專利名稱：：紅參提取物制備方法及其護膚產(chǎn)品開發(fā)的制作方法紅參提取物制備方法及其護膚產(chǎn)品開發(fā)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及紅參提取物的制備及精氨酸糖苷(AFG)的分離、鑒定，以紅參為主要有效成分的化妝品的制造，開發(fā)了紅參提取物的新用途。發(fā)明背景目前研究表明，紅參主要含有人參皂苷、多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和揮發(fā)油等化學(xué)成分。紅參中含有的精氨酸糖苷(AFG)是生曬參的數(shù)倍，在人參地上部分未見含有AFG的報道，另外，精氨酸糖苷(AFG)也未見有用于美容護膚化妝品的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種紅參提取物的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還公開了以紅參提取物中精氨酸糖苷(AFG)為基本活性成分的化妝品。本發(fā)明進一步提供了以紅參提取物為主要成分配合其他成分，制備護膚化妝品的藥物組合物。紅參提取物及精氨酸糖苷(AFG)的制備和鑒定，技術(shù)解決方案如下將干燥的紅參主根粉碎成粗粉加入5~10倍量的0~70%的乙醇水溶液，浸泡6~12h,超聲提取3次，每次30分鐘，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮成浸膏。將上述提取物加入一定量的水，取紅參浸膏加入一定量的水，透析，得透析外液，濃縮，冷凍干燥，制成含H20提取物80mg"mr1，上NKA大孔樹脂柱，收集水洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥。取干燥提取物3g，水溶解，過葡聚糖凝膠LH-20，蒸餾水洗脫，流速(13ml/h)，每3ml收集l管。茚三酮反應(yīng)陽性者，用氨基酸自動分析儀檢査，與標(biāo)準(zhǔn)精氨酸糖苷(AFG)進行比較，合并保留時間一致的組分，再用硅膠柱層析純化，即得精氨酸糖苷(AFG)。紅參中精氨酸糖苷(AFG)的鑒定水合茚三酮檢驗顯紫色，MS(m/e):498.4,元素分析分子式為UH34NA2;Rf=0.20(HPTLC，展開劑n-butanol-aceticacid_water=2:1:1)。IR(KBr)cm—1:3425(OH),2928，2858(CH),1678(C=0),1633(C=N)。DEPT顯示有3個甲基，6個亞甲基，9個次甲基，'HNMR(Sppm):1.64(m,2H)，L90(m,2H)，3.16(t,J=6.72Hz,2H)，5.00(d，J=3.66Hz)，5.05(d,J=3.66Hz)，5.09(J=3.66Hz)。"CNMR數(shù)據(jù)見下表表AFG的"CNMR數(shù)據(jù)歸屬<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>堿水解該化合物30mg加入3mol.L_1NH40H(30ml)，于IOO'C條件下加熱1h。反應(yīng)液用Bio-gelP-2柱分離并純化，得水合茚三酮陽性反應(yīng)物5rag和糖9mg。水合茚三酮陽性反應(yīng)物以TLC和氨基酸分析儀進行分析，Rf值和保留時間與精氨酸相似。"C畫R(Sppm):184.84(-COOH),160.11(H2N-C=NH)，58.67(-CH-COOH),44.22(-CH廠NH)，34.16(CH2-CH2),27.69(CH廠CH2-CH2)。'HNMR(Sppm):1.50(m,—CH2_),1.53(m,-CH廠)，3.lO(t，J=4.88Hz，-NH2-CH-COOH)，以上數(shù)據(jù)與精氨酸數(shù)據(jù)一致。糖部分3mg與0.8mlTMS試劑攪拌30sec，反應(yīng)液靜止5分鐘后3000rpm離心。上清液用氣-質(zhì)聯(lián)機分析。保留時間與三甲基硅烷化的果糖一致，所以確定化合物的糖部分為果糖。鑒定該化合物為精氨酸果糖葡萄糖苷(AFG)，簡稱精氨酸糖苷。本發(fā)明中的藥物組合物，其中含有精氨酸糖苷(AFG)0.5~3%、人參皂苷0.1~1%，還有人參多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素以及梅拉德反應(yīng)產(chǎn)物等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，這些物質(zhì)的存在會增強本發(fā)明的藥物組合物的護膚保健作用。另外，應(yīng)特別指出的是，可根據(jù)需要在發(fā)明的藥物組合中加入一種或多種天然或合成的其它與本提取物具有協(xié)同或輔助作用的成分，這些可能被加入的天然或合成的輔助成分是本領(lǐng)域或技術(shù)人員已知的和可以想到的?？蓪⑺f的組合物配制成基礎(chǔ)化妝品、美容化妝品、身用化妝品、頭發(fā)用化妝品。可以將本提取物與一種或多種化妝品上可以接受的載體或賦形劑按適當(dāng)比例混合成適用于'化妝品上使用的不同劑型的藥物組合物，例如可將組合物制成化妝水、乳液、膏霜、面膜、護發(fā)素和浴用劑。實驗例1紅參提取物抗細胞衰老作用D.Hannan等人提出自由基導(dǎo)致細胞衰老學(xué)說，認為機體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過量時會引起細胞膜上的不飽和脂肪酸氧化，從而造成細胞及其重要組分如DNA、蛋白質(zhì)和酶變性，加速細胞衰老。近代生物醫(yī)學(xué)又發(fā)現(xiàn)自由基在體內(nèi)代謝失調(diào)對機體的損傷是導(dǎo)致休克、中毒、炎癥、某些心血管疾病、腫瘤及其它自身免疫性疾病的主要原因之一。尋找和篩選自由基清除劑，用來延緩衰老、預(yù)防和治療這些疾病已經(jīng)成為目前研究的熱點。本研究對紅參水提液及其不同組分在體外清除次黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離于的作用進行了研究。采用化學(xué)發(fā)光法，通過體外直接清除氧自由基可以部分揭示紅參的藥理活性；為進一步開發(fā)安全有效的清除自由基藥物提供一定的理論基礎(chǔ)。材料與方法材料紅參、人參莖葉總皂苷粉本室自制加工；葡聚糖凝膠LH—20(SephadexLH—20):上?；瘜W(xué)試劑廠進口分裝。高效薄層板DC—PlastikfollenKiseigel60，德國Merck公司生產(chǎn)。試劑次黃嘌呤(HX)購自FLUKA公司，黃嘌呤氧化酶(XO)購自Sigma公司；魯米諾(Luminol)購自Merck公司。其它試劑均為分析純。紅參水提液及其不同組分的分離將紅參切片，分別加八倍量、四倍量、四倍量的水煎煮三次，每次一小時，合并煎煮液，過濾后濃縮，得到紅參總水提液；加入四倍量的乙醇，放人4。C冰箱中靜置，過濾，得到乙醇沉淀相，濾液減壓回收乙醇至無醇味后分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到紅參乙醚相、紅參乙酸乙酯相、紅參正丁醇相和紅參水相。將紅參總液配成濃度10mg/ml，紅參乙醇沉淀相、紅參正丁醇相、紅參水相、人參莖葉總皂苷粉分別配成濃度lmg/ml的溶液作為待測樣。超氧陰離子自由基的產(chǎn)生及測定利用次黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生超氧陰離子黃嘌呤氧化酶在有氧條件下催化底物次黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)生成尿酸，與此同時產(chǎn)生超氧陰離子，它進一步與化學(xué)發(fā)光劑魯米諾(三一氨基鄰苯二甲酸肼)反應(yīng)，使之激發(fā)，當(dāng)返回基態(tài)時，向外發(fā)光，通過發(fā)光測量，以抑制發(fā)光的程度表示對超氧陰離子的清除率?；瘜W(xué)發(fā)光法測定自由基清除率清除率(％)=(I對照一I樣品)X100%I對照對照發(fā)光強度(cpm)I樣品加樣品后發(fā)光強度(cpm)結(jié)果與分析試驗結(jié)果表明紅參總水提液在濃度800ug/ml，紅參水相、紅參乙醇沉淀相、紅參正丁醇相在80ug/ml時均可顯著清除超氧陰離子，其清除率的順序為紅參正丁醇相>紅參水相〉紅參乙醇沉淀相。人參莖葉總皂苷粉沒有作用，如表l-l和圖l-l所示。巳有報道，人參中醚溶部分如麥芽酚等具有抗氧化作用，紅參總水提液經(jīng)乙醇沉淀，乙醚、乙酸乙酯萃取后，紅參正丁醇相、紅參水相，乙醇沉淀相亦可顯著清除超氧陰離子，說明紅參水提液對超氧陰離子的清除作用是多方面多組分協(xié)同作用的結(jié)果。如表1-1表1-1紅參水提液不同組分對超氧陰離子的清除作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>n=3，X士S，**P<0.01相對于對照，以上濃度均為反應(yīng)終濃度。實驗例2紅參提取物抗過敏作用組胺可引起搔癢和其它皮膚異常反應(yīng)，為防止組胺產(chǎn)生，可使用各種抗組胺劑。植物番石榴(i^VW"w^^/'ovaL)具有很強的抗組胺作用，本品的抗組胺作用超過番石榴。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)紅參水提液對Compound48/80刺激產(chǎn)生的組胺游離具有抑制作用，對多種人參皂苷抗組氨的研究中發(fā)現(xiàn)紅參水提液和20S—人參皂苷Rg3對神經(jīng)肽SP和Compounci48/80刺激產(chǎn)生的組胺游離具有較強的抑制作用，20S—人參皂苷Rg3是在人參加工過程中產(chǎn)生的，其含量非常低，僅占萬分之幾，而且在50100嗎/ml時對組胺游離才有較強的抑制作用，其他皂苷無作用或作用很弱。我們發(fā)現(xiàn)生曬參水提物對組胺游離亦有較強的抑制作用。還發(fā)現(xiàn)以人參組方的化妝品對組胺游離具有很強的抑制作用。材料與方法材料實驗動物250g雄性Wister-King大鼠。實驗材料紅參護膚霜、紅參提取物。脂肪細胞的采集將大鼠用乙醚麻醉后，切斷頸動脈致死，將其腹部自兩側(cè)向中間擠壓90秒后剖開腹部，用移液管將腹腔液移(3只鼠)至30ml塑料離心管中，280Xg離心l分鐘，使腹水細胞沉淀(含有6~8%的脂肪細胞)，棄去上清夜。在沉淀中加入2mlBufferA緩沖液，搖勻，得混懸液。向上述混懸液6ml中加入38。/。的白蛋白溶液4ml，置于塑料離心管中，靜置25分鐘后離心20分鐘(350Xg)，棄去上清夜，得到脂肪細胞。再將得到的脂肪細胞加入3mlBufferA緩沖液，離心20分鐘(250Xg)，兩次，得到干凈的脂肪細胞。脂肪細胞中加入lmlBufferA緩沖液，備用。樣品抗組胺活性的測定1)將測定材料溶于BufferB緩沖液中。2)取100ul，其中加入100ul脂肪細胞溶液，于37。C孵化5分鐘。3)另取兩支加入lOOul脂肪細胞溶液的試管，分別加入10u1的BufferC緩沖液和BufferD緩沖液。4)向3)的2個試管中，分別取2)的溶液40ixl加入，于37'C孵化IO分鐘后，置于冰水中以停止反應(yīng)。5)于4。C離心4分鐘(1500Xg),分別取上清液30ul，加入0.1M鹽酸溶液30U1進行攪拌，分取20iU注入高效液相色譜進行分析。結(jié)果與分析表2-l樣品抗組胺游離活試驗結(jié)果表明紅參提取物10倍稀釋液抗組胺游離作用，其抑制率為16.8%，4倍提取液抑制率為92.6%，2倍提取液抑制率為84.4%，結(jié)果表明，紅參提取物有很強的抗組胺游離作用，并且不完全和濃度成正比，在一定濃度下作用最強。如表2-l和圖2-l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>皮膚的粗糙瘙癢與組胺的過量產(chǎn)生有關(guān)，如能抑制組胺的游離就可使皮膚軟化，增加彈性，也可使色素沉著明顯減輕，發(fā)揮良好的止癢功效。從以上結(jié)果可知，本課題組研制的紅參美容霜對由Compound48/80刺激引起的組胺游離的抑制率為68.5%，采用紅參提取物4倍稀釋液制成的美容液對組胺游離的抑制率達92.6%。本化妝品具有抗組胺游離作用可能是紅參提取物中所含不同成分協(xié)同作用的結(jié)果。實驗例3紅參提取物增白作用皮膚白嫩幾乎是所有女性的愿望，但是由于日照黑色素沉著或者由于植物神經(jīng)失調(diào)引起的黑色素沉著，都會影響皮膚的美觀。隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)今世界化妝品發(fā)展的趨勢正逐步走向生物化與功能化，天然產(chǎn)物化妝品，特別是加有中草藥有效活性成分的化妝品的開發(fā)越來越受到國內(nèi)外廠商的高度重視。我國中醫(yī)素有許多傳統(tǒng)的醫(yī)治方法。孫思邈《干金要方》第九巻載有若干方劑，其中以白芷、川芎、薬本、防風(fēng)、當(dāng)歸、獨活、羌活最為常用。沙參、羌活對使黑色素沉著的酶——酪氨酸酶有較強的抑制作用。90年代掀起的回歸自然的潮流使人們不再喜歡用厚厚的粉底來遮蓋面部色素的沉著，因此迫切需要能徹底抑制體內(nèi)黑色素生成的活性物質(zhì)，從而達到真正意義上的肌膚光潔。若要人為的阻止色素的沉著，應(yīng)改善皮膚中的色素細胞的酪氨酸酶的代謝，限制酪氨酸向黑色素的轉(zhuǎn)化，抑制酪氨酸酶的活性。雀斑、黃褐斑、老人斑等的形成，實際上是體內(nèi)酪氨酸代謝的失調(diào)、色素的異常沉積造成，色素的生成過程如下面的反應(yīng)方程式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>酪氨酸酶分別作用于酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴和多巴醌兩個過程。如要人為地阻止老人斑、雀斑的形成，歸根到底就是要限制酪氨酸酶的活性，美白食品、美白化妝品中添加物之一就有酪氨酸酶的抑制劑。材料與方法試樣及試劑L一酪氨酸(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系合成藥物研究所)0.05%的溶液；酪氨酸酶(Sigma公司)25000U/mg，0.7mg/ml溶液；以上溶液均用0.025M的pH6.86的磷酸緩沖液配制。測試樣品的制備分別取紅參護膚液(本研究中試產(chǎn)品)、紅參營養(yǎng)霜(本研究中試產(chǎn)品)、人參水提物加0.025M的pH6.86的磷酸緩沖液，稀釋成不同濃度，在16000g下，離心15分鐘，得上清液，備用。酪氨酸酶抑制作用的測定測定前，用吸管按下表所示的體積準(zhǔn)確吸取Cl、C2、Tl及T2四組反應(yīng)液，每組設(shè)平行三組試管，先置37t:水浴中保溫IO分鐘。表3-l酪氨酸酶抑制作用測定反應(yīng)液組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>測定時分別將C1、C2、Tl、T2四組反應(yīng)液混勻，加入0.05ml的酪氨酸酶溶液，混勻，開始計時，3分鐘時轉(zhuǎn)移至3ml的比色皿中，在475nm處測吸光度(以下簡稱O.D)。計算時分別將Cl、C2、Tl、T2四組反應(yīng)液的三個平行O.D值相加取平均值，然后按下列公式求酪氨酸酶活性的抑制率抑制率-[l-(Tl—T2)/(Cl—C2)]XIOO其中(Cl-C2)是在沒有抑制條件下的反應(yīng)液的O.D值的改變，C2是本底；(Tl-T2)是在有抑制條件卜的反應(yīng)液的O.D值的改變，T2是本底。結(jié)果與分析不同樣品對酪氨酸酶的抑制率見表3-2，由表可知紅參護膚液與紅參營養(yǎng)霜對酪氨酸酶均有抑制活性，且紅參護膚液活性高于紅參營養(yǎng)霜。說明本研究中試產(chǎn)品具有一定增白作用。表3-2樣品對酪氨酸酶的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖1紅參水提液不同組分對超氧陰離子的清除作用圖1縱坐標(biāo)代表清除率(％)，CK為對照，溶液為水，其值為O，無清除作用。柱A為紅參總水提液，其值為63.66，柱B為紅參正丁醇相，其值為40.85，柱C為紅參水相，其值為33.83，柱D為紅參乙醇沉淀相，其值為29.07，柱E為人參莖葉總皂苷粉，其值為O，無清除作用。圖2紅參水提液的抗組胺游離作用圖2縱坐標(biāo)代表抑制率(％)，橫坐標(biāo)CK為對照，溶液為水，其值為0，表示無抑制作用。柱A為10倍稀釋液，其值為16.8，柱B為4倍稀釋液，其值為92.6，抑制作用最強，柱C為2倍稀釋液，其值為84.4，顯現(xiàn)了紅參較好的抗組胺游離作用。具體實施方式以紅參為主要有效成分的化妝品的制作實施例1營養(yǎng)霜<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3洗面乳液(含有粘液質(zhì)的o/w型，非離子表面活性劑)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例4護發(fā)素<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例5結(jié)合型身用清潔劑<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、本發(fā)明公開一個紅參提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟將干燥的紅參主根粉碎成粗粉加入5～10倍量的0～70％的乙醇水溶液，浸泡6～12h，超聲提取3次，每次30分鐘，合并提取液，過濾，得濾液，減壓濃縮成浸膏。2、權(quán)利要求1所述制備方法得到的紅參根提取物在制備美容、護膚化妝品中的應(yīng)用。3、一種從紅參提取物中提取精氨酸糖苷(AFG)的方法，其特征在于取紅參浸膏加入一定量的水，透析，得透析外液，濃縮，冷凍干燥，制成含H20提取物80mg'mr1,上NKA大孔樹脂，收集水洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥。取干燥提取物3g，水溶解，過葡聚糖凝膠LH-20，蒸餾水洗脫，流速(13ml/h)，每3ml收集1管。茚三酮反應(yīng)陽性者，用氨基酸自動分析儀檢查，與標(biāo)準(zhǔn)精氨酸糖苷(AFG)進行比較，合并保留時間一致的組分，再用硅膠柱層析純化，即得精氨酸糖苷(AFG)。全文摘要本發(fā)明提供一個紅參提取物的制備方法，其技術(shù)特征如下將干燥的紅參主根粉碎成粗粉、浸泡、超聲提取、過濾、減壓濃縮成浸膏，此工藝適用于工業(yè)生產(chǎn)。以紅參提取物為主要有效成分，制備護膚化妝品的藥物組合物，其特征在于紅參提取物中含有精氨酸糖苷(AFG)，精氨酸糖苷(AFG)為化妝品的基本活性成分。給出了幾種護膚化妝品如半透明微乳液化妝水、營養(yǎng)霜、洗面乳液、護發(fā)素等的具體的實施例。同時闡述了紅參水提液不同組分對超氧陰離子的清除作用，紅參水提液的抗組胺游離作用。文檔編號C07H5/06GK101239030SQ20081005036公開日2008年8月13日申請日期2008年2月3日優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日發(fā)明者鄭毅男申請人:鄭毅男