本發(fā)明涉及蛋白制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白及制備方法。

背景技術(shù)：

醫(yī)學(xué)影像技術(shù)是探究體內(nèi)細(xì)微生命的重要方法，它可實現(xiàn)分子水平上高靶向地對活體內(nèi)疾病的發(fā)生、生長進(jìn)行治療，是一種新的健康醫(yī)療模式。醫(yī)學(xué)影像技術(shù)主要包括核磁共振MRI、CT、醫(yī)學(xué)超聲以及光學(xué)成像等。生物發(fā)光成像(Bioluminescence imaging)是光學(xué)成像中的一種重要的成像手段，它具有無需光源激發(fā)，無散射、穿透率高、極低的背景干擾和極高信噪比等優(yōu)點。其在有氧的條件下，以熒光素酶作為體內(nèi)報告源，通過與底物作用而發(fā)光。近年來已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

作為報告基因，熒光素酶需要具備某些特定的條件，如具有明顯的光譜特征，高量子產(chǎn)率且底物在細(xì)胞內(nèi)無累積等。Gaussia luciferase(Gluc)是從夏威夷的一種海洋橈足類動物中獲取的熒光素酶，它具有2個獨特的domain區(qū)域，且都有生物發(fā)光活性，由185個氨基酸組成，大小19.9KDa且以腸腔素作為底物。因其超高的熒光強度，良好的酶穩(wěn)定性和分泌活性，被廣泛用于開發(fā)生物發(fā)光成像檢測系統(tǒng)對基因分子事件、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞生命活動、動物生理病理等生物學(xué)過程實時監(jiān)控。而且，Gluc中含有11個半胱氨酸，占氨基酸數(shù)量的5.95％，研究更顯示，Gluc中的10個半胱氨酸通過共價鍵可以形成5對二硫鍵，其中一對二硫鍵處于2個domain區(qū)域之間，而其他二硫鍵都在domain區(qū)域內(nèi)部中形成，因此，Gluc也被稱之為二硫鍵蛋白(Disulfide bonded protein)。Gluc作為一種二硫鍵蛋白，其面臨的最大困難是如何在大腸桿菌表達(dá)中形成可溶并完全正確折疊的二硫鍵蛋白，因為二硫鍵的正確折疊對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，活性等具有至關(guān)重要的影響。而大腸桿菌中蛋白的高效表達(dá)往往難以預(yù)期，特別是對于Gluc這樣一種高度含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，更是不可控。因此，Gluc熒光素酶在應(yīng)用中也存在一些局限性，主要包括信號猝滅，在體外吸收藍(lán)光會迅速光衰減等，這使其應(yīng)用遇到了極大的瓶頸。

因此，如何優(yōu)化其光學(xué)穩(wěn)定性，建立對個體的長時間、可重復(fù)性、可穩(wěn)定控制的跟蹤成像體系是亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白的制備方法，該方法解決了熒光素酶光學(xué)穩(wěn)定性差，熒光猝滅迅速的問題，還解決了由于Gluc熒光素酶含有多組二硫鍵導(dǎo)致其在大腸桿菌中表達(dá)時，難以實現(xiàn)可溶性和二硫鍵的正確折疊從而使其在實際生物發(fā)光成像應(yīng)用中受到限制的問題。

本發(fā)明的另一個目的在于提供由上述制備方法制得的基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白，該二硫鍵蛋白具有高的光穩(wěn)定性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白的制備方法，該方法包括在Gluc熒光素酶基因的C端引入SEP-tag，將連接有SEP標(biāo)簽的Gluc熒光素酶基因插入表達(dá)載體的多克隆位點，得到熒光素酶Gluc-SEP基因表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到同時具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化還原基因的大腸桿菌菌株，得到含有該表達(dá)載體的表達(dá)菌株，培養(yǎng)該表達(dá)菌株，表達(dá)得到基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白。

優(yōu)選地，所述方法還包括在連接有SEP標(biāo)簽的Gluc熒光素酶基因的N端引入純化標(biāo)簽。

優(yōu)選地，，所述表達(dá)載體為pET系列表達(dá)載體，所述pET系列表達(dá)載體包括pET28a、pET21a、pET25b、pET27b或pET30a。

優(yōu)選地，所述純化標(biāo)簽包括His6、GST、Strep或CBD。

優(yōu)選地，所述多克隆位點為BamH I和Sal I酶切位點、BamH I和Hind III酶切位點、BamH I和Not I酶切位點、BamH I和Xho I酶切位點、Nde I和Sal I酶切位點、Nde I和Hind III酶切位點、Nde I和Not I酶切位點或Nde I和Xho I酶切位點。

優(yōu)選地，所述同時具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化還原基因的大腸桿菌菌株包括SHuffle T7B E.coli菌株或SHuffle T7K12E.coli菌株。

優(yōu)選地，所述方法中用IPTG誘導(dǎo)連接有SEP標(biāo)簽的Gluc熒光素酶基因的表達(dá)，其中，IPTG的濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)溫度為35-37℃，誘導(dǎo)時間為5-8h；或誘導(dǎo)溫度為14-18℃，誘導(dǎo)時間為10-14h。

優(yōu)選地，所述方法中還包括將得到的基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白進(jìn)行純化的步驟。

由所述制備方法制得的基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白的二級結(jié)構(gòu)具有大于80％的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述二硫鍵蛋白具有下述一種或幾種特性：

光譜最高發(fā)射峰為480nm，或

光衰減的半衰期為6min，或

在60℃孵育30min后活性保持在85％以上，或

從25℃到95℃過程中，二級結(jié)構(gòu)組成沒有變化。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明在Gluc的C端引入一個SEP-tag(GDDD–GDDD GDDD)促進(jìn)了大部分的二硫鍵的正確折疊，將C端帶有SEP-tag的Gluc基因轉(zhuǎn)入到同時具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化還原基因的大腸桿菌菌株中，有效減少了因大腸桿菌在表達(dá)過程中逐漸形成的缺氧環(huán)境而使二硫鍵正確折疊的氧化環(huán)境缺失的問題，構(gòu)建的表達(dá)菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)后，得到的蛋白熒光活性非常強，并且圓二色譜CD熱力學(xué)研究顯示其二級結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定非常好，從常溫到95℃的高溫，其二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生任何改變。

附圖說明

圖1為實施例3和對比例1的熒光光譜發(fā)射峰的比較圖；

圖2實施例3和對比例1的熒光活性比較圖；

圖3為實施例3和對比例1的熒光活性衰減動力學(xué)的比較圖；

圖4為實施例3和對比例1的熱穩(wěn)定性比較圖；

圖5為實施例3和對比例1的圓二色譜峰比較圖；

圖6A為對比例1的圓二色譜熱力學(xué)穩(wěn)定性圖；

圖6B為實施例3的圓二色譜熱力學(xué)穩(wěn)定性圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明的發(fā)明人通過對Gluc熒光素酶結(jié)構(gòu)的理性分析，得出大腸桿菌中表達(dá)的Gluc熒光素酶之所以穩(wěn)定性差，光信號衰減快，主要有兩方面的原因：

1.Gluc作為一種二硫鍵蛋白，難以在大腸桿菌表達(dá)中形成可溶并完全正確折疊的二硫鍵蛋白；

2.如何提供二硫鍵正確折疊所需要的氧化環(huán)境；

而傳統(tǒng)的提高Gluc熒光素酶穩(wěn)定性和熒光強度的策略主要是通過構(gòu)建隨機突變體文庫，從中篩選優(yōu)勢性能的Gluc熒光素酶突變體，工作量大，比較繁瑣并且盲目性較大。

所以，本發(fā)明的發(fā)明人基于對Gluc熒光素酶結(jié)構(gòu)的理性分析，

通過在Gluc的C端引入一個SEP-tag(GDDD–GDDD–GDDD)；然后選擇同時具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化還原基因的大腸桿菌菌株提供二硫鍵正確折疊所需要的氧化環(huán)境而解決了上述問題。

本發(fā)明的上述方法構(gòu)思也適用于其他二硫鍵蛋白，如vtPA N-HIS、AppA、Cel9A、PhoA、Chitinase和CelZ等。

實施例1

熒光素酶Gluc-SEP基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1.引物

正向引物：

5’-CGCGGATCCATGAAGCCCACCGAGAACAACGAA-3’；(SEQ ID NO：1)

反向引物：

5’-ACGCCGTCGACGTCGTCGTCTCCGTCGTCGTCTCCGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTT-3’(SEQ ID NO：2)

2.Gluc熒光素酶基因的PCR擴增

PCR反應(yīng)體系：

5μL 10×High Figelity PCR buffer，15mM MgCl₂,1mM dNTP Mix,0.3μM正向引物，0.3μM反向引物，10pg模板量，1.25U High Fidelity PCR Enzyme Mix,最后補充雙蒸水至總體系為50μL；

PCR反應(yīng)條件：

94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，反應(yīng)循環(huán)25次，最后72℃終延伸10min。

3.熒光素酶Gluc-SEP基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述步驟2獲得的含有Gluc熒光素酶基因的PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與用同樣酶切的載體pET28a用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到熒光素酶Gluc-SEP基因表達(dá)載體；

插入的熒光素酶Gluc基因的序列如下：

ATGAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGAC；(SEQ ID NO：3)

標(biāo)簽SEP-tag的基因序列如下：

GGAGACGACGACGGAGACGACGAC。(SEQ ID NO：4)

實施例2

Gluc-SEP-Shuffle表達(dá)菌株的制備

將實施例1的熒光素酶Gluc-SEP基因表達(dá)載體在42℃熱處理轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)復(fù)蘇并涂布到LB平板(含有25μg/ml卡那霉素)篩選，挑取菌落進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，篩選到的陽性菌株經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，最后進(jìn)行基因測序鑒定；之后將測序鑒定正確的質(zhì)粒熱處理轉(zhuǎn)化到SHuffle T7B E.coli表達(dá)菌株，并進(jìn)行甘油菌保種凍存以備用。

實施例3

Gluc-SEP-Shuffle蛋白的表達(dá)及純化

首先將凍存的甘油菌Gluc-SEP-SHuffle接種到LB液體培養(yǎng)基(含有25μg/ml氨芐青霉素)中，37℃，225rpm培養(yǎng)過夜活化菌株，其次按1:100的比例將活化的菌液接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)中，培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4-0.6，即為菌種的生長對數(shù)期，然后加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷IPTG(終濃度為1mM)在37℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)7h，4℃下11000rpm離心10min收集菌體，棄去上清LB培養(yǎng)基，加入一定量的結(jié)合緩沖液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，40mM咪唑溶液，pH 7.4)懸浮菌體，利用超聲波破碎菌體，超聲3sec，間隔4sec，超聲直至溶液完全澄清透明后于4℃離心高速分離去除不溶性蛋白，獲得上清可溶性蛋白；利用Ni柱中的填料硫酸鎳與表達(dá)載體上的組氨酸標(biāo)簽融合蛋白能特異性結(jié)合的原理去除雜蛋白，再用咪唑洗脫液(20mM Na₃PO₄，0.5MNaCl，150mM咪唑溶液，pH 7.4)的競爭性結(jié)合到Ni柱填料，將組氨酸融合蛋白從柱子上洗脫下來，得到的蛋白經(jīng)透析去除咪唑得到Gluc熒光素酶目的蛋白(Gluc-SEP-Shuffle蛋白)。

對比例1

1.Gluc-SEP-BL21(DE3)表達(dá)菌株的制備

將實施例1的熒光素酶Gluc-SEP基因表達(dá)載體在42℃熱處理轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)復(fù)蘇并涂布到LB平板(含有25μg/ml卡那霉素)篩選，挑取菌落進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，篩選到的陽性菌株經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，最后進(jìn)行基因測序鑒定；之后將測序鑒定正確的質(zhì)粒熱處理轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌，并進(jìn)行甘油菌保種凍存以備用；

2.Gluc-SEP-BL21(DE3)蛋白的表達(dá)及純化

首先將凍存的甘油菌Gluc-SEP-BL21(DE3)接種到LB液體培養(yǎng)基(含有25μg/ml氨芐青霉素)中，37℃，225rpm培養(yǎng)過夜活化菌株，其次按1:100的比例將活化的菌液接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)中，培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4-0.6，即為菌種的生長對數(shù)期，然后加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷IPTG(終濃度為1mM)在25℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)4h，4℃下11000rpm離心10min收集菌體，棄去上清LB培養(yǎng)基，加入一定量的結(jié)合緩沖液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，40mM咪唑溶液，pH7.4)懸浮菌體，利用超聲波破碎菌體，超聲3sec，間隔4sec，超聲直至溶液完全澄清透明后于4℃離心高速分離去除不溶性蛋白，獲得上清可溶性蛋白；利用Ni柱中的填料硫酸鎳與表達(dá)載體上的組氨酸標(biāo)簽融合蛋白能特異性結(jié)合的原理去除雜蛋白，再用咪唑洗脫液(20mM Na₃PO₄，0.5MNaCl，150mM咪唑溶液，pH 7.4)的競爭性結(jié)合到Ni柱填料，將組氨酸融合蛋白從柱子上洗脫下來，得到的蛋白經(jīng)透析去除咪唑得到Gluc熒光素酶目的蛋白(Gluc-SEP-BL21(DE3)蛋白)。

取實施例3和對比例1的Gluc熒光素酶目的蛋白進(jìn)行生物發(fā)光分析:

Gluc熒光素酶生物發(fā)光的反應(yīng)是以腸腔素(coelenterazine)作為催化底物的，底物的貯存液采用乙醇配至濃度為0.5mg/ml，并貯存在-80℃冰箱備用。

光譜分析：2種Gluc熒光素酶目的蛋白的光譜分析都采用Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶標(biāo)儀檢測，并使用Corning黑色透明底96孔板進(jìn)行反應(yīng)，其中反應(yīng)總體系為200μL，加入熒光素酶的量為0.2μM，底物量為5.9μM，其余的用1×PBS緩沖液進(jìn)行補充。檢測的參數(shù)設(shè)定為掃描范圍為200-400nm，間隔時間為800ms，峰寬為20nm。

生物發(fā)光活性分析：2種Gluc熒光素酶目的蛋白的生物發(fā)光活性分析都采用Perkin Elmer VICTOR X4多標(biāo)記微孔板檢測儀進(jìn)行檢測，并使用Greine白色96孔板進(jìn)行反應(yīng)，其中反應(yīng)總體系為200μL，加入熒光素酶的量為1pmol，底物量為5.9μM，其余的用1×PBS緩沖液進(jìn)行補充。檢測的濾光片設(shè)定為480/40nm。同時分別取等量的酶液于60℃孵育30min后測定其生物發(fā)光熱穩(wěn)定性。

結(jié)論：

圖1中是實施例3和對比例1的熒光光譜發(fā)射峰的比較，其中Gluc-SEP-SHuffle的發(fā)射峰在480nm，Gluc-SEP-BL21(DE3)的發(fā)射峰在477nm，通過比較得知Gluc-SEP-SHuffle具有較高的熒光強度。

圖2中是實施例3和對比例1的熒光活性比較；其中Gluc-SEP-Shuffle具有比Gluc-SEP-BL21(DE3)高達(dá)2倍的活性。

圖3中是實施例3和對比例1的熒光活性衰減動力學(xué)的比較；其中Gluc-SEP-Shuffle的半衰期高達(dá)6min，而Gluc-SEP-BL21(DE3)的半衰期不到1min。

圖4中是實施例3和對比例1的熱穩(wěn)定性比較；其中Gluc-SEP-SHuffle在60℃孵育30min后活性能保留80％以上，而Gluc-SEP-BL21(DE3)的活性只能保留60％。

對實施例3和對比例1的Gluc熒光素酶目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行圓二色譜CD分析:

2種Gluc熒光素酶目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)都采用Jasco J-815圓二色譜進(jìn)行分析，采用的比色皿的光學(xué)量程為1mm，所有的樣品都經(jīng)過提前預(yù)處理更換緩沖液為圓二色譜檢測緩沖液20mM磷酸鈉溶液(pH為7.2-7.4)，所檢測的蛋白濃度稀釋到0.2mg/ml。設(shè)定圓二色譜參數(shù)為：掃描范圍250-190nm，靈敏度100mdeg，數(shù)據(jù)間距0.5nm，連續(xù)的掃描模式，掃描速度100nm/min，間隔時間1s，峰寬1nm，測定3次平均。圓二色譜熱力學(xué)分析選用不同的溫度分別為25℃、45℃、65℃、85℃和95℃。在測定樣品前首先測定圓二色譜緩沖液的背景值，并設(shè)置扣除緩沖液背景，最后才進(jìn)行樣品分析。所有的數(shù)據(jù)經(jīng)過一個圓二色譜分析網(wǎng)(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)進(jìn)行處理，其中分析模式選擇SELCONS和set 4，最后計算Gluc熒光素酶的二級結(jié)構(gòu)組成。

結(jié)論：

圖5中是實施例3和對比例1的圓二色譜峰比較；其中Gluc-SEP-SHuffle表現(xiàn)了極強的信號值。

圖6A是對比例1的圓二色譜熱力學(xué)穩(wěn)定性圖，圖6B是實施例3的圓二色譜熱力學(xué)穩(wěn)定性圖，溫度設(shè)定為25℃到95℃；比較圖6A和6B，從光譜圖看變化不大。

實施例3和對比例1的二級結(jié)構(gòu)組成比較，如表1所示，

表1

表1中Gluc-SEP-SHuffle從常溫25℃到高溫95℃，二級結(jié)構(gòu)沒有任何改變，是由大部分α-螺旋(包括58.2％α-螺旋，22.2％的扭曲α-螺旋)、無序狀(14.4％)和少數(shù)轉(zhuǎn)角(5.2％)結(jié)構(gòu)組成的；而Gluc-SEP-BL21(DE3)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了極大的變化，特別是沒有完全正確折疊的部分β-折疊在加熱中可以逐漸形成α-螺旋結(jié)構(gòu)直至穩(wěn)定。其中α_R為α-螺旋，α_D為扭曲α-螺旋結(jié)構(gòu)，β_R為β-折疊結(jié)構(gòu)，β_D為扭曲β-折疊結(jié)構(gòu)，T為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，U為無序結(jié)構(gòu)。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

<110> 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院

<120> 基于Gluc熒光素酶的二硫鍵蛋白及制備方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatcca tgaagcccac cgagaacaac gaa 33

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgccgtcga cgtcgtcgtc tccgtcgtcg tctccgtcac caccggcccc cttgatctt 59

<210> 3

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaagccca ccgagaacaa cgaagacttc aacatcgtgg ccgtggccag caacttcgcg 60

accacggatc tcgatgctga ccgcgggaag ttgcccggca agaagctgcc gctggaggtg 120

ctcaaagaga tggaagccaa tgcccggaaa gctggctgca ccaggggctg tctgatctgc 180

ctgtcccaca tcaagtgcac gcccaagatg aagaagttca tcccaggacg ctgccacacc 240

tacgaaggcg acaaagagtc cgcacagggc ggcataggcg aggcgatcgt cgacattcct 300

gagattcctg ggttcaagga cttggagccc atggagcagt tcatcgcaca ggtcgatctg 360

tgtgtggact gcacaactgg ctgcctcaaa gggcttgcca acgtgcagtg ttctgacctg 420

ctcaagaagt ggctgccgca acgctgtgcg acctttgcca gcaagatcca gggccaggtg 480

gacaagatca agggggccgg tggtgac 507

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagacgacg acggagacga cgac 24