本發(fā)明克隆表達(dá)了一種L-α-羥酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

L-α-羥酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一種以FMN(FAD)為輔酶的脫氫酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties of crystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a long chain alpha-hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95to glycine.J Biol Chem.1996 8；271(45):28300-28305)。可用于生物傳感器中測(cè)定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學(xué)純?chǔ)?羥酸的制備(中國(guó)專利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，綠色氣球菌(Aerococcus viridians)，鏈球菌屬(Streptococcus sp.)，片球菌屬(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis),運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和過氧化醋桿菌(Acetobacter peroxidans)等細(xì)菌中克隆表達(dá)得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中檢測(cè)到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)

本發(fā)明首次從擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)中克隆表達(dá)出一種新型的L-α-羥酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(S)-α-羥酸，而且可以氧化(S)-α-羥酸酯，可應(yīng)用于光學(xué)純(R)-α-羥酸酯和(R)-α-羥酸的制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性，并進(jìn)行了應(yīng)用研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明L-α-羥酸氧化酶基因的來(lái)源菌株為：Brevibacterium linens ATCC 8377，購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種庫(kù)。

2、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

提取Brevibacterium linens ATCC 8377菌體基因組總DNA。設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出α-羥酸氧化酶基因全長(zhǎng)編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、L-α-羥酸氧化酶表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、L-α-羥酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

以L-乳酸為底物研究pH對(duì)本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

以L-乳酸為底物研究溫度對(duì)本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

L-α-羥酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、L-對(duì)羥基苯乳酸、L-丹參素、L-扁桃酸。

酶活測(cè)定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進(jìn)行。

5、L-α-羥酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(S)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對(duì)應(yīng)的α-酮酸酯，(R)-α-羥酸酯不被氧化。

產(chǎn)物(R)-α-羥酸酯的光學(xué)純度通過對(duì)映體過量值(％e.e)來(lái)評(píng)價(jià)：

對(duì)映體過量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_R為反應(yīng)后(R)-對(duì)映體的峰面積，S_S為反應(yīng)后(S)-對(duì)映體的液相色譜峰面積，S₀為反應(yīng)前(R)-和(S)-對(duì)映體的液相色譜峰面積之和。

產(chǎn)物測(cè)定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動(dòng)相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對(duì)羥基苯乳酸冰片酯、對(duì)羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細(xì)辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細(xì)辛醇酯、對(duì)羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國(guó)專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)表明的有益之處：從Brevibacterium linens ATCC 8377中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶，該酶可以氧化(S)-α-羥酸和(S)-α-羥酸酯，可用于規(guī)?；苽涫中约?R)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Brevibacterium linens ATCC 8377DNA的提取

將Brevibacterium linens ATCC 8377菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個(gè)離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAAACGTCGACTGCCTGATCTC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGAGAGTCGGCCGGCAGCTCC 3'

(2)PCR擴(kuò)增

用以上合成的兩條引物，以Brevibacterium linens ATCC 8377的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本步驟中擴(kuò)增體系為：

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應(yīng)30個(gè)循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序后得到該的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無(wú)菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無(wú)菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養(yǎng)24h長(zhǎng)勢(shì)良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進(jìn)行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進(jìn)行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來(lái)得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的最適溫度。以L-乳酸為底物，將底物與pH為6.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測(cè)定L-α-羥酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。

實(shí)施例4

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的最適pH值。以L-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，40℃水浴15min測(cè)定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 6.0條件下L-α-羥酸氧化酶酶活最高。

實(shí)施例5

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶與不同底物的反應(yīng)特性列于表2中。

表2 L-α-羥酸氧化酶對(duì)不同底物的活性

實(shí)施例6

根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當(dāng)在反應(yīng)時(shí)間充分時(shí)，可以得到各類高光學(xué)純的(R)-α-羥酸酯，該酶的光學(xué)專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種氧化酶及其應(yīng)用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1254

<212> DNA

<213> Brevibacterium linens ATCC 8377

<400> 1

atgaaacgtc gactgcctga tctcaaagag cttgccccct tgctgcagtt cgacctgcct 60

cgcctcgacc gggtcgccgc caggctggaa gcggccgcag acatctggga cctccgccgc 120

atcgccaagc gcgtgactcc tacagccccg ttcgactatg tcgacggtgc cgcactggac 180

gagcggacat tggcgaagaa ccgggacgct ctgggcaacg tcgagcttct tcctcgcatc 240

ctccacggag tcgacgcccc ggatacgtcg acgacgatcg ccggcgcccg tgttcgactg 300

cccttcggca tcgctccgac cggttacaca cgcatgatgc actccgaagg cgaagtcgcc 360

ggagtgcgtg cggccgcgaa ggccggaatc ccgttctcgc tgtcgacgat gggaacgacc 420

tcggtcgaag acgtcgcgca ggcggcaccg gattccaccc ggtggttcca gctctacctg 480

tggaaggacc gacagcgcag cctcgacctg atccagcgag ccgccgccag cggatacaag 540

actctgctgg tcaccgtcga caccccgatc actggccagc gtctgcgcga tcaccgcaac 600

ggtctgacga tcccgccccg gctgacgctg ggaacgattc tcgacgcctc ctaccggccc 660

ggctggtggt tcaacttcct caccaccgaa ccgccgaagt acgcgtcact gtcgaacacc 720

tctcagtccc tggcggagat gacgcagacg atgttcgacc cgacccttga cctcgaggac 780

ctgcggtgga tccgcgaaca gtggaacgga cgactgttcg tcaagggcat tctcaccgcc 840

gacgatgccc gacgtgccca atccgtcgga gccgatgggc tcgtcgtgtc caaccacggc 900

ggtcgccaac tcgatcgggc cccggactcg ctgacctcac tggccgaagt ccgcgcggag 960

gtcgggccgg agatggagct gatcttcgac tccgggatca tgtccggcac cgatgtcgtc 1020

gccgcgctgt gtgccggagc ggacttcgtg ctcatcggtc gggcgtatct atacgggctc 1080

atggccggcg gtcagcgagg cgtcgagagg gccatcgcac tcatccaaca ggagatcctc 1140

accgcgatgg ggctcatggg tgcccgcagc atctctgatc tcggccccga actcgttcgt 1200

ggcctgcccc aggcaccgaa cacagatcag gagctgccgg ccgactccat gtga 1254

<210> 2

<211> 417

<212> PRT

<213> Brevibacterium linens ATCC 8377

<400> 2

Met Lys Arg Arg Leu Pro Asp Leu Lys Glu Leu Ala Pro Leu Leu Gln

1 5 10 15

Phe Asp Leu Pro Arg Leu Asp Arg Val Ala Ala Arg Leu Glu Ala Ala

20 25 30

Ala Asp Ile Trp Asp Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Val Thr Pro Thr

35 40 45

Ala Pro Phe Asp Tyr Val Asp Gly Ala Ala Leu Asp Glu Arg Thr Leu

50 55 60

Ala Lys Asn Arg Asp Ala Leu Gly Asn Val Glu Leu Leu Pro Arg Ile

65 70 75 80

Leu His Gly Val Asp Ala Pro Asp Thr Ser Thr Thr Ile Ala Gly Ala

85 90 95

Arg Val Arg Leu Pro Phe Gly Ile Ala Pro Thr Gly Tyr Thr Arg Met

100 105 110

Met His Ser Glu Gly Glu Val Ala Gly Val Arg Ala Ala Ala Lys Ala

115 120 125

Gly Ile Pro Phe Ser Leu Ser Thr Met Gly Thr Thr Ser Val Glu Asp

130 135 140

Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser Thr Arg Trp Phe Gln Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Trp Lys Asp Arg Gln Arg Ser Leu Asp Leu Ile Gln Arg Ala Ala Ala

165 170 175

Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Val Thr Val Asp Thr Pro Ile Thr Gly

180 185 190

Gln Arg Leu Arg Asp His Arg Asn Gly Leu Thr Ile Pro Pro Arg Leu

195 200 205

Thr Leu Gly Thr Ile Leu Asp Ala Ser Tyr Arg Pro Gly Trp Trp Phe

210 215 220

Asn Phe Leu Thr Thr Glu Pro Pro Lys Tyr Ala Ser Leu Ser Asn Thr

225 230 235 240

Ser Gln Ser Leu Ala Glu Met Thr Gln Thr Met Phe Asp Pro Thr Leu

245 250 255

Asp Leu Glu Asp Leu Arg Trp Ile Arg Glu Gln Trp Asn Gly Arg Leu

260 265 270

Phe Val Lys Gly Ile Leu Thr Ala Asp Asp Ala Arg Arg Ala Gln Ser

275 280 285

Val Gly Ala Asp Gly Leu Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu

290 295 300

Asp Arg Ala Pro Asp Ser Leu Thr Ser Leu Ala Glu Val Arg Ala Glu

305 310 315 320

Val Gly Pro Glu Met Glu Leu Ile Phe Asp Ser Gly Ile Met Ser Gly

325 330 335

Thr Asp Val Val Ala Ala Leu Cys Ala Gly Ala Asp Phe Val Leu Ile

340 345 350

Gly Arg Ala Tyr Leu Tyr Gly Leu Met Ala Gly Gly Gln Arg Gly Val

355 360 365

Glu Arg Ala Ile Ala Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Thr Ala Met Gly

370 375 380

Leu Met Gly Ala Arg Ser Ile Ser Asp Leu Gly Pro Glu Leu Val Arg

385 390 395 400

Gly Leu Pro Gln Ala Pro Asn Thr Asp Gln Glu Leu Pro Ala Asp Ser

405 410 415

Met