本發(fā)明克隆表達(dá)了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習(xí)慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測(cè)定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學(xué)純?chǔ)?羥酸的制備(中國(guó)專利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發(fā)現(xiàn)了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本發(fā)明首次從沙門氏菌(Salmonella enterica)中克隆表達(dá)出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應(yīng)與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應(yīng)相比逆反應(yīng)極微弱，可應(yīng)用于光學(xué)純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從沙門氏菌(Salmonella enterica)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性，并進(jìn)行了應(yīng)用研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明D-乳酸氧化酶基因的來(lái)源菌株為：Salmonella enterica ATCC 43845，購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種庫(kù)。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Salmonella enterica ATCC 43845菌體基因組總DNA。設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出D-乳酸氧化酶基因全長(zhǎng)編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、D-乳酸氧化酶表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、D-乳酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

以D-乳酸為底物研究pH對(duì)本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

以D-乳酸為底物研究溫度對(duì)本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對(duì)羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。

酶活測(cè)定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進(jìn)行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對(duì)應(yīng)的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。

產(chǎn)物(S)-α-羥酸酯的光學(xué)純度通過(guò)對(duì)映體過(guò)量值(％e.e)來(lái)評(píng)價(jià)：

對(duì)映體過(guò)量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R為反應(yīng)后(R)-對(duì)映體的峰面積，S_S為反應(yīng)后(S)-對(duì)映體的液相色譜峰面積，S₀為反應(yīng)前(R)-和(S)-對(duì)映體的液相色譜峰面積之和。

產(chǎn)物測(cè)定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動(dòng)相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對(duì)羥基苯乳酸冰片酯、對(duì)羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細(xì)辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細(xì)辛醇酯、對(duì)羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國(guó)專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)表明的有益之處：從Salmonella enterica ATCC 43845中克隆表達(dá)出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規(guī)?；苽涫中约?S)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Salmonella enterica ATCC 43845DNA的提取

將Salmonella enterica ATCC 43845菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過(guò)夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個(gè)離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGTCTTCCATAACAATGACTGAT 3'

引物2：5'GCCGTCTAGAGTTTCATCGGGCGTATTT 3'

用以上合成的兩條引物，以Salmonella enterica ATCC 43845的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本步驟中擴(kuò)增體系為：

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應(yīng)30個(gè)循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無(wú)菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無(wú)菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養(yǎng)24h長(zhǎng)勢(shì)良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進(jìn)行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進(jìn)行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來(lái)得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為5.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測(cè)定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為45℃。

實(shí)施例4

本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，45℃水浴15min測(cè)定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 5.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

實(shí)施例5

本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應(yīng)特性，列于表2中。

表2 D-乳酸氧化酶對(duì)不同底物的活性

實(shí)施例6

根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當(dāng)在反應(yīng)時(shí)間充分時(shí)，可以得到各類高光學(xué)純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學(xué)專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種氧化酶及其應(yīng)用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1731

<212> DNA

<213> Salmonella enterica ATCC 43845

<400> 1

atgtcttcca taacaatgac tgataataaa acgttcctga atgagctggc ccgcctggta 60

ggccattctc acctgctgac agaccccgcc aaaaccgccc gctatcgcaa gggtttccgt 120

tccggtcagg gcgatgcgct ggccgttgtt ttcccaagtt cgttactgga actgtggcgt 180

gtgctcaacg cctgcgttaa cgctgacaaa attattctga tgcaggccgc caacaccggt 240

ctgacggaag gctccacgcc gaacggcaac gactacgatc gcgatattgt gattatcagc 300

acccagcggc tggataagct gcacttactg gataacggcc aacaggttct ggcctggccc 360

ggtacgacgc tctatgcgct ggaaaaagcg cttaaaccgc tgggccgtga accgcactcg 420

gtgattggtt cgtcgtgtat cggcgcgtcg gtcatcggcg gcatctgtaa taactccggc 480

ggctcgctgg tgcagcgcgg cccggcctat accgagatgt cgctctttgc ccgtattgac 540

gagcaaggca aactgcaact ggtcaatcat ctgggtatcg atcttgggca tacgccggag 600

cagatcctga gcaagctgga tgatgaacgg attaaagatg aggatgtgcg tcacgatggt 660

cgtcatgcgc acgatcacga ctacgtgacg cgggtacgag atatcaacgc cgatacgccc 720

gcccgctata acgccgaccc ggaccgtttg tttgaatctt ccggctgcgc cggaaaactg 780

gcggttttta ccgttcgcct tgataccttt gcagcggaaa aaaatcagca ggttttttat 840

atcggcacca atcagcccgc ggtactgact gaaatccgtc ggcatattct ggcgaacttc 900

gacaatctgc cagtggcggg agaatatatg catcgcgata tctacgatat tgcggagcag 960

tacggtaaag atacctttct gatgatcgat aaactcggca ccgacaagat gccattcttt 1020

ttcacgctaa aaggccgaac cgatgcgatg ctggaaaaag taaaattttt ccgaccgcat 1080

ttcaccgacc gcgcgatgca gaaattcggc cacctgtttc ccagccatct gccgccgcga 1140

atgaaaaact ggcgcgataa atatgagcat catctgctgt taaaaatggc gggagacggc 1200

gtcgcagaag cgcaacgctg gctgaatgaa ttttttaaat ccgctgaggg cggtttcttc 1260

acctgtacgc cggaagaagg cagcaaagcc ttcctgcacc gcttcgccgc tgctggcgcg 1320

gcgattcgtt atcaggccgt acacgctgat gaagtggaag atattctggc gctggatatc 1380

gctctgcgcc gcaacgatac cgactggttc gagcatctgc cgccggaaat cgacagccaa 1440

ctggtacata aactctatta cggccacttt atgtgccacg tttttcatca ggactatatc 1500

gtgaagaaag gcgtcgacgt ccatgcgctg aaagcgcaaa tgttggagct gttgcaggcg 1560

cgcggggcac aatacccggc ggagcacaac gttggacatc tgtataaagc gccggaaacg 1620

ctgacgcgtt tttatcggca aaatgaccca accaacagta tgaaccccgg tatcggcaaa 1680

acgagtaagc ggaaattctg gcaggaaaat acgcccgatg aaacgcatta a 1731

<210> 2

<211> 576

<212> PRT

<213> Salmonella enterica ATCC 43845

<400> 2

Met Ser Ser Ile Thr Met Thr Asp Asn Lys Thr Phe Leu Asn Glu Leu

1 5 10 15

Ala Arg Leu Val Gly His Ser His Leu Leu Thr Asp Pro Ala Lys Thr

20 25 30

Ala Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala

35 40 45

Val Val Phe Pro Ser Ser Leu Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Asn Ala

50 55 60

Cys Val Asn Ala Asp Lys Ile Ile Leu Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly

65 70 75 80

Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Asn Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Asp Ile

85 90 95

Val Ile Ile Ser Thr Gln Arg Leu Asp Lys Leu His Leu Leu Asp Asn

100 105 110

Gly Gln Gln Val Leu Ala Trp Pro Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Leu Glu

115 120 125

Lys Ala Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser

130 135 140

Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Ile Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Val Gln Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Met Ser Leu Phe

165 170 175

Ala Arg Ile Asp Glu Gln Gly Lys Leu Gln Leu Val Asn His Leu Gly

180 185 190

Ile Asp Leu Gly His Thr Pro Glu Gln Ile Leu Ser Lys Leu Asp Asp

195 200 205

Glu Arg Ile Lys Asp Glu Asp Val Arg His Asp Gly Arg His Ala His

210 215 220

Asp His Asp Tyr Val Thr Arg Val Arg Asp Ile Asn Ala Asp Thr Pro

225 230 235 240

Ala Arg Tyr Asn Ala Asp Pro Asp Arg Leu Phe Glu Ser Ser Gly Cys

245 250 255

Ala Gly Lys Leu Ala Val Phe Thr Val Arg Leu Asp Thr Phe Ala Ala

260 265 270

Glu Lys Asn Gln Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Gln Pro Ala Val

275 280 285

Leu Thr Glu Ile Arg Arg His Ile Leu Ala Asn Phe Asp Asn Leu Pro

290 295 300

Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg Asp Ile Tyr Asp Ile Ala Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys

325 330 335

Met Pro Phe Phe Phe Thr Leu Lys Gly Arg Thr Asp Ala Met Leu Glu

340 345 350

Lys Val Lys Phe Phe Arg Pro His Phe Thr Asp Arg Ala Met Gln Lys

355 360 365

Phe Gly His Leu Phe Pro Ser His Leu Pro Pro Arg Met Lys Asn Trp

370 375 380

Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu Leu Leu Lys Met Ala Gly Asp Gly

385 390 395 400

Val Ala Glu Ala Gln Arg Trp Leu Asn Glu Phe Phe Lys Ser Ala Glu

405 410 415

Gly Gly Phe Phe Thr Cys Thr Pro Glu Glu Gly Ser Lys Ala Phe Leu

420 425 430

His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Gln Ala Val His

435 440 445

Ala Asp Glu Val Glu Asp Ile Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg

450 455 460

Asn Asp Thr Asp Trp Phe Glu His Leu Pro Pro Glu Ile Asp Ser Gln

465 470 475 480

Leu Val His Lys Leu Tyr Tyr Gly His Phe Met Cys His Val Phe His

485 490 495

Gln Asp Tyr Ile Val Lys Lys Gly Val Asp Val His Ala Leu Lys Ala

500 505 510

Gln Met Leu Glu Leu Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Ala Glu

515 520 525

His Asn Val Gly His Leu Tyr Lys Ala Pro Glu Thr Leu Thr Arg Phe

530 535 540

Tyr Arg Gln Asn Asp Pro Thr Asn Ser Met Asn Pro Gly Ile Gly Lys

545 550 555 560

Thr Ser Lys Arg Lys Phe Trp Gln Glu Asn Thr Pro Asp Glu Thr His

565 570 575