一種葡萄糖脫氫酶突變體及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號(hào)：12411589閱讀：207來源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄糖脫氫酶突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氧化還原酶被廣泛應(yīng)用于催化制備手性醇、羥基酸等藥物中間體，絕大多數(shù)氧化還原反應(yīng)都需要輔酶NAD(P)H的參與。因輔酶價(jià)格昂貴，穩(wěn)定性差、難以重復(fù)利用，嚴(yán)重限制了氧化還原酶的工業(yè)化應(yīng)用，構(gòu)建高效、經(jīng)濟(jì)的輔酶再生體系對(duì)于解除輔酶含量對(duì)反應(yīng)的限制、降低生產(chǎn)成本極為重要。

輔酶再生的方法可分為全細(xì)胞法、光化學(xué)法、化學(xué)法、電化學(xué)法和酶法等。酶法再生還原態(tài)輔酶由于對(duì)輔酶的選擇性及再生效率高，且再生系統(tǒng)與合成系統(tǒng)兼容性好，因而最受青睞。

葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH，EC 1.1.1.47)屬于短鏈醇脫氫酶家族，由4個(gè)相同的亞基組成，廣泛存在于原核與真核生物中。葡萄糖脫氫酶根據(jù)其所結(jié)合的輔酶可分為三種類型：吡咯喹啉醌依賴型、FAD依賴型及NAD(P)⁺依賴型。其中NAD(P)⁺依賴型葡萄糖脫氫酶可特異性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將NAD(P)⁺轉(zhuǎn)化為NAD(P)H，從而解決NADH以及更為昂貴的NADPH的再生問題。由于其對(duì)輔酶NAD(P)⁺的比活高，對(duì)還原性輔酶NAD(P)H的再生能力強(qiáng)，且既可用于NADH的再生，又可用于NADPH的再生，NAD(P)⁺依賴型葡萄糖脫氫酶得到了廣泛的應(yīng)用。該酶可從多種微生物如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)及巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)等中獲得。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種葡萄糖脫氫酶突變體。

本發(fā)明的另一目的是提供該葡萄糖脫氫酶突變體的制備方法。

本發(fā)明的又一目的是提供該葡萄糖脫氫酶突變體的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

葡萄糖脫氫酶突變體基因，其野生型基因其來源為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis T1(GenBank:KU682779.1)，根據(jù)易錯(cuò)PCR方法對(duì)其進(jìn)行突變，從而獲得該氨基轉(zhuǎn)移酶突變體目的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

一種葡萄糖脫氫酶突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的葡萄糖脫氫酶突變體基因的重組載體。其可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成，如質(zhì)粒pUC18，pUC19，pET系列等，更優(yōu)選地選自pET系列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒為pET-28a。

一種生產(chǎn)所述的葡萄糖脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本發(fā)明所述的葡萄糖脫氫酶突變體基因或本發(fā)明所述的重組載體。

所述基因工程菌的宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

所述基因工程菌優(yōu)選保藏號(hào)為CCTCC M 2016059的E.Coli G06，于2016年1月22日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明所述的葡萄糖脫氫酶突變體基因、所述的重組載體、所述的基因工程菌在制備葡萄糖脫氫酶中的應(yīng)用。

一種葡萄糖脫氫酶突變體的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)本發(fā)明所述的基因工程菌，獲得重組表達(dá)的葡萄糖脫氫酶突變體。

所述的方法，優(yōu)選包括在發(fā)酵條件下，制備所述葡萄糖脫氫酶的步驟。

本發(fā)明所述的葡萄糖脫氫酶突變體在氧化還原反應(yīng)中輔酶NADH以及NADPH的再生中的應(yīng)用。

有益效果：

本發(fā)明提供一種催化活性、pH及熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性較好的葡萄糖脫氫酶突變體，可用于氧化還原反應(yīng)中輔酶NADH以及NADPH的再生。

生物材料保藏信息

大腸桿菌G06Escherichia coli G06，已于2016年1月22日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO：M2016059。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1基因工程菌的建立

根據(jù)NCBI收錄的葡萄糖脫氫酶基因GDH(GenBank:KU682779.1)，人工合成該葡萄糖脫氫酶基因片段，以該基因片段為模版，通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)展該片段(片段兩側(cè)加NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶片段)其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因插入pET-28a質(zhì)粒中，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中建立葡萄糖脫氫酶基因工程菌。其中PCR擴(kuò)增葡萄糖脫氫酶基因的引物為：上游引物為F1:5'-GGGCCATATGATGGACATGT ATCCGGATT-3'(SEQ ID NO.4)，下游引物為R1:5'-GCGGGGATCCTTAGCGGCC TGCCTGGAA T-3'(SEQ ID NO.5)。

實(shí)施例2葡萄糖脫氫酶突變體基因的獲得

本研究利用易錯(cuò)PCR方法對(duì)葡萄糖脫氫酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造。

50μl PCR反應(yīng)體系為：10×擴(kuò)增緩沖液5μl，4種dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg²⁺2mmol/L，加雙蒸水至50μl。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；于72℃下繼續(xù)延伸5min，冷卻至4℃，結(jié)束反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)流程

化學(xué)合成葡萄糖脫氫酶基因并利用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因插入至pET-28a質(zhì)粒中，作為基因突變模板；易錯(cuò)PCR擴(kuò)增葡萄糖脫氫酶的基因，擴(kuò)增后基因片段鏈接至pET-28a載體，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中建立葡萄糖脫氫酶基因突變體庫；利用大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，pET-28a質(zhì)粒為載體，表達(dá)擴(kuò)展葡萄糖脫氫酶，高通量篩選高活性突變株；突變后對(duì)高活性葡萄糖脫氫酶基因進(jìn)行鑒定。篩選出的高活性葡萄糖脫氫酶突變體基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示的高活性葡萄糖脫氫酶突變體基因可以通過化學(xué)合成方式獲得。

葡萄糖脫氫酶基因的引物為：上游引物為F1:5'-GGGCCATATGATGGACATG TATCCGGATT-3'(SEQ ID NO.4)，下游引物為R1:5'-GCGGGGATCCTTAGCGGC CTGCCTGGAA T-3'(SEQ ID NO.5)。

按實(shí)施例1所述方法構(gòu)建表達(dá)該葡萄糖脫氫酶多肽突變體的基因工程菌，并將其命名為E.Coli G06，于2016年1月22日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2016059。

實(shí)施例3重組大腸桿菌的搖瓶培養(yǎng)

將實(shí)施例1、實(shí)施例2所得的重組大腸桿菌分別接種至裝有5mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，于37℃，200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)4-8小時(shí)。取1mL菌體培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有50mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmol/L，于22-26℃、200rpm誘導(dǎo)表達(dá)8-12小時(shí)后，離心(8000rpm，15min，4℃)收集菌體，并用磷酸緩沖液(pH7.5，10mmol/L)清洗兩次，分散于同樣的預(yù)冷的緩沖液中，于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎。離心(10000rpm，15min，4℃)，棄菌體碎片，得到葡萄糖脫氫酶及其突變體粗酶液。

實(shí)施例4葡萄糖脫氫酶活力的測(cè)定

將含有0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，2.0mmol/L NADP⁺和0.1mol/L D-葡萄糖的總體積為200μL的反應(yīng)體系于37℃保溫5min后，加入適量粗酶液，測(cè)定340nm處的吸光值。

酶活力定義：在上述條件下，每分鐘催化生成1μmol的NAD(P)H所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

重組葡萄糖脫氫酶突變體的比活為612.9U/mg，比突變之前提高了82％。

實(shí)施例5溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將重組葡萄糖脫氫酶分別加入不同溫度(20～70℃，溫度間隔5℃)的pH8.0磷酸鹽緩沖液中，保溫60min后于冰浴中冷卻，測(cè)定殘余酶活。殘余酶活為原始酶活的80％以上為穩(wěn)定，從而確定重組葡萄糖脫氫酶的溫度穩(wěn)定性。重組葡萄糖脫氫酶突變體的最適溫度為40℃，60℃下保溫60min后殘余酶活80％以上，說明該酶可在較高溫度下保持穩(wěn)定。

實(shí)施例6pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將重組葡萄糖脫氫酶突變體粗酶液分別加入不同pH(pH 4.0-10.5，pH間隔0.5)的緩沖液中，37℃保溫60min后于冰浴中冷卻，測(cè)定殘余酶活。殘余酶活為原始酶活的80％以上為穩(wěn)定，從而確定重組葡萄糖脫氫酶的pH穩(wěn)定性。

所用緩沖液為100mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0-6.0)，100mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0-8.0)，100mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.0-9.0)，100mmol/L硼酸-NaOH緩沖液(pH8.5-10.5)。

重組葡萄糖脫氫酶突變體的最適pH為8.0。pH7.5-8.5范圍內(nèi)，37℃保溫60min后殘余酶活80％以上。

實(shí)施例7有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

將重組葡萄糖脫氫酶突變體粗酶液與不同有機(jī)溶劑(叔丁醇，丙酮，丁烷，戊烷，異丙醇，石油醚，叔丁基醚，二甲基亞砜，異戊酸乙酯，戊酸乙酯，辛酸乙酯，丁酸乙酯，二甲基甲酰胺)等體積混合，于25℃、200r/min的搖床中振蕩60min，測(cè)定殘余酶活性。從而確定葡萄糖脫氫酶對(duì)不同有機(jī)溶劑的耐受性。

重組葡萄糖脫氫酶突變體在叔丁醇、丙酮、戊烷、石油醚及丁烷中放置60min后，酶活仍保持90％以上；在叔丁基醚、二甲基亞砜和異戊酸乙酯中的殘留酶活力都在50％以上；在戊酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯及二甲基甲酰胺中的殘留酶活分別為52.1％、60.2％、28.2％、34.5％，說明該酶對(duì)部分有機(jī)溶劑具有耐受性。

實(shí)施例8葡萄糖脫氫酶的發(fā)酵制備

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：蛋白胨18g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，NH₄Cl 3.8g/L，Na₂HPO₄·7H₂O 12.0g/L，KH₂PO₄ 2.8g/L，NaCl 0.4g/L，MgSO₄ 0.3g/L，EDTA1.9g/L，CaCl·2H₂O 2g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 1.1g/L，CuSO₄·5H₂O 0.5g/L，MnCl·4H₂O1.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5g/L。將種子液按8％的接種量加入含有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，發(fā)酵液通過加入氨水維持pH 7.2-7.5，罐溫37℃，攪拌轉(zhuǎn)速600rpm，發(fā)酵過程中控制DO35％以上，空氣流量1:1.5vvm。發(fā)酵10小時(shí)后加入終濃度為1mmol/L的IPTG以誘導(dǎo)葡萄糖脫氫酶的表達(dá)，此后繼續(xù)發(fā)酵12-18小時(shí)，罐溫30℃。發(fā)酵過程中通過加入含葡萄糖800g/L，NaCl 3g/L，MgSO₄4.5g/L，EDTA 0.1g/L的溶液維持培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)物冷卻至4℃保存。

將保存的發(fā)酵液經(jīng)離心、細(xì)胞破碎、冷凍干燥等常規(guī)處理，制備得到葡萄糖脫氫酶多肽凍干粉并于-80℃保存。

實(shí)施例9重組酮還原酶催化5R-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的不對(duì)稱還原

在5000L反應(yīng)釜中，加入5R-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯(化合物1)的水溶液(氰基含量1.95kmol)，NADPNa₂ 20kg，葡萄糖脫氫酶(1×10⁷U)12.8kg，葡萄糖60kg，異丙醇50L，控制溫度在35-36℃，并用硫酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至6.0-7.0，之后向釜內(nèi)投加重組酮還原酶凍干粉(按照201210327416.5實(shí)施例2和5制備)(1×10⁷U)12.8kg，攪拌反應(yīng)38小時(shí)。至底物含量降至1％以下時(shí)終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后經(jīng)脫色、離心、萃取等操作，得到產(chǎn)物(3R，5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯(化合物1)(¹H-NMR(CDCl₃,400MHz/ppm)；1.47(9H,s),1.72(2H,dd),2.43(2H,dd),2.55(2H,dd),3.96(1H,dd),4.21(1H,bt),4.23-4.34(1H,m),4.25(1H,bs)；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz/ppm)；25.8,28.1,40.8,41.9,67.9,68.7,82.1,117.4,172.1)。經(jīng)氣相色譜分析，確定底物轉(zhuǎn)化率96.8％，還原產(chǎn)物的ee99.5％。

產(chǎn)物ee值的具體分析條件為：色譜柱為CP-Chirasil-DEX CB手性毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器。色譜柱溫度120℃，氣化和檢測(cè)溫度均為280℃，載氣為N₂。

<110> 江蘇阿爾法藥業(yè)有限公司

<120> 一種葡萄糖脫氫酶突變體及其制備方法和應(yīng)用

<160> 5

<210> 1

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖脫氫酶突變體基因

<400> 1

atggacatgt atccggattt atataaagga aaagtcgtcg ctattacagg agctgctaca 60

gggctcggaa aggcgatggc cattcgcttc ggcaaggagc aggcaaaagt ggttatcaac 120

tattatagta ataaacaaga tccgaacgag gtaaaagaag aggtcatcaa ggcgggcggt 180

gaagctgttg tcgtccaagg agatgtcacg aaagaggaag atgtaaaaaa tatcgtgcaa 240

acggcaatta aggagttcgg cacactcgat attatgatta ataatgccgg tcttgaaaat 300

cctgtgccat ctcacgaaat gccgctcaag gattgggata aagtcatcgg cacgaactta 360

acgggtgcct ttttaggaag ccgtgaagcg attaaatatt tcgtagaaaa cgatatcaag 420

ggaaatgtca ttaacatgtc cagtgtgcac gaagtgattc cttggccgtt atttgtccac 480

tatgcggcaa gtaaaggcgg gataaagaaa atgacagaaa cattagcgtt ggaatacgcg 540

ccgaagggca ttcgcgtcaa taatattggg ccaggtgcga tcaacacgcc aatcaatgct 600

gaaaaattcg ctgaccctaa acagaaagct gatgtagaaa gcatgattcc aatgggatat 660

atcggcgaac cggaggagat cgccgcagta gcagcctggc ttgagtcgaa ggaagccagc 720

tacgtcacag gcatcacgtt attcgcggac ggcttaatga cacaatatcc ttcattccag 780

gcaggccgct aa 792

<210> 2

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖脫氫酶突變體

<400> 2

Met Asp Met Tyr Pro Asp Leu Tyr Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr

5 10 15

Gly Ala Ala Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys

20 25 30

Glu Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro

35 40 45

Asn Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val

50 55 60

Val Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln

65 70 75 80

Thr Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala

85 90 95

Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp

100 105 110

Asp Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg

115 120 125

Glu Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile

130 135 140

Asn Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His

145 150 155 160

Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Lys Met Thr Glu Thr Leu Ala

165 170 175

Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly

180 185 190

Ala Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln

195 200 205

Lys Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro

210 215 220

Glu Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Glu Ser Lys Glu Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Leu Met Thr Gln Tyr

245 250 255

Pro Ser Phe Gln Ala Gly Arg

260

<210> 3

<211> 792

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis strain T1

<220>

<223> 野生型葡萄糖脫氫酶編碼基因

<400> 3