1.一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體,其特征在于,脂肪氧合酶突變體具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一種所示的氨基酸序列。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體中PCR反應(yīng)的簡(jiǎn)并引物,其特征在于,該簡(jiǎn)并引物具體如下:
N130-f:TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG;
N130-r:TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG;
S437-f:GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC;
S437-r:TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG;
G260-f:GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA;
G260-r:AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。
3.一種權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)魚腥藻脂肪氧合酶突變位點(diǎn)確定:將魚腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸作為飽和突變位點(diǎn);
(2)魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫(kù)的建立及突變體篩選:以重組質(zhì)粒為模板,在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸相對(duì)應(yīng)的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,該簡(jiǎn)并引物如權(quán)利要求2所述,進(jìn)行全質(zhì)粒PCR反應(yīng),構(gòu)建3個(gè)定點(diǎn)飽和突變庫(kù),DpnI消化模板,純化后產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌,將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有氨芐抗性LB平板上,37℃下培養(yǎng)16-24小時(shí),得到3個(gè)飽和突變庫(kù);
(3)取3個(gè)飽和突變庫(kù)的菌落接種于含有氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中,于37℃過(guò)夜培養(yǎng),得到3個(gè)突變體庫(kù)的母版,取母版接種于含有氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中,37℃下培養(yǎng)3h,再加入IPTG低溫誘導(dǎo)16h;然后裂解菌體,得到粗酶液,將粗酶液在50℃條件下孵育5min,冷卻,測(cè)定殘余活力,得到陽(yáng)性突變體;
(4)將步驟(3)得到的陽(yáng)性突變體接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,180 rpm 培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8 時(shí),加IPTG低溫誘導(dǎo),離心收集菌體,用磷酸鹽緩沖液重懸菌體,超聲波破碎菌體,將上清液過(guò)Ni-NTA親和柱純化,透析去除咪唑即得到純的脂肪氧合酶突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(2)中大腸桿菌為大腸桿菌E. coli BL21(DE3)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(2)中重組質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pET32a-Ana-LOX。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(2)中全質(zhì)粒PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為:96℃ 5 min;然后98℃ 10s,55℃ 5s,72℃ 90s,共25個(gè)循環(huán);最后72℃ 5 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(3)中裂解菌體采用凍融破碎的方法進(jìn)行,具體為-70℃冷凍2小時(shí),室溫融化1小時(shí),反復(fù)凍融。
8.權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶突變體在食品、制藥、造紙或污水處理中的應(yīng)用。