本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵產(chǎn)物領(lǐng)域，特別地，涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其胞外多糖的制備方法。

背景技術(shù)：

胞外多糖是一類由微生物合成及分泌到環(huán)境中的天然高分子物質(zhì)，由多個單糖分子脫水聚合，以各種形式的糖苷鍵連接而成，可形成直鏈或有分支的長鏈結(jié)構(gòu)。微生物胞外多糖本身的作用是創(chuàng)造微生物的適宜生存環(huán)境。它參與形成微生物的胞外基質(zhì)，是微生物細胞附著在環(huán)境界面(如沙土、巖石或植物的表面)上的介質(zhì)，形成微生物被膜(biofilm)，使之獲得一個相對穩(wěn)定的生存環(huán)境。此外，胞外多糖也是微生物儲存營養(yǎng)物質(zhì)的一種方式。隨著科學技術(shù)的進步，有越來越多種類的胞外多糖得到了發(fā)現(xiàn)和鑒定。胞外多糖的豐富多樣性，使之具有了各種各樣的用途。隨著人們不斷的分離、鑒定和使用胞外多糖，胞外多糖在醫(yī)藥、食品、材料、化妝品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了各種方式的利用。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，多種胞外多糖被開發(fā)為藥物、疫苗、疫苗佐劑等制品。

目前得到廣泛開發(fā)利用的細菌胞外多糖有：黃原膠(Xanthan gum)、結(jié)冷膠(Gellan gum)、熱凝多糖(Curdlan)等細菌胞外多糖作為工業(yè)增稠劑和乳化劑，已經(jīng)廣泛在食品、飼料、化工等行業(yè)使用；左旋糖苷，因其無毒、無刺激性、無抗原性和可代謝性，已用作血漿擴容劑；乳酸桿菌胞外多糖是良好的食品增稠劑和風味調(diào)節(jié)劑、同時可作為益生元，調(diào)劑腸道菌群化妝品領(lǐng)域：透明質(zhì)酸等具有良好的保濕、抗氧化和附膜能力，作為優(yōu)良的化妝品添加劑，可用于各種洗發(fā)護發(fā)用品、化妝品中；在新材料領(lǐng)域：一些胞外多糖在特殊工藝條件下，可以制備成可降解生物薄膜和塑件，可作為塑料的環(huán)保替代品。

然而，目前我國已投入工業(yè)化生產(chǎn)的微生物胞外多糖品種并不豐富，產(chǎn)量也不能滿足我國市場需求。因此亟待大力開展具備優(yōu)良產(chǎn)糖性能的菌株的篩選鑒定工作，開發(fā)出更多具備工業(yè)化生產(chǎn)潛力的微生物菌種，加速我國胞外多糖產(chǎn)業(yè)的提升與發(fā)展。

本發(fā)明涉及一株具備產(chǎn)胞外多糖特性的解淀粉芽孢桿(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99。通過研究發(fā)現(xiàn)，EZ99菌株在含有特定成分的固體培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生膠質(zhì)狀、半透明質(zhì)地的菌落，而在一般成分培養(yǎng)基上則產(chǎn)生密實、不透明的乳白色菌落。發(fā)明人進而對此種膠質(zhì)半透膜菌落的化學成分進行了化學分析，發(fā)現(xiàn)菌落中含有大量的多糖。在產(chǎn)多糖液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)后，菌液中也富集了大量多糖。采取離心、醇沉等步驟后，獲得該多糖的粗提取物。經(jīng)過進一步對液體培養(yǎng)基菌體成分進行分析，發(fā)現(xiàn)菌體中不含相同的成分，因此推斷出培養(yǎng)液中多糖成分為該細菌產(chǎn)生的胞外多糖，而非細菌自身結(jié)構(gòu)多糖。該胞外多糖經(jīng)分離純化可以拆分為四個多糖組分，分別具有不同特性和用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株具有較高胞外多糖產(chǎn)量的解淀粉芽孢桿菌。

本發(fā)明所提供的解淀粉芽孢桿菌EZ99菌株，已于2015年10月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No.13267。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99CGMCC No.13267分離自蘭州市七里河區(qū)西果園鄉(xiāng)蘭州百合種植地根際土壤中。在MS培養(yǎng)基上，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99CGMCC No.13267的菌落為淡乳白色半透明濕潤狀，有放射狀皺褶，直徑約0.5-1.5mm。個體形態(tài)為不規(guī)則G+芽孢桿菌，呈現(xiàn)桿狀，均是解淀粉芽孢桿菌特有的形態(tài)。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌胞外多糖及其生產(chǎn)、分離和純化的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌胞外多糖的方法，是發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99CGMCC No.13267得到的胞外多糖。

一種解淀粉芽孢桿菌胞外多糖的制備方法，包括以下方法：

A、菌種分離鑒定及保藏；

B、胞外多糖的培養(yǎng)基配制及發(fā)酵；

C、粗制胞外多糖的制備；

D、精制胞外多糖的制備；

E、胞外多糖各組分的分離純化；

F、多糖各組分的分子量測定；

G、多糖各組分的單糖成分鑒定。

用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99CGMCC No.13267的培養(yǎng)基中的碳源和氮源分別為蔗糖和酵母提取物，用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99CGMCC No.13267的培養(yǎng)基中的無機鹽含有MnSO₄。

用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99CGMCC No.13267的培養(yǎng)基優(yōu)選由下述成分組成(g/L)：蔗糖80-125，酵母膏3.5-6，蛋白胨8-12，(NH4)₂SO₄2.5-4，NaCl 2-4，MgSO₄ 0.03-0.08，CaCl₂ 0.03-0.08，K₂HPO₄ 0.8-1.2。

優(yōu)選的，所述的胞外多糖的發(fā)酵條件為:裝液量為每100mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基，接種量為7.2-7.7％(v/v)，初始pH值為5.8-6.2，30-35℃,160pm培養(yǎng)30-40h。

優(yōu)選的，所述的粗制胞外多糖的制備，包括以下步驟：

(1)菌種活化:將保存菌種接于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，于30-35℃恒溫培養(yǎng)20-26h后，保存在4℃冰箱備用；

(2)種子培養(yǎng)基制備與接種培養(yǎng):種子液培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基，裝液量每100mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基；將步驟(1)中的牛肉膏蛋白胨斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度28-32℃、轉(zhuǎn)速175-220rpm的條件下培養(yǎng)10-15h，獲得種子培養(yǎng)液；

(3)發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基制備與發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基組分如上，pH值為5.8-6.2；將步驟(2)發(fā)酵好的種子液以4-6％(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度28-32℃、轉(zhuǎn)速175-220rpm的條件在培養(yǎng)32-40h，獲得EPS發(fā)酵液；

(4)多糖的制備:將步驟(3)得到的發(fā)酵培養(yǎng)物5500-6500rpm離心8-12min離心去除菌體后，上清液pH調(diào)至6.8-7.2，加入3倍體積95％乙醇在4℃靜置10-15h，3500-4500rpm離心8-15min得到白色沉淀，用75％乙醇將沉淀洗兩次后，45-55℃烘干后即得粗制胞外多糖總糖。

優(yōu)選的，所述的精制胞外多糖的制備，包括以下步驟：

將粗制多糖加入去離子水溶解，配制成濃度為10％的多糖溶液。按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振蕩后靜置，離心，取上清重復，直至無游離蛋白；重復用Sevag試劑抽提蛋白質(zhì)兩至三次，至水相和有機相之間白色絮狀物肉眼不可見。收集上清液A，加無水乙醇至75％濃度在4℃靜置10-15小時，沉淀物經(jīng)75％乙醇洗滌后真空冷凍干燥，獲得精制胞外多糖。

所述方法中得到的胞外多糖可按照以下步驟進行分離純化：

采用離子交換層析法純化精制胞外多糖過程中得到的上清液A，所述離子交換層析法的分離條件為：以DEAE-Sepharose Fast Flow為填料，加樣5mL，樣品濃度為10mg/mL，分別用去離子水、50mM,100mM,200mM及800mM的NaCl溶液梯度洗脫，以120mL/h的流速洗脫，收集490nm吸收峰處樣品，分別得到分子量為175766Da，24806Da，62375Da和17691Da的多糖組分。

經(jīng)1H-核磁共振分析，其中組分1為β-(2，6)糖苷鍵果聚糖(Levan)，占總糖成分的90％左右；組分2-4為含有多種單糖的雜多糖?；谏鲜鼍戤a(chǎn)胞外多糖的性能，本發(fā)明建立了其發(fā)酵、提取和純化的完整技術(shù)工藝，胞外多糖產(chǎn)量達到13.9g/L以上，具備優(yōu)異的生產(chǎn)開發(fā)價值。

所述方法中，步驟1)中所加入的無水乙醇體積為發(fā)酵上清液的體積3倍；步驟3)中用Sevag試劑提取4次，每次振蕩20min；步驟4)中所用的層析柱的柱長為300mm，柱內(nèi)徑為2.5mm。

上述方法得到的解淀粉芽孢桿菌胞外多糖也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明胞外多糖產(chǎn)品具有廣泛用途：醫(yī)藥領(lǐng)域：具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等作用，可以開發(fā)為新的醫(yī)藥制品；其中含量最大的成分β-(2，6)糖苷鍵果聚糖具有無毒、無刺激性、無抗原性和分子量適中的特點。該多糖溶解度高，在水溶液中粘度極低，僅有有0.14dl/g，可以制備為血漿擴容劑；保健品領(lǐng)域：本產(chǎn)品是良好的益生元，具有促進腸道有益菌群生長，增強益生因子合成的功能，可以作為保健食品或食品添加劑開發(fā)利用?；瘖y品領(lǐng)域：本產(chǎn)品分子顆粒較小，其直徑只有50-100納米，一薄層本多糖干后就能形成堅硬閃亮的保護膜，這使得產(chǎn)品觸感更加絲滑。本產(chǎn)品具有良好的保濕、抗氧化和附膜能力，作為優(yōu)良的化妝品添加劑，可用于各種洗發(fā)護發(fā)用品、化妝品中。生物材料領(lǐng)域：本產(chǎn)品在特殊工藝條件下，可以制備為厚度僅有9nm的透明生物薄膜，該薄膜具有優(yōu)異的隔氧能力，是良好的藥品、食品的環(huán)保包裝材料。

本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ99，是一株革蘭氏陽性細菌，存在于植物根際土壤中，對人及動植物均無致病性。解淀粉芽孢桿菌EZ99菌株系發(fā)明人采集自甘肅省蘭州市七里河區(qū)西果園鄉(xiāng)，已經(jīng)中國普通微生物菌株保藏中心進行鑒定并登記保藏，保藏號為CGMCC No.13267。經(jīng)對該菌在PDA及MS培養(yǎng)基上形成菌落進行成分分析，發(fā)現(xiàn)其具有合成與分泌胞外多糖的特性。本發(fā)明建立了基于上述菌株胞外多糖發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)選培養(yǎng)基配方及上述胞外多糖的液體發(fā)酵優(yōu)選條件。發(fā)酵液經(jīng)離心、醇沉、透析及層析分離，得到四個純化多糖組分，經(jīng)核磁共振和高效液相色譜分析，確定了四個多糖組分的單糖組成及單體分子量。利用本發(fā)明菌株及方法所制備的胞外多糖具有醫(yī)藥、化妝品、食品添加及生物薄膜原料等多種用途。

除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。下面將對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

附圖說明

圖1為：胞外多糖EPS的分子量大小與分布圖。

圖2為：胞外多糖EPS-0，EPS-200及EPS-800的1H-NMR譜圖。

圖3為：胞外多糖EPS各組分的PMP柱前衍生HPLC色譜圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的實施例進行詳細說明，但是本發(fā)明可以根據(jù)權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。

實施例一：菌種分離鑒定

將蘭州百合根際土壤樣品，加入裝有25ml富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃,160r/min搖瓶培養(yǎng)48h。然后將富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水10倍稀釋后，取0.2ml涂布分離培養(yǎng)基平板。28℃倒置培養(yǎng)48h，獲得在平板上有膠質(zhì)狀透明外觀的菌落，得到能夠生產(chǎn)胞外多糖的細菌。富集培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基都是PDA平板培養(yǎng)基。按常規(guī)方法對菌株進行16S rDNA基因測序，將測序結(jié)果與Genebank中芽孢桿菌屬(Bacillus)的序列進行比對相似度最高，確定實驗菌種為解淀粉芽孢桿菌。復經(jīng)中國典型培養(yǎng)物保藏中心鑒定確認為解淀粉芽孢桿菌，命名該菌株為Bacillus amyloliquefaciens EZ99菌種，并進行保藏，保藏編號CGMCC No.13267。

實施例二：胞外多糖的培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件

種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基；發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基組分為(g/L)：蔗糖50.0。酵母膏5.0，蛋白胨10.0，(NH4)₂SO₄ 3.0，NaCl 3.0，MgSO₄ 0.05，CaCl₂ 0.05，K₂HPO₄ 1.0。

發(fā)酵條件:裝液量為每100mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基，接種量為7.5％(v/v)，初始pH值為7.0，32C,160pm培養(yǎng)12h。

實施例三：胞外多糖的粗制及精制

(1)菌種活化:將保存菌種接于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，于32℃恒溫培養(yǎng)24h后，保存在4℃冰箱備用。

(2)種子培養(yǎng)基制備與接種培養(yǎng):種子液培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基，裝液量每100mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基。將步驟(1)中的牛肉膏蛋白胨斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度30℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下培養(yǎng)12h，獲得種子培養(yǎng)液。

(3)發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基制備與發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基組分如上，pH值為6.0。將步驟(2)發(fā)酵好的種子液以5％(v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度30℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件在培養(yǎng)36h，獲得EPS發(fā)酵液。

(4)多糖的制備:將步驟(3)得到的發(fā)酵培養(yǎng)物6000rpm離心10min離心去除菌體后，上清液pH調(diào)至7.0，加入3倍體積95％乙醇在4℃靜置12h，4000rpm離心10min得到白色沉淀，用75％乙醇將沉淀洗兩次后，50℃烘干后即得粗制胞外多糖總糖。

(5)多糖的精制：將粗制多糖加入去離子水溶解，配制成濃度為10％的多糖溶液。按多糖溶液總體積的1/2加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇＝4∶1)，充分振蕩后靜置，離心，取上清重復，直至無游離蛋白；重復用Sevag試劑抽提蛋白質(zhì)兩至三次，至水相和有機相之間白色絮狀物肉眼不可見。收集上清液，加無水乙醇至75％濃度在4℃靜置12小時，沉淀物經(jīng)75％乙醇洗滌后真空冷凍干燥，獲得精制胞外多糖。

實施例四：胞外多糖各組分的分離純化

離子交換層析：將粗制胞外多糖100mg溶解在5ml去離子水中，制得20mg/mL的多糖溶液，經(jīng)millipore0.45μm濾膜過濾，用DEAE-sepharose Fast Flow陰離子層析交換柱進行分離。分別用去離子水、0.05M、0.2M、0.8MNaCl溶液梯度洗脫，洗脫速度為2mL/min，分部收集洗脫液，同時用苯酚-硫酸法檢測多糖含量。對所有洗脫液分別濃縮，用截留分子量8000-14000的透析袋流水透析48h、真空冷凍干燥得到多糖精品。其中水洗脫為中性多糖、鹽洗脫為酸性多糖。

實施例五：多糖組分的分子量測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定重均分子量。將葡聚糖系列標準品Dextran(重均分子量為2000.0kDa,133.8kDa,84.4kDa,41.1kDa,21.4kDa,10.0kDa,7.1kDa,4.6kDa,2.5kDa,Sigma)以及胞外多糖樣品配成4mg/mL，GPC分析軟件以標準葡聚糖分子量的對數(shù)對保留時間作圖，繪制標準曲線并計算各組分分子量大小。HPGPC操作條件：儀器：高效液相色譜儀Agilent 1100型；凝膠柱：TSKgel GMPffXLGPC column(日本Tosoh公司)；流動相：0.1MNaNO3和尿素；流速：1mL/min；檢測器：示差折光檢測器(RI)；溫度：30℃；進樣量：20μL。采用GPC測定多糖分子量，組分1-4分子量分別為175766Da，24806Da，62375Da和17691Da。

實施例六：多糖組分的單糖成分鑒定

(1)多糖酸水解：將得到的各組分多糖配成濃度為4～5mg/mL，吸取100μL于3mL水解瓶中，加入100μL的2mol/L三氟乙酸(TFA)，置烘箱中在105℃下水解6h或在110℃油浴中水解2h；冷卻后打開蓋子，加入200μL甲醇后用氮氣吹干，如此重復加甲醇并用氮氣吹3次，去除TFA，將其殘渣用去離子水溶解并定容至5mL。

(2)多糖PMP衍生：分別精密稱取Man、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl、Arb、Rha等8種單糖標準品各10.0mg，加水定容于10mL的容量瓶中充分溶解。分別取100μL的混合單糖標準液以及步驟(1)酸水解后的多糖置于1mL的具塞試管中，加入100μL0.3mol/L的NaOH溶液混合均勻，再加入120μL0.5mol/L的PMP-甲醇溶液，漩渦混勻，封口后用錫箔紙包裹在70℃下反應60min，取出冷卻至室溫后加入100μL0.3mol/L的HCl溶液中和，并加水至1mL。最后加入700μL二氯甲烷溶液，重復萃取3次，合并萃取液。衍生后的樣品需經(jīng)3500r/min離心除去不溶性沉淀。

(3)高效液相HPLC色譜分析單糖組成：將步驟(2)得到的各組分多糖經(jīng)0.45μm微孔膜過濾后進Agilent1200高效液相色譜儀進行分析。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm)；流動相：0.1mol/L磷酸鹽(pH 6.7)緩沖液-乙腈(體積比為83∶17)；柱溫：30℃；紫外檢測波長：254nm；流速：1mL/min；進樣體積：20μL。各組分單糖組成如下：組分1：果糖(Fru)；組份2:甘露糖(Man),鼠李糖(Rha)，葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal)；組分3：甘露糖(Man)，鼠李糖(Rha)，葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)，木糖(Xyl)；組分4:甘露糖(Man),鼠李糖(Rha)，葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。