xì)胞，并高效表達(dá)IL15。

綜上可以說明本發(fā)明提供的新型AAV病毒對免疫細(xì)胞具有高效的感染性；可以作為基因載體，與外源基因組成重組腺相關(guān)病毒，將外源基因攜帶至免疫細(xì)胞，高效感染后將外源基因注入免疫細(xì)胞中，從而發(fā)揮外源基因的治療作用；對外源基因的適應(yīng)性廣，并且該AAV病毒不需復(fù)雜的制備工藝，對人體安全，為基因治療提供更廣泛的選擇。

SEQUENCE LISTING

<110> 愛康得生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（蘇州）有限公司

<120> 一種可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒及其制備方法與應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 735

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Phe Pro Asp Ser Ser Ser Gly Phe Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Val Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Ser Ser Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

435 440 445

Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln

450 455 460

Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly

465 470 475 480

Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

485 490 495

Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

500 505 510

Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

515 520 525

Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr

545 550 555 560

Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

580 585 590

Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

595 600 605

Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

610 615 620

Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys

625 630 635 640

His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

645 650 655

Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln

660 665 670

Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

690 695 700

Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr

705 710 715 720

Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 2

<211> 2208

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccgccg atggctacct gcctgactgg ctggaagata ccctgagcga gggcatccgg 60

cagtggtgga agctgaagcc tggaccccct ccacctaagc ccgccgagag acacaaggac 120

gacagcagag gactggtgct gcccggctac aagtacctgg gccccttcaa cggcctggac 180

aagggcgagc ctgtgaacga agccgatgcc gccgctctgg aacacgacaa ggcctacgac 240

agacagctgg acagcggcga caacccctac ctgaagtaca accacgccga cgccgagttc 300

caggaacggc tgaaagagga caccagcttc ggcggcaatc tgggcagagc cgtgtttcag 360

gccaagaaac gggtgctgga acccctgggc ctggtggaag aacccgtgaa aaccgcccct 420

ggcaaaaagc ggcccgtgga acacagcccc gtgttccctg atagcagcag cggctttggc 480

aaggccggac agcagcccgc cagaaagaga ctgaacttcg gccagaccgg cgacgccgat 540

agcgtgccag atcctcagcc tctgggagtg cctcctgccg ctccttctgg cctgggcagc 600

tctacaatgg ccacaggctc tggcgcccct atggccgaca acaatgaagg cgctgacggc 660

gtgggcaaca gctccggcaa ttggcactgc gacagcacct ggatgggcga cagagtgatc 720

accaccagca ccagaacatg ggccctgccc acctacaaca accacctgta caagcagatc 780

agcagccagt ccggcgccag caacgacaac cactacttcg gctacagcac cccctggggc 840

tacttcgact tcaaccggtt ccactgccac ttcagcccca gagactggca gcggctgatc 900

aacaacaact ggggcttccg gcccaagcgg ctgaacttca agctgttcaa tattcaagtg 960

aaagaagtga cccagaacga cggcaccacc acaatcgcca acaacctgac cagcaccgtg 1020

caggtgttca ccgacagcga gtaccagctg ccctacgtgc tgggatctgc ccaccaggga 1080

tgcctgcctc cctttcccgc cgacgtgttc atggtgcccc agtacggcta cctgaccctg 1140

aacaatggca gccaggccgt gggcagaagc agcttctact gcctggaata cttccccagc 1200

cagatgctgc ggaccggcaa caacttcacc ttcagctaca ccttcgagga cgtgcccttc 1260

cacagcagct acgcccactc tcagagcctg gacagactga tgaaccccct gatcgaccag 1320

tacctgtact acctgagccg gaccaacacc cccagcggca ccacaacaca gagccggctg 1380

cagttttctc aggctggcgc ctccgacatc cgggaccaga gcagaaattg gctgcctggc 1440

ccctgctacc ggcagcagag agtgtctaag accagcgccg ataacaacaa tagcgagtac 1500

tcctggaccg gcgccaccaa gtaccacctg aacggcagag actccctcgt gaaccctgga 1560

cctgccatgg ccagccacaa ggatgacgag gaaaagttct tcccacagtc cggggtgctg 1620

atcttcggca agcagggcag cgaaaagacc aacgtggaca tcgagaaagt gatgatcacc 1680

gacgaggaag agatccggac caccaaccca gtggccaccg agcagtatgg cagcgtgtcc 1740

accaacctgc agcggggcaa tagacaggcc gccaccgccg atgtgaatac tcagggcgtg 1800

ctgccaggca tggtgtggca ggatagggac gtgtacctgc agggccccat ctgggccaag 1860

atccctcaca ccgatggcca cttccacccc agccctctga tgggcggatt cggcctgaag 1920

caccccccac cccagatcct gatcaagaac acccccgtgc ccgccaaccc cagcacaaca 1980

ttttccgccg ccaagttcgc cagcttcatc acccagtaca gcacaggcca ggtgtccgtg 2040

gaaatcgagt gggagctgca gaaagaaaac agcaagcggt ggaaccccga gatccagtac 2100

acctccaact acaacaagag cgtgaacgtg gacttcaccg tggacaccaa cggcgtgtac 2160

agcgagccca gacccatcgg caccagatac ctgacacgga acctgtaa 2208

<210> 3

<211> 2208

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccgctg atggctacct gcctgactgg ctggaagata ccctgtccga gggcatccgg 60

cagtggtgga agctgaagcc tggaccccct ccacctaagc ccgccgagag acacaaggac 120

gactccagag gactggtgct gcccggctac aagtacctgg gccctttcaa cggcctggac 180

aagggcgagc ctgtgaacga ggctgatgcc gccgctctgg aacacgacaa ggcctacgac 240

cggcagctgg actctggcga caacccctac ctgaagtaca accacgccga cgccgagttc 300

caggaacggc tgaaagagga cacctccttc ggcggcaatc tgggcagagc cgtgtttcag 360

gccaagaaac gggtgctgga acccctgggc ctggtggaag aacccgtgaa aaccgcccct 420

ggcaaaaagc ggcccgtgga acactccccc gtgttccctg attcctccag cggctttggc 480

aaggccggac agcagcccgc cagaaagaga ctgaacttcg gccagaccgg cgacgccgac 540

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tctaccatgg ctaccggatc tggcgcccct atggccgaca acaatgaagg cgcagacggc 660

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accacctcca cccggacatg ggccctgccc acctacaaca accacctgta caagcagatc 780

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tacttcgact tcaaccggtt ccactgccac ttcagccctc gggactggca gcggctgatc 900

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aaagaagtga cccagaacga cggcaccacc acaatcgcca acaacctgac ctccaccgtg 1020

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tacctgtact acctgtcccg gaccaacacc ccctccggca ccacaacaca gtcccggctg 1380

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atcttcggca agcagggctc cgaaaagacc aacgtggaca tcgagaaagt gatgatcacc 1680

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accaacctgc agcggggcaa tagacaggcc gccaccgccg atgtgaatac ccagggcgtg 1800

ctgccaggca tggtgtggca ggatagggac gtgtacctgc agggccccat ctgggccaag 1860

atccctcaca ccgatggcca cttccacccc agccctctga tgggcggatt cggcctgaag 1920

caccccccac cccagatcct gatcaagaac acccccgtgc ccgccaaccc cagcaccacc 1980

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tccgagccca gacccatcgg caccagatac ctgaccagaa acctgtaa 2208