本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：LOX（Lipoxygenase，LOX）是非血紅素、非硫鐵過(guò)氧化酶，它能催化具有順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸及其酯類發(fā)生空間及位置特異性的雙加氧反應(yīng)，生成相應(yīng)的氫過(guò)氧化物。在植物中其天然底物主要是亞油酸和亞麻酸，在動(dòng)物體內(nèi)其天然底物主要是花生四烯酸。LOX作為無(wú)毒、無(wú)害、天然的添加劑在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。在面粉的加工過(guò)程中它能夠?qū)⒚娣壑械亩嗖伙柡椭舅岽呋趸蓺溥^(guò)氧化物，這些氫過(guò)氧化物能夠起到提高面粉白度，增強(qiáng)面筋蛋白強(qiáng)度的作用。另外，在污水處理與環(huán)境保護(hù)方面，可以用于染料的降解。然而脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性差的缺陷限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。因此，通過(guò)分子改造來(lái)提高脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性以期獲得酶學(xué)性質(zhì)更適用工業(yè)應(yīng)用的突變酶是目前的研究熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是為了提供一種酶活與熱穩(wěn)定性同時(shí)提高的脂肪氧合酶突變體及其構(gòu)建方法，提高了脂肪氧合酶突變體的熱穩(wěn)定性，擴(kuò)展了應(yīng)用范圍。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體，該脂肪氧合酶突變體具有如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6中任一種所示的氨基酸序列。一種以上所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體中PCR反應(yīng)的簡(jiǎn)并引物，其特征在于，該簡(jiǎn)并引物具體如下：N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。一種以上所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：（1）魚腥藻脂肪氧合酶突變位點(diǎn)確定：將魚腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸作為飽和突變位點(diǎn)；（2）魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫(kù)的建立及突變體篩選：以重組質(zhì)粒為模板，在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸相對(duì)應(yīng)的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，該簡(jiǎn)并引物如以上所述，進(jìn)行全質(zhì)粒PCR反應(yīng)，構(gòu)建3個(gè)定點(diǎn)飽和突變庫(kù)，DpnI消化模板，純化后產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有100μg/ml氨芐抗性LB平板上，37℃下培養(yǎng)16-24小時(shí)，得到3個(gè)飽和突變庫(kù)；（3）取3個(gè)飽和突變庫(kù)的菌落接種于含有氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，得到3個(gè)突變體庫(kù)的母版，取母版接種于含有氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃下培養(yǎng)3h，再加入IPTG低溫誘導(dǎo)16h；然后裂解菌體，得到粗酶液，將粗酶液在50℃條件下孵育5min，冷卻，測(cè)定殘余活力，得到陽(yáng)性突變體；；（4）將步驟（3）得到的陽(yáng)性突變體接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加IPTG低溫誘導(dǎo)，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，將上清液過(guò)Ni-NTA親和柱純化，透析去除咪唑即得到純的脂肪氧合酶突變體。進(jìn)一步地，所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法，步驟（2）中大腸桿菌為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。進(jìn)一步地，所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中重組質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pET32a-Ana-LOX。進(jìn)一步地，所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法，步驟（2）中全質(zhì)粒PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：96℃5min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃5min。進(jìn)一步地，所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法，步驟（3）中裂解菌體采用凍融破碎的方法進(jìn)行，具體為-70℃冷凍2小時(shí)，室溫融化1小時(shí)，反復(fù)凍融。以上所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體在食品、制藥、造紙或污水處理中的應(yīng)用。與野生型魚腥藻脂肪氧合酶相比，本發(fā)明的脂肪氧合酶突變體的熱穩(wěn)定性獲得了提高，以各自的比活力及半衰期t1/2來(lái)表示酶活與熱穩(wěn)定性的提高，本發(fā)明的脂肪氧合酶突變體熱穩(wěn)定性提高如表1所示。表1本發(fā)明首先利用已知的結(jié)構(gòu)與生物信息學(xué)信息，找出可能的突變位點(diǎn)，在對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，構(gòu)建突變文庫(kù)；然后在96孔板上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；最后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選得到性質(zhì)改良的突變體。再以此突變株作為模板，組合其余位點(diǎn)的突變，重復(fù)上述過(guò)程。本發(fā)明運(yùn)用半理性設(shè)計(jì)的方法，對(duì)魚腥藻脂肪氧合酶基因進(jìn)行多輪定點(diǎn)飽和突變，獲取脂肪氧合酶突變體，這些突變體包含氨基酸突變G260A、S437T、N130D及組合突變體N130D/S437Y、N130D/G260Q。以各自的比活力與半衰期t1/2來(lái)表示，脂肪氧合酶突變體的活力與熱穩(wěn)定性得到了提高，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中脂肪氧合酶家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中多重序列比對(duì)選擇突變位點(diǎn)圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中脂肪氧合酶突變體熱失活動(dòng)力學(xué)圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中脂肪氧合酶突變體最適反應(yīng)溫度圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例11.飽和突變位點(diǎn)的確定：對(duì)脂肪氧合酶家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，選擇與魚腥藻脂肪氧合酶進(jìn)化關(guān)系緊密的同一家族的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)合結(jié)構(gòu)信息確定下列位點(diǎn)為飽和突變位點(diǎn)：自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位絲氨酸。其中魚腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。突變位點(diǎn)選擇過(guò)程具體為在pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇脂肪氧合酶家族序列，將其通道blastp與Ana-LOX進(jìn)行比對(duì)，篩選出相似度30%-90%的序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終選擇與Ana-LOX親緣關(guān)系最近的序列（圖1）。將這些序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果與Ana-LOX進(jìn)行比較，篩選出潛在的突變位點(diǎn)（圖2）。Ana-LOX序列提交phyre2網(wǎng)站構(gòu)建三維模型，將潛在的突變位點(diǎn)放在模型中結(jié)合作用力分析，最終確定自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位絲氨酸為突變位點(diǎn)。其中圖1為脂肪氧合酶家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹圖，通過(guò)構(gòu)建Ana-LOX與其蛋白質(zhì)家族的系統(tǒng)發(fā)育樹篩選出8條序列與其進(jìn)化關(guān)系緊密，選擇這些序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。圖2為多重序列比對(duì)選擇突變位點(diǎn)圖，可以發(fā)現(xiàn)Ana-LOX氨基酸序列與其多重序列比對(duì)存在大量的位點(diǎn)不一致，例如130號(hào)位Ana-LOX為天冬酰胺而該處頻率最高的氨基酸為天冬氨酸，可以將其視為潛在的突變位點(diǎn)，可以做為進(jìn)一步分析的候選。2.魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫(kù)的建立及突變體篩選用下述方法篩選具有較好熱穩(wěn)定性的魚腥藻脂肪氧合酶的突變體，具體過(guò)程包括以下步驟：1）根據(jù)突變位點(diǎn)構(gòu)建飽和突變庫(kù)并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以重組質(zhì)粒pET32a-Ana-LOX為模板，根據(jù)以上確定的突變位點(diǎn)，分別在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位絲氨酸相對(duì)應(yīng)的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：N130-fTTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG（SEQIDNO.7）N130-rTTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG（SEQIDNO.8）S437-fGGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC（SEQIDNO.9）S437-rTCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG（SEQIDNO.10）G260-fGCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA（SEQIDNO.11）G260-rAACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG（SEQIDNO.12）以上簡(jiǎn)并引物中，N代表ATCG中的任一種；M代表A和C中的任一種；K代表G和T中的任一種。然后進(jìn)行全質(zhì)粒PCR反應(yīng)，使用TaKaRa公司的PrimeSTARDNA聚合酶，PCR反應(yīng)條件為：96℃5min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃5min。構(gòu)建3個(gè)定點(diǎn)飽和突變庫(kù)，DpnI消化模板，純化后產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有100μg/ml氨芐抗性LB平板上，37℃下培養(yǎng)16-24小時(shí)，得到3個(gè)飽和突變庫(kù)；2）從飽和突變體庫(kù)中篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體取飽和突變庫(kù)中的菌落接種于含有100μg/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，得到3個(gè)突變體庫(kù)的母版；從培養(yǎng)好的母版中取20μl接種至含有100μg/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃下培養(yǎng)3h，在加入終濃度為100μg/ml的IPTG，16℃誘導(dǎo)16h；利用凍融破碎的方法裂解菌體，得到粗酶液；將所得到的粗酶液在50℃下孵育5min，在冰上冷卻，測(cè)定每孔的殘余活力；以野生型為對(duì)照，將殘余活力高于野生型的作為陽(yáng)性突變體。將篩選到的陽(yáng)性突變體工程菌接種于含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加IPTG至100μg/mL，低溫16℃誘導(dǎo)16h，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，并將上清液過(guò)Ni-NTA親和柱純化，透析去除咪唑即可得到純的脂肪氧合酶突變體；純酶液測(cè)定50℃下的半衰期，確定每個(gè)突變體庫(kù)中熱穩(wěn)定性最高的突變體，進(jìn)行測(cè)序，至此完成了第一輪篩選，得到三個(gè)熱穩(wěn)定性與酶活提高的突變體，分別為N130D，G260A和S437T，分別對(duì)應(yīng)SEQIDNO.2，3和4。以N130D的基因作為模板，進(jìn)行突變體組合：針對(duì)260位甘氨酸、437位絲氨酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)飽和突變庫(kù)，并參考上述步驟進(jìn)行新一輪的篩選；經(jīng)過(guò)組合突變，獲得了兩株熱穩(wěn)定性與酶活力顯著提高的突變株，經(jīng)測(cè)序確定兩株組合突變體分別為：N130D/G260Q，N130D/S437Y，分別對(duì)應(yīng)SEQIDNO.5和6。為了測(cè)定脂肪氧合酶突變體的比活力與半衰期，對(duì)酶進(jìn)行分離純化。將超聲破碎得到的粗酶液通過(guò)Ni2+離子親和柱進(jìn)行純化，透析過(guò)夜即可得到純的脂肪氧合酶突變體純酶。脂肪氧合酶在50℃下半衰期的測(cè)定方法為：50℃下孵育酶液，在不同處理時(shí)間取樣，測(cè)定殘余活力百分比。以殘余活力百分比的ln值對(duì)時(shí)間t（min）作圖，直線的斜率為失活常數(shù)kd，由t1/2=ln2/kd得到脂肪氧合酶在該溫度下的半衰期。圖3為脂肪氧合酶突變體熱失活動(dòng)力學(xué)圖在單點(diǎn)突變中N130D突變對(duì)酶熱穩(wěn)定性的改良最為顯著。在N130D的基礎(chǔ)上，組合突變體N130D/S437Y、N130D/G260Q的熱穩(wěn)定性也有了進(jìn)一步提升。圖4為脂肪氧合酶突變體最適反應(yīng)溫度圖，突變體對(duì)溫度的適應(yīng)范圍相比野生型變得更寬，在常溫下25℃野生型活力低于50%，而突變體均超過(guò)60%，可以推測(cè)突變體活化能降低。野生型對(duì)穩(wěn)定較為敏感，當(dāng)溫度超過(guò)最適反應(yīng)溫度35℃，酶活急劇下降，而突變體S437T與N130D/S437Y的最適反應(yīng)溫度可以達(dá)到45℃。組合突變體N130D/S437Y、N130D/G260Q即使達(dá)到55℃的高溫依然可以保持70%以上的活力，而此時(shí)野生型已經(jīng)失活。具有Ser437位置的突變體S437T與N130D/S437Y最適反應(yīng)溫度均提高了10℃，表明Ser437位置時(shí)影響最適反應(yīng)溫度的關(guān)鍵氨基酸。脂肪氧合酶目前在多個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，如在食品領(lǐng)域可使面粉增白，在造紙、染料、涂料、洗滌劑、污水處理、聚氯乙烯增塑劑的工業(yè)化生產(chǎn)，還可作為藥物合成的中間體，所以脂肪氧合酶也被用于其他工業(yè)催化用途，如利用脂肪氧合酶對(duì)脂肪酸或脂肪酸酯進(jìn)行選擇性催化，形成特定的氫過(guò)氧化脂肪酸及其酯的衍生物，再將之環(huán)氧化，生成環(huán)氧化油，則可減小石油用量；氫過(guò)氧化油脂經(jīng)還原得到羥基油脂，經(jīng)過(guò)氧化物酶裂解得到不飽和酸及醛，再進(jìn)一步反應(yīng)可以得到二元酸，這些物質(zhì)在食品、化工、生物技術(shù)等領(lǐng)域都有重要用途。因此，本發(fā)明提供的脂肪氧合酶突變體能夠在以上領(lǐng)域進(jìn)行更好的應(yīng)用。序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構(gòu)建方法<130>1<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶野生型氨基酸序列<400>1GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>2<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶N130D突變體氨基酸序列<400>2GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAspLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270 LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>3<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶G260A突變體氨基酸序列<400>3GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnAlaSerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>4<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶S437T突變體氨基酸序列<400>4GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysThrSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>5<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶N130D/G260Q突變體氨基酸序列<400>5GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAspLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlnSerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365 HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>6<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶N130D/S437Y突變體氨基酸序列<400>6GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAspLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysTyrSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列N130-f<220><221>misc_feature<222>(9)..(10)<223>nisa,c,g,ort<400>7ttactcacnnkctggcaaaatatgacatcaag32<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列N130-r<220><221>misc_feature<222>(10)..(11)<223>nisa,c,g,ort<400>8tttgccagmnngtgagtaagctcatgtg28<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列S437-f<220><221>misc_feature<222>(11)..(12)<223>nisa,c,g,ort<400>9ggaaaaatcannkatattggaaccaggacttc32<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列S437-r<220><221>misc_feature<222>(10)..(11)<223>nisa,c,g,ort<400>10tccaatatmnntgatttttcccgaatgagcg31<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列G260-f<220><221>misc_feature<222>(11)..(12)<223>nisa,c,g,ort<400>11gctaacgcagnnktctattgttgatgtaa29<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列G260-r<220><221>misc_feature<222>(11)..(12)<223>nisa,c,g,ort<400>12aacaatagamnnctgcgttagcatg25當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3