本發(fā)明克隆表達(dá)了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習(xí)慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學(xué)純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)
目前為止，已經(jīng)在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發(fā)現(xiàn)了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本發(fā)明首次從水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)中克隆表達(dá)出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應(yīng)與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應(yīng)相比逆反應(yīng)極微弱，可應(yīng)用于光學(xué)純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明從水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性，并進(jìn)行了應(yīng)用研究。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1、菌株
本發(fā)明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Rahnella aquatilis ATCC 33071，購自美國ATCC菌種庫。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Rahnella aquatilis ATCC 33071菌體基因組總DNA。設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。
3、D-乳酸氧化酶表達(dá)與純化
將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。
4、D-乳酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
以D-乳酸為底物研究pH對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。
以D-乳酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。
D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。
酶活測定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進(jìn)行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯
拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應(yīng)的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。
產(chǎn)物(S)-α-羥酸酯的光學(xué)純度通過對映體過量值(％e.e)來評價(jià)：
對映體過量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR為反應(yīng)后(R)-對映體的峰面積，SS為反應(yīng)后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S0為反應(yīng)前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。
產(chǎn)物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進(jìn)樣量20μL。
所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細(xì)辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細(xì)辛醇酯、對羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯。
所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本發(fā)表明的有益之處：從Rahnella aquatilis ATCC 33071中克隆表達(dá)出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規(guī)?；苽涫中约?S)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。
1、Rahnella aquatilis ATCC 33071 DNA的提取
將Rahnella aquatilis ATCC 33071菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。
2、大腸桿菌感受態(tài)制備
(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。
(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.6(約2～3h)。
(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。
(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。
(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個(gè)離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)引物序列為：
引物1：5'GCCGGGATCCTGGATAATCAGTCACTCATCGCC 3'
引物2：5'GCCGTCTAGATCAATCATGCCAGTTTTTCAACTTA 3'
(2)PCR擴(kuò)增
用以上合成的兩條引物，以Rahnella aquatilis ATCC 33071的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
本步驟中擴(kuò)增體系為：
擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應(yīng)30個(gè)循環(huán)
72℃，10min
PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)雙酶切和連接
將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。
(4)轉(zhuǎn)化
步驟：
1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。
2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。
5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。
6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2
本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。
1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進(jìn)行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進(jìn)行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。
實(shí)施例3
本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為4.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為45℃。
實(shí)施例4
本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，45℃水浴15min測定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 4.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
實(shí)施例5
本實(shí)施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應(yīng)特性，列于表2中。
表2 D-乳酸氧化酶對不同底物的活性
實(shí)施例6
根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：
表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果
由上表可以看出，當(dāng)在反應(yīng)時(shí)間充分時(shí)，可以得到各類高光學(xué)純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學(xué)專一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大學(xué)
<120> 一種氧化酶及其應(yīng)用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> Rahnella aquatilis ATCC 33071
<400> 1
atggataatc agtcactcat cgccacgctg aaagagattg ccggcagtcg ccacgtttta 60
accggcgaca gcaacactga acgttaccgc aaagggttcc gatccggtgg cggcaaagcg 120
ctggcggtgg tatttccgca aacgctgctg cagcaatggc aattgctcaa ggcctgtatc 180
gccgccgaca aaattgtcat tatgcaggcc gccaataccg ggctgaccga aggttcgacg 240
cccagcggtg acgactatga ccgcgacatt gtgattttca gcacgctgaa actagacaca 300
atccagttac tcgacggcgg ccatcaggtg atcggctttc ccggcagcac cctttataag 360
ctggaaaaaa tcctcaagcc ctacaaccgc gagccccatt cggtgattgg ctcatcctgt 420
atcggcgcat cggtggtcgg cgggatctgt aataattccg gcggttcgct ggtgaaacgt 480
ggcccggcgt ataccgaaat ggcactgtac gcacagattg atgcgcaagg tgagttacag 540
ctgattaatc atctgggtat taatcttggc gaaacgccgg aagaaatcct gacacgtctg 600
gaaaaaggcg attatctgga aaccgatatc cagcatgatc agcgtctggc gtcagatcac 660
gattatgcct cgcgtgtccg cgaagtggat gctgatacgc cgtcacgttt caacgccgat 720
cagcgacgtt tatttgaagc ctcgggttgt gcgggtaagc tggccgtttt cgccgtgcgg 780
ctggatacct tcccggcaga aacgcagcag caggtttttt acatcggcac caacgatact 840
gcggtgctga cagaattacg tcgtcagatc ctgcgtgatt tcgctaacct tccggttgcc 900
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ctgatgatcg acaaacttgg caccgacaag atgccggata tgtttactgc caaaggaaag 1020
ttcgatgcac acgccagtaa ggtccctttc ctgcctaaaa atttcagtga ccgcgtgatg 1080
caatgcctga gcaaagcttt gccgaatcat ctgccgccgc ggatgaaaca gtaccgcgac 1140
cggtttgaac atcacttatt gctgaaaatg tccggccccg gcattgacga agcccgaact 1200
tttttgacgc gtttctttag tgagggtcag ggtgatttct ttatctgttc cgccgatgaa 1260
ggcaagaaag ccttcctgca ccgcttcgct gccgccggtg cggccgtgcg ttatcacgcg 1320
gtacatgaaa aagaagtgga agatattctg gcactggata tcgcactgcg ccgcaatgac 1380
cgtgactggt tcgaaacttt gccggaagat atcgataatc agctggtggc aaaactgtat 1440
tacggccatt tcatgtgcca cgttttccat caggattaca tcgtcaaaaa aggcgcaaac 1500
agtaaggcgc tgaaacacag aatgttagaa ctgctcgatg ccaaaggcgc ggaatatccc 1560
gccgaacata acgtcggcca tttgtatctg gcgaaaccgc atctgaaaga attctaccgg 1620
caggccgacc cgaccaacag cttcaatccg gggatcggga aaaccagtaa gttgaaaaac 1680
tggcatgatt ga 1692
<210> 2
<211> 563
<212> PRT
<213> Rahnella aquatilis ATCC 33071
<400> 2
Met Asp Asn Gln Ser Leu Ile Ala Thr Leu Lys Glu Ile Ala Gly Ser
1 5 10 15
Arg His Val Leu Thr Gly Asp Ser Asn Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gly
20 25 30
Phe Arg Ser Gly Gly Gly Lys Ala Leu Ala Val Val Phe Pro Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Gln Gln Trp Gln Leu Leu Lys Ala Cys Ile Ala Ala Asp Lys
50 55 60
Ile Val Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly Leu Thr Glu Gly Ser Thr
65 70 75 80
Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Asp Arg Asp Ile Val Ile Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Leu Asp Thr Ile Gln Leu Leu Asp Gly Gly His Gln Val Ile Gly
100 105 110
Phe Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Lys Leu Glu Lys Ile Leu Lys Pro Tyr
115 120 125
Asn Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala Ser
130 135 140
Val Val Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser Leu Val Lys Arg
145 150 155 160
Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Met Ala Leu Tyr Ala Gln Ile Asp Ala Gln
165 170 175
Gly Glu Leu Gln Leu Ile Asn His Leu Gly Ile Asn Leu Gly Glu Thr
180 185 190
Pro Glu Glu Ile Leu Thr Arg Leu Glu Lys Gly Asp Tyr Leu Glu Thr
195 200 205
Asp Ile Gln His Asp Gln Arg Leu Ala Ser Asp His Asp Tyr Ala Ser
210 215 220
Arg Val Arg Glu Val Asp Ala Asp Thr Pro Ser Arg Phe Asn Ala Asp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Cys Ala Gly Lys Leu Ala Val
245 250 255
Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala Glu Thr Gln Gln Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asp Thr Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Arg
275 280 285
Gln Ile Leu Arg Asp Phe Ala Asn Leu Pro Val Ala Gly Glu Tyr Met
290 295 300
His Arg Asp Ile Phe Asp Ile Thr Glu Val Tyr Gly Lys Asp Thr Phe
305 310 315 320
Leu Met Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys Met Pro Asp Met Phe Thr
325 330 335
Ala Lys Gly Lys Phe Asp Ala His Ala Ser Lys Val Pro Phe Leu Pro
340 345 350
Lys Asn Phe Ser Asp Arg Val Met Gln Cys Leu Ser Lys Ala Leu Pro
355 360 365
Asn His Leu Pro Pro Arg Met Lys Gln Tyr Arg Asp Arg Phe Glu His
370 375 380
His Leu Leu Leu Lys Met Ser Gly Pro Gly Ile Asp Glu Ala Arg Thr
385 390 395 400
Phe Leu Thr Arg Phe Phe Ser Glu Gly Gln Gly Asp Phe Phe Ile Cys
405 410 415
Ser Ala Asp Glu Gly Lys Lys Ala Phe Leu His Arg Phe Ala Ala Ala
420 425 430
Gly Ala Ala Val Arg Tyr His Ala Val His Glu Lys Glu Val Glu Asp
435 440 445
Ile Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg Asn Asp Arg Asp Trp Phe
450 455 460
Glu Thr Leu Pro Glu Asp Ile Asp Asn Gln Leu Val Ala Lys Leu Tyr
465 470 475 480
Tyr Gly His Phe Met Cys His Val Phe His Gln Asp Tyr Ile Val Lys
485 490 495
Lys Gly Ala Asn Ser Lys Ala Leu Lys His Arg Met Leu Glu Leu Leu
500 505 510
Asp Ala Lys Gly Ala Glu Tyr Pro Ala Glu His Asn Val Gly His Leu
515 520 525
Tyr Leu Ala Lys Pro His Leu Lys Glu Phe Tyr Arg Gln Ala Asp Pro
530 535 540
Thr Asn Ser Phe Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser Lys Leu Lys Asn
545 550 555 560
Trp His Asp