本發(fā)明克隆表達(dá)了一種L-α-羥酸氧化酶，并公開(kāi)了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

L-α-羥酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一種以FMN(FAD)為輔酶的脫氫酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties of crystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a long chain alpha-hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95to glycine.J Biol Chem.19968；271(45):28300-28305)?？捎糜谏飩鞲衅髦袦y(cè)定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學(xué)純?chǔ)?羥酸的制備(中國(guó)專(zhuān)利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，綠色氣球菌(Aerococcus viridians)，鏈球菌屬(Streptococcus sp.)，片球菌屬(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，遲鈍愛(ài)德華菌(Edwardsiella tarda)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis),運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和過(guò)氧化醋桿菌(Acetobacter peroxidans)等細(xì)菌中克隆表達(dá)得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中檢測(cè)到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)

本發(fā)明首次從奈氏西地西菌(Cedecea neteri)中克隆表達(dá)出一種新型的L-α-羥酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(S)-α-羥酸，而且可以氧化(S)-α-羥酸酯，可應(yīng)用于光學(xué)純(R)-α-羥酸酯和(R)-α-羥酸的制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從奈氏西地西菌(Cedecea neteri)中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開(kāi)了其相關(guān)的酶學(xué)特性，并進(jìn)行了應(yīng)用研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明L-α-羥酸氧化酶基因的來(lái)源菌株為：Cedecea neteri ATCC 33855，購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種庫(kù)。

2、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

提取Cedecea neteri ATCC 33855菌體基因組總DNA。設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出L-α-羥酸氧化酶基因全長(zhǎng)編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、L-α-羥酸氧化酶表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、L-α-羥酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

以L-乳酸為底物研究pH對(duì)本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

以L-乳酸為底物研究溫度對(duì)本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

L-α-羥酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-蘋(píng)果酸、L-對(duì)羥基苯乳酸、L-丹參素、L-扁桃酸。

酶活測(cè)定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進(jìn)行。

5、L-α-羥酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(S)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對(duì)應(yīng)的α-酮酸酯，(R)-α-羥酸酯不被氧化。

產(chǎn)物(R)-α-羥酸酯的光學(xué)純度通過(guò)對(duì)映體過(guò)量值(％e.e)來(lái)評(píng)價(jià)：

對(duì)映體過(guò)量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_R為反應(yīng)后(R)-對(duì)映體的峰面積，S_S為反應(yīng)后(S)-對(duì)映體的液相色譜峰面積，S₀為反應(yīng)前(R)-和(S)-對(duì)映體的液相色譜峰面積之和。

產(chǎn)物測(cè)定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動(dòng)相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對(duì)羥基苯乳酸冰片酯、對(duì)羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細(xì)辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細(xì)辛醇酯、對(duì)羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國(guó)專(zhuān)利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)表明的有益之處：從Cedecea neteri ATCC 33855中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶，該酶可以氧化(S)-α-羥酸和(S)-α-羥酸酯，可用于規(guī)?；苽涫中约?R)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Cedecea neteri ATCC 33855 DNA的提取

將Cedecea neteri ATCC 33855菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過(guò)夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個(gè)離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGATTATTTCCGCAGCAACCGAC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGATATAAACCCTGGCGAACCAGCAAG 3'

(2)PCR擴(kuò)增

用以上合成的兩條引物，以Cedecea neteri ATCC 33855的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本步驟中擴(kuò)增體系為：

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應(yīng)30個(gè)循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序后得到該酯酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無(wú)菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無(wú)菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養(yǎng)24h長(zhǎng)勢(shì)良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進(jìn)行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進(jìn)行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來(lái)得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的最適溫度。以L-乳酸為底物，將底物與pH為8.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測(cè)定L-α-羥酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為30℃。

實(shí)施例4

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶的最適pH值。以L-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，30℃水浴15min測(cè)定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 8.0條件下L-α-羥酸氧化酶酶活最高。

實(shí)施例5

本實(shí)施例為本發(fā)明所述L-α-羥酸氧化酶與不同底物的反應(yīng)特性列于表2中。

表2L-α-羥酸氧化酶對(duì)不同底物的活性

實(shí)施例7

根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當(dāng)在反應(yīng)時(shí)間充分時(shí)，可以得到各類(lèi)高光學(xué)純的(R)-α-羥酸酯，該酶的光學(xué)專(zhuān)一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種氧化酶及其應(yīng)用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> Cedecea neteri ATCC 33855

<400> 1

atgattattt ccgcagcaac cgactaccgt gccgccgccg agcgcattct gccgcccttt 60

ttattccact acattgacgg tggggcctat gccgagcata cgctgaagcg caatgtggaa 120

gacctggcac aggtggcgct caagcagcgc gtactgaaaa acatgtcggc gctgagtctg 180

gaaaccaggc tgtttaacga aacgttgtct atgccggtgg ccctcggccc cgtggggctt 240

tgtggcatgt atgcgcgccg gggagaagtt caggccgcaa aagccgccgc ggcgaaaggc 300

attcccttta ctctgtcgac ggtgtccgtt tgtccgattg aagaagtcgc ccccgccatc 360

agccgcccga tgtggttcca gctttatgtc ctgaaagatc gcggttttat gcgcaatgcg 420

ctggagcggg cgaaagccgc cggatgctct acgctggtgt ttaccgtcga tatgccaacg 480

ccgggcgctc gctatcgtga tgcacactca ggcatgagcg gccctaacgc agcgatgcgc 540

cgttatcttc aggccgtaac gcacccgctg tgggcatggg atgtcggctt aaacggccgc 600

cctcatgatt tgggcaatat ctccgcctat ctcggcaaac cgaccgggct ggaagattat 660

atcggctggc tggcgaacaa ctttgacccg tccatttcct ggaaagatct ggagtggatc 720

cgcgagttct gggacggccc gatggtgatt aaagggatcc tcgacccgga agacgcccgc 780

gatgcggtgc gttttggcgc cgacgggatc gtggtgtcta accacggcgg ccgccagctg 840

gacggcgtgc tctcttccgc tcgcgccctg cccgctattg ccgatgcggt gaaaggcgat 900

attacgattc tggctgacag cggcatccgc aacggcctgg acgtggtgcg tatgattgcg 960

ctgggtgccg acacggtgct gctgggacgc gctttcctgt atgcgctggc gacccacggc 1020

gaagccggcg tcagcaatct gctgaactta atggagaaag agatgcgcgt ggcgatgacg 1080

ctgaccggcg cgaaatctat tgccgaaatt acgcctgact tgctggttcg ccagggttta 1140

taa 1143

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> Cedecea neteri ATCC 33855

<400> 2

Met Ile Ile Ser Ala Ala Thr Asp Tyr Arg Ala Ala Ala Glu Arg Ile

1 5 10 15

Leu Pro Pro Phe Leu Phe His Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Tyr Ala Glu

20 25 30

His Thr Leu Lys Arg Asn Val Glu Asp Leu Ala Gln Val Ala Leu Lys

35 40 45

Gln Arg Val Leu Lys Asn Met Ser Ala Leu Ser Leu Glu Thr Arg Leu

50 55 60

Phe Asn Glu Thr Leu Ser Met Pro Val Ala Leu Gly Pro Val Gly Leu

65 70 75 80

Cys Gly Met Tyr Ala Arg Arg Gly Glu Val Gln Ala Ala Lys Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Lys Gly Ile Pro Phe Thr Leu Ser Thr Val Ser Val Cys Pro

100 105 110

Ile Glu Glu Val Ala Pro Ala Ile Ser Arg Pro Met Trp Phe Gln Leu

115 120 125

Tyr Val Leu Lys Asp Arg Gly Phe Met Arg Asn Ala Leu Glu Arg Ala

130 135 140

Lys Ala Ala Gly Cys Ser Thr Leu Val Phe Thr Val Asp Met Pro Thr

145 150 155 160

Pro Gly Ala Arg Tyr Arg Asp Ala His Ser Gly Met Ser Gly Pro Asn

165 170 175

Ala Ala Met Arg Arg Tyr Leu Gln Ala Val Thr His Pro Leu Trp Ala

180 185 190

Trp Asp Val Gly Leu Asn Gly Arg Pro His Asp Leu Gly Asn Ile Ser

195 200 205

Ala Tyr Leu Gly Lys Pro Thr Gly Leu Glu Asp Tyr Ile Gly Trp Leu

210 215 220

Ala Asn Asn Phe Asp Pro Ser Ile Ser Trp Lys Asp Leu Glu Trp Ile

225 230 235 240

Arg Glu Phe Trp Asp Gly Pro Met Val Ile Lys Gly Ile Leu Asp Pro

245 250 255

Glu Asp Ala Arg Asp Ala Val Arg Phe Gly Ala Asp Gly Ile Val Val

260 265 270

Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly Val Leu Ser Ser Ala Arg

275 280 285

Ala Leu Pro Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Gly Asp Ile Thr Ile Leu

290 295 300

Ala Asp Ser Gly Ile Arg Asn Gly Leu Asp Val Val Arg Met Ile Ala

305 310 315 320

Leu Gly Ala Asp Thr Val Leu Leu Gly Arg Ala Phe Leu Tyr Ala Leu

325 330 335

Ala Thr His Gly Glu Ala Gly Val Ser Asn Leu Leu Asn Leu Met Glu

340 345 350

Lys Glu Met Arg Val Ala Met Thr Leu Thr Gly Ala Lys Ser Ile Ala

355 360 365

Glu Ile Thr Pro Asp Leu Leu Val Arg Gln Gly Leu

370 375 380