本發(fā)明涉及一種催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脫氫酶突變體，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

葡萄糖脫氫酶能以NAD(P)⁺作為輔因子催化葡萄糖生成葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯，它在工業(yè)上被廣泛用于血糖測(cè)定的檢測(cè)試劑盒和生物傳感器。此外，在氧化還原酶催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)中葡萄糖脫氫酶被廣泛用于輔酶循環(huán)，如(R)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)后高效催化2-羥基苯乙酮制備(R)-苯基乙二醇。目前，葡萄糖制備的主要原料有玉米，甘薯。但是糧食作物生產(chǎn)成本高，為了節(jié)約糧食，也為了實(shí)現(xiàn)我國的可持續(xù)發(fā)展，利用可再生的木質(zhì)纖維素資源進(jìn)行生化藥劑的生產(chǎn)逐漸引起社會(huì)的關(guān)注。

纖維素類物質(zhì)主要包括纖維素，半纖維素和木質(zhì)素三種成分。將半纖維素酸解或酶解后可獲得90％的D-木糖，然而工業(yè)生產(chǎn)中的微生物不能有效地利用木糖。因此，高效利用木糖是利用植物纖維素類資源解決人類資源、環(huán)境之間的矛盾，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵之一?；谶@些前提，篩選新的酶或者通過理性設(shè)計(jì)改造現(xiàn)有的氧化還原酶使其可以高效催化木糖就顯得十分必要。

葡萄糖脫氫酶是短鏈脫氫酶家族的一員。目前短鏈脫氫酶家族包括47000多條基因和蛋白序列，其中有超過300個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析并儲(chǔ)存在PDB數(shù)據(jù)庫中。雖然大多數(shù)短鏈脫氫酶的序列相似性只有20％-30％，但是它們共享相似的三維立體結(jié)構(gòu)。短鏈脫氫酶家族的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)與輔酶NAD(P)⁺結(jié)合的羅斯曼折疊和一個(gè)由Ser-Tyr-Lys組成的活性催化三角，這些結(jié)構(gòu)信息都有助于對(duì)其進(jìn)行理性改造以改變酶的催化功能。

發(fā)明人之前篩選到一種來自Bacillus sp.YX-1的具有良好有機(jī)溶劑耐受性的葡萄糖脫氫酶(BsGDH)，它在不對(duì)稱反應(yīng)中常以葡萄糖作為底物進(jìn)行輔酶的循環(huán)再生。但是其催化木糖的比酶活還有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明基于同源序列比對(duì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析在BsGDH底物結(jié)合域附近設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變，提高BsGDH對(duì)木糖的酶活力。本發(fā)明的突變酶A258F對(duì)木糖的酶活力相較于野生型提高了4倍，可利用木糖作為輔助底物進(jìn)行不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的輔酶循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)木糖的有效利用。本發(fā)明方法解決了木糖資源不能有效利用的問題，有助于對(duì)豐富、廉價(jià)的植物纖維素類資源的合理利用，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。

本發(fā)明的目的是提供一種葡萄糖脫氫酶突變體，所述突變體的氨基酸序列是：

(1)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上將第258位的氨基酸進(jìn)行突變；或者，

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的氨基酸序列雜交且編碼具有葡萄糖脫氫酶活性的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的序列。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述將第258位的氨基酸進(jìn)行突變，是突變成苯丙氨酸(A258F)、組氨酸(A258H)、色氨酸(A258W)或者酪氨酸(A258Y)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述突變體的核苷酸片段。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有編碼所述突變體的基因的載體。

在一種實(shí)施方式中，所述載體為pET載體或者PMD19-T載體。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種能利用木糖的重組菌，所述重組菌表達(dá)本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶突變體。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌可以是以大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母為宿主構(gòu)建得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌是以大腸桿菌為宿主構(gòu)建得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌是以大腸桿菌為宿主、pET-28a為載體構(gòu)建得到的。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述突變體、編碼所述突變體的核苷酸片段、含有編碼所述突變體的基因的載體、表達(dá)所述突變體的基因工程菌(尤其是大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌)在食品、化工或紡織領(lǐng)域的應(yīng)用。

在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是用于催化木糖。

本發(fā)明的突變體命名方式：

采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示突變體。如A258F，表示位置258的氨基酸由親本葡萄糖脫氫酶的丙氨酸Ala替換成苯丙氨酸Phe，位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于親本葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列的相應(yīng)位點(diǎn)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明成功構(gòu)建含有目的基因的重組菌株BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)誘導(dǎo)表達(dá)出突變酶A258F，粗酶液經(jīng)His-Trap親和層析柱純化后得到純酶A258F。通過優(yōu)化酶活測(cè)定條件，A258F在pH7.0的磷酸鉀緩沖液中于55℃中有高達(dá)7.59U·mg^-1的比酶活。這些工作為葡萄糖脫氫酶用于不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的輔酶循環(huán)提供了新的底物，解決了木糖資源不能有效利用的問題，有助于降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)中木糖利用提供了優(yōu)良菌種，為基因工程法改造酶的底物特異性奠定了基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方案

下面是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1：表達(dá)突變體A258F的重組菌的構(gòu)建

一、質(zhì)粒pET-GDH的獲得

重組E.coli BL21(DE3)/pET-GDH的培養(yǎng)基組成為：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％。

將重組菌接種于培養(yǎng)基裝液量為5mL試管中于37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)8h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體于12,000rpm下離心1min并收集細(xì)胞，利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pET-GDH；其中質(zhì)粒pET-GDH中的葡萄糖脫氫酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)。

二、重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)的構(gòu)建

(1)A258F全長基因的獲得：

合成兩端引物(序列分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示)：

A258F-f：5’-CGGCTAGCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCG-3’(Nhe I)，

A258F-r：5’-CCTCGAGTTAACCGCGGCCAAACTGGAATGACG-3’(Xho I)。

采用PCR的方法，將突變引入，具體方法如下：

PCR反應(yīng)體系：ddH₂O 22μL，Premix PrimeSTAR 25μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，質(zhì)粒DNA 1μL。

PCR反應(yīng)：98℃預(yù)變性30s；98℃10s，60℃15s，72℃60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。以pET-GDH為模板，以引物A258F-f和A258F-r進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得突變的全長基因。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。

純化后的基因PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體通過TA互補(bǔ)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒T-GDH(A258F)用雙酶切、PCR及上海生工測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

(2)重組質(zhì)粒pET-GDH(A258F)的獲得：

基因GDH(A258F)及pET-28a的酶切：

利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒T-GDH(A258F)和pET-28a。

按照水、緩沖液、質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37℃金屬浴1h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5℃保溫10min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收并濃縮。

反應(yīng)體系組成：10×Buffer H 4μL，DNA 10μL，Nhe I 2μL，XhoI 2μL，ddH₂O將體系補(bǔ)足40μL。

基因GDH(A258F)與質(zhì)粒pET-28a的連接

反應(yīng)體系組成如下：質(zhì)粒pET-28a 0.8μL，基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，將混合連接液置于16℃培養(yǎng)箱中連接12-16h。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109

在每管的100μL E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中冷卻3min。每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液3,000rpm離心2min，棄上清700μL，剩余菌液混勻后涂布到含有50μg·mL^-1硫酸卡娜霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

陽性克隆的選擇：

挑取4個(gè)克隆，轉(zhuǎn)接入裝有5mL的含有50μg·mL^-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h，利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒。用以下反應(yīng)體系進(jìn)行酶切驗(yàn)證：10×Buffer H 2μL，DNA 5μL，Nhe I 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH₂O將體系補(bǔ)足20μL。獲得陽性質(zhì)粒pET-GDH(A258F)。

(3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)：

在每管100μL E.coli RIL感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻3min。每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液3,000rpm離心2min，棄上清700μL，剩余菌液混勻后涂布到含有50μg·mL^-1硫酸卡娜霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

陽性克隆的選擇：

挑取4個(gè)克隆，轉(zhuǎn)接入裝有5mL的含有50μg·mL^-1硫酸卡娜霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h，利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒。用以下反應(yīng)體系進(jìn)行酶切驗(yàn)證：10×Buffer H 2μL，質(zhì)粒DNA 5μL，Nhe I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH₂O將體系補(bǔ)足20μL。獲得陽性克隆E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。驗(yàn)證正確的E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)，表達(dá)的葡萄糖脫氫酶GDH的氨基酸序列，相對(duì)于SEQ ID NO:1所示的序列，第258位的丙氨酸A突變成了苯丙氨酸F。

實(shí)施例2：重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要時(shí)使用前加入硫酸卡那霉素(50μg·mL^-1)，固體培養(yǎng)基添加1.5％瓊脂粉。

挑取陽性克隆單菌落接種于10mL含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于1L含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀約為1.0。向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.1mM的異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。

實(shí)施例3：重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)

誘導(dǎo)表達(dá)：LB培養(yǎng)基組成同實(shí)施例2，挑取陽性克隆單菌落接種于10mL含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。保藏甘油菌兩支(每支含有1mL菌液，15％的甘油)，同時(shí)取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀約為1.0。向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.1mM的異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。收集菌體，溶解于20mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中，超聲破碎20min，工作時(shí)間1s，間歇時(shí)間3s。將破碎后的菌體12,000rpm，40min。分別取上清和沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)。

實(shí)施例4：重組蛋白A258F的純化

利用His-Trap HP affinity column純化重組蛋白A258F：

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要時(shí)使用前加入硫酸卡那霉素(50μg·mL^-1)，固體培養(yǎng)基添加1.5％瓊脂粉。

挑取陽性克隆單菌落接種于10mL含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于1L含50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀約為1.0。向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷0.1mM，在培養(yǎng)溫度37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞6,000rpm離心10min并用生理鹽水洗滌三次后收集。

稱取2g濕菌體，加入適量0.1mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液懸浮細(xì)胞，于冰浴中進(jìn)行超聲破碎(工作1s，間隔3s，工作時(shí)間5min)。4℃條件下12,000rpm離心30min收集上清液作為粗酶液。利用GE公司生產(chǎn)的His-Trap親和層析對(duì)粗酶液進(jìn)行純化，純酶液超濾脫鹽后用于酶活測(cè)定。

實(shí)施例5：突變前后比酶活測(cè)定

A258F酶活力的測(cè)定：

根據(jù)β-D-葡萄糖+NADP⁺→D-葡萄糖-δ-內(nèi)酯+NADPH，NADPH的生成會(huì)引起340nm處吸光值的升高，因此可以通過測(cè)定反應(yīng)過程中340nm處的吸光值的變化來衡量葡萄糖脫氫酶的活力。

酶活測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)條件：總反應(yīng)體積100μL，分別加入0.1M醋酸緩沖液(pH4.5～6.5)或0.1M磷酸鉀緩沖液(pH 7.0～7.5)或0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0～9.0)，2.0mM NADP⁺，0.1M D-木糖，30℃保溫2min，加入適量純酶液后開始掃描340nm處吸光值的變化。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法，以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)品。酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘催化生成1μmol的NADPH的酶量定義為一個(gè)單位U。

酶活的計(jì)算公式為：酶活(U)＝EW×V×10³/(6220×0.3)

比活的計(jì)算公式：比活(U·mg^-1)＝酶活(U)/蛋白量(mg)

其中，EW：1min內(nèi)340nm處吸光度的變化；V：反應(yīng)液的體積(mL)；6220：摩爾消光系數(shù)(L mol^-1cm^-1)；0.3：光程距離(cm)。

結(jié)果顯示，不同pH的緩沖液下計(jì)算得到的A258F的比酶活如表1所示。

表1突變前后的葡萄糖脫氫酶在不同pH的緩沖液下的比酶活

注：本發(fā)明的野生酶BsGDH即為氨基酸序列如SEQ ID NO:1的葡萄糖脫氫酶。

實(shí)施例6：突變前后動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

根據(jù)β-D-葡萄糖+NADP⁺→D-葡萄糖-δ-內(nèi)酯+NADPH，NADPH的生成會(huì)引起340nm處吸光值的升高，因此可以通過測(cè)定反應(yīng)過程中340nm處的吸光值的變化來衡量葡萄糖脫氫酶的活力。為了研究酶對(duì)底物木糖的親和力，在2.0mM NADP⁺條件下，分別測(cè)定不同木糖濃度(0.5mM-10mM)下的最初反應(yīng)速率。

根據(jù)米氏方程v＝V_max×[S]/K_m+[S]，計(jì)算出酶對(duì)不同輔酶的K_m值。

其中，v：反應(yīng)速率(U/mg·60s)；V_max：最大反應(yīng)速率(U/mg·60s)；[S]：底物濃度(mmol/L)；K_m：反應(yīng)速度v達(dá)到一半1/2V_max時(shí)的底物濃度(mmol/L)。

當(dāng)?shù)孜餄舛蕊柡蜁r(shí)，V_max＝K_cat/[E]，計(jì)算出K_cat值。

其中，V_max：最大反應(yīng)速率(U/mg·60s)；[E]：飽和底物濃度(mmol/L)。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：總反應(yīng)體積100μL，加入0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)，2.0mM NADP⁺，溫度55℃保溫2min，加入適量純酶液測(cè)定不同木糖濃度(0.5mM-10mM)下的最初反應(yīng)速率。計(jì)算出A258F的k_cat為17.3s^-1；K_m為14.7mM；k_cat/K_m為1.17s^-1·mM^-1；而野生型的k_cat為6.6s^-1；K_m為44.0mM；k_cat/K_m為0.15s^-1·mM^-1。

此外，發(fā)明人還構(gòu)建了突變體A258H、A258W、A258Y、K207A、E220K、Q252K等，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)340nm處的吸光值變化的方法測(cè)定了比酶活，并測(cè)定了動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表2、表3所示。表2是在最佳條件磷酸鉀pH7.0，55℃條件下測(cè)定得到的比酶活結(jié)果。

表2不同突變體的比酶活比較

表3野生型及突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脫氫酶突變體

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ser

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Lys Glu Ala Gln Thr Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Gln Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Ile Ile Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Val

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu

85 90 95

Asn Pro Val Glu Ser His Lys Met Pro Leu Lys Asp Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Cys Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Tyr Val Glu Asn Asp Ile Gln Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Arg Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Lys Lys Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Val Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 2

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gccattacag gagcatcatc aggattagga 60

agagcgatgg cgatccgctt cgggcaggag caggcgaaag tcgtgattaa ctactacagt 120

aatgaaaaag aggctcaaac cgtaaaagaa gaagttcaaa aagcgggcgg cgaagcggtc 180

attattcaag gtgacgttac aaaagaagag gatgtcaaaa acattgtgca gaccgcggtc 240

aaggaattcg gcacattaga tatcatgatc aacaacgccg gcatggaaaa tccggtcgag 300

tcgcataaaa tgccgctaaa agactggaac aaagtcatca acaccaacct gaccggcgct 360

tttctgggat gccgcgaagc cattaaatat tacgtagaga atgatattca aggaaacgtc 420

attaacatgt cgagcgtaca tgaaatgatt ccgtggccgc tgtttgtcca ctatgcggca 480

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atccgtgtta acaatatcgg gccgggcgcc atcaatacgc cgatcaatgc ggaaaagttt 600

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ccggaagaaa tcgcggctgt cgccgtctgg cttgcttcaa aggaatcaag ctacgtgacc 720

ggcattacgc tgtttgctga cggcggaatg acacaatatc cgtcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggctagcat gtatccggat ttaaaaggaa aagtcg 36

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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