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一種可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒及其制備方法與應(yīng)用與流程

文檔序號:12056339閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒,包括衣殼蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白以及結(jié)構(gòu)蛋白,其特征在于:所述結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒,其特征在于:編碼所述結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列的DNA序列為SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3所示。

3.權(quán)利要求1所述可高效感染免疫細(xì)胞的AAV病毒作為外源基因載體的應(yīng)用;所述外源基因?yàn)榫€性單鏈結(jié)構(gòu);所述外源基因的大小為6bp~6000bp。

4.一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)合成SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3的DNA序列;然后將合成的DNA序列克隆至pAAV-RC載體中;

(2)然后取步驟(1)的克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中,待單克隆菌落長出后,挑單克隆菌落加入SOC培養(yǎng)基,培養(yǎng)后,將菌液轉(zhuǎn)移至LB培養(yǎng)基中,加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素,進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng);最后提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒;

(3)在培養(yǎng)皿中按照3x106個/10cm的密度接種HEK293T細(xì)胞;48小時(shí)后,在接種HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,利用PEI轉(zhuǎn)染步驟(2)制備的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、攜帶外源基因的pAAV質(zhì)粒以及pHelper質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染48~72小時(shí)后,收集細(xì)胞,離心去掉上清后,加入細(xì)胞裂解液,經(jīng)過3個凍融循環(huán)后,離心分離得到腺相關(guān)病毒提取液;所述凍融循環(huán)的溫度為-80度~37度;所述外源基因?yàn)榫€性單鏈結(jié)構(gòu);所述外源基因的大小為6bp~6000bp;

(4)將質(zhì)量濃度分別為15%、25%、40%、54%的碘克沙醇溶液依次加入離心管中;然后加入步驟(3)的腺相關(guān)病毒提取液;離心處理,去除上清,得到重組腺相關(guān)病毒。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組腺相關(guān)病毒的制備方法,其特征在于:步驟(1)中,利用PacI-AscI雙酶切所述合成的DNA序列,回收酶切產(chǎn)物,得到酶切后的DNA片段;利用PacI-AscI雙酶切pAAV-RC載體,回收酶切產(chǎn)物,得到酶切載體;將酶切后的DNA片段與酶切載體配制T4連接反應(yīng)體系,16℃連接過夜;從而將DNA序列克隆至pAAV-RC載體中。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組腺相關(guān)病毒的制備方法,其特征在于:步驟(2)中,取克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3大腸桿菌感受態(tài)中,待單克隆菌落長出后,挑3-5個單克隆菌落加入5mL SOC培養(yǎng)基,37度180RPM培養(yǎng)1小時(shí)后,將所有的液體轉(zhuǎn)移至800mL LB培養(yǎng)基中,加入終濃度為50ug/mL的氨芐青霉素,37度搖瓶培養(yǎng)16小時(shí)進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng);最后使用質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證正確后獲得腺相關(guān)病毒質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組腺相關(guān)病毒的制備方法,其特征在于:步驟(3)中,在接種HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,加入步驟(2)制備的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、攜帶外源基因的pAAV質(zhì)粒以及pHelper質(zhì)粒,再按照終濃度為9μg/mL的量添加PEI,進(jìn)行轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,收集細(xì)胞;加入細(xì)胞裂解液,經(jīng)過3個凍融循環(huán)后,加入終濃度為50U/mL 全能核酸酶,在37度孵育1小時(shí),然后3000g離心30分鐘;得到腺相關(guān)病毒提取液;所述細(xì)胞裂解液的pH為8.5,為包括50mM 三(羥甲基)氨基甲烷和50mM 碳酸氫鈉的鹽酸緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組腺相關(guān)病毒的制備方法,其特征在于:步驟(4)中,離心管中,15%、25%、40%、54%的碘克沙醇溶液以及腺相關(guān)病毒提取液的體積比為5∶7∶5∶5∶15;離心處理時(shí)的參數(shù)為28000RPM、16度離心5個小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求4~8所述任意一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法制備的重組腺相關(guān)病毒。

10.權(quán)利要求9所述重組腺相關(guān)病毒在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

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