本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地，涉及一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代養(yǎng)殖體系逐漸陷入了依賴(lài)和濫用抗生素的境地，抗生素的使用促進(jìn)了畜牧業(yè)發(fā)展，讓更多人以低廉的價(jià)格購(gòu)買(mǎi)更多的肉制品，但也造成了細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，原本用于治療疾病的抗生素開(kāi)始威脅到人類(lèi)的健康。微生態(tài)制劑作為一種抗生素替代品也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，它們無(wú)副作用、無(wú)殘留，且能夠減少或替代抗生素的使用。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），即酪酸梭菌，存在于土壤、人和動(dòng)物腸道中，可以抑制腸道中的致病菌，促進(jìn)腸道中有益菌如雙歧桿菌和乳酸菌的生長(zhǎng)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)丁酸梭菌的研究很多，多集中在醫(yī)學(xué)方面，但飼料方面的研究確并不多見(jiàn)。而且因?yàn)槠鸩酵?、基礎(chǔ)差，目前市面上的丁酸梭菌制品大都有明顯缺陷，如：菌活數(shù)不高、不耐儲(chǔ)藏、穩(wěn)定性差等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑及其制備方法，以解決上述問(wèn)題。

具體地，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑，以丁酸梭菌發(fā)酵液的體積計(jì)，它包括以下的組分：丁酸梭菌發(fā)酵液、0.1%～10%的丁酸前驅(qū)體和1%～20%的糖類(lèi)添加劑溶液；其中，所述糖類(lèi)添加劑溶液的質(zhì)量百分濃度為30%～50%，所述糖類(lèi)添加劑溶液中的主要溶質(zhì)包括二糖、三糖中的一種或其任意組合的混合糖。

基于上述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑，以丁酸梭菌發(fā)酵液的體積計(jì)，它包括以下的組分：丁酸梭菌發(fā)酵液、4.5%～7.5%的丁酸前驅(qū)體和8%～13%的糖類(lèi)添加劑溶液。

基于上述，所述糖類(lèi)添加劑溶液中的溶質(zhì)為紅糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、龍膽三糖中的一種或其任意組合。

基于上述，所述丁酸前驅(qū)體為丙二醇、甘油中的一種或其混合。

一種上述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的制備方法，包括以下步驟：

制備種子液采用丁酸梭菌種子培養(yǎng)基對(duì)丁酸梭菌在35～39℃厭氧培養(yǎng)7～8 h，制得丁酸梭菌種子液；

制備發(fā)酵液按照丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基的體積計(jì)，向所述丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基加入1%～5%的所述種子液，在溫度為35～39℃、pH值為5.5～6.5、攪拌速度為80～160 r/min的條件下，厭氧培養(yǎng)24～36 h，制得所述丁酸梭菌發(fā)酵液；

制備成品將上述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的組分混合均勻，制得液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑成品。

基于上述，所述種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨0.1%～1.5%、蛋白胨0.1%～1.5%、酵母粉 0.1%～0.5%、葡萄糖 0.1%～3.0%、淀粉 0.01%～0.5%、氯化鈉 0.01%～1.0%、乙酸鈉 0.1%～0.5%、L～半胱氨酸鹽酸鹽 0.01%～0.5%、余量為無(wú)菌水。

基于上述，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨 0.1%～3.0%、魚(yú)粉 0.1%～1.5%、酵母膏 0.1%～1.5%、葡萄糖1.0%～8.0%、淀粉 0.1%～1.5%、氯化鈉 0.1%～1.5%、乙酸鈉0.1%～1.5%、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.01%～0.5%、吐溫-80 0.01%～0.5%、硫酸錳 0.01%～0.1%、磷酸氫二鉀0.1%～0.5%、硫酸鎂 0.01～0.10%、余量為無(wú)菌水。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑中的丁酸前驅(qū)體是丁酸梭菌代謝產(chǎn)生丁酸的前體物質(zhì)，可以迅速被丁酸梭菌所吸收，迅速為丁酸梭菌提供養(yǎng)分；而糖類(lèi)添加劑溶液是介于速效營(yíng)養(yǎng)和遲效營(yíng)養(yǎng)之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以在較長(zhǎng)時(shí)間范圍內(nèi)為丁酸梭菌提供營(yíng)養(yǎng)；二者協(xié)同作用，延長(zhǎng)丁酸梭菌的活力和壽命，有效提高所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的菌活數(shù)和芽孢數(shù)，改善所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的穩(wěn)定性。同時(shí)，本發(fā)明提供的所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的制備方法簡(jiǎn)單，具有廣闊的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑，以丁酸梭菌發(fā)酵液的體積計(jì)，它包括以下的組分：丁酸梭菌發(fā)酵液、0.1%的丙二醇和20%的蔗糖水溶液劑；其中，所述蔗糖水溶液的質(zhì)量百分濃度為30%。

具體制備方法：

制備種子液采用丁酸梭菌種子培養(yǎng)基對(duì)丁酸梭菌在35～39℃厭氧培養(yǎng)7～8 h，制得丁酸梭菌種子液；

制備發(fā)酵液按照丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基的體積計(jì)，向所述丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基加入1%～5%的所述種子液，在溫度為35～39℃、pH值為5.5～6.5、攪拌速度為80～160 r/min的條件下，厭氧培養(yǎng)24～36 h，制得所述丁酸梭菌發(fā)酵液；

制備成品向所述丁酸梭菌發(fā)酵液中加入所述丙二醇和所述糖類(lèi)添加劑混合均勻，制得液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑成品；

其中，所述丁酸梭菌種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨0.1%、蛋白胨1.5%、酵母粉 0.5%、葡萄糖 0.1%、淀粉 0.01%、氯化鈉1.0%、乙酸鈉0.5%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、余量為無(wú)菌水；

所述丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨 3.0%、魚(yú)粉 0.1%、酵母膏1.5%、葡萄糖8.0%、淀粉0.1%、氯化鈉1.5%、乙酸鈉1.5%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、吐溫-80 0.01%、硫酸錳0.1%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸鎂0.10%、余量為無(wú)菌水。

本實(shí)施例提供的所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的初始菌活數(shù)為8.3×10⁸，初始芽孢數(shù)為7.2×10⁸，其在無(wú)氧環(huán)境中常溫保存60 d后，所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的菌活數(shù)為6.7×10⁸，芽孢數(shù)為5.7×10⁸。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑及其制備方法，本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于：

所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑包括以下的組分：以丁酸梭菌發(fā)酵液的體積計(jì)，丁酸梭菌發(fā)酵液、10%的甘油和1%的龍膽三糖水溶液；其中，所述龍膽三糖水溶液的質(zhì)量百分濃度為50%；

所述丁酸梭菌種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨1.5%、蛋白胨0.1%、酵母粉0.5%、葡萄糖3.0%、淀粉0.5%、氯化鈉 0.01%、乙酸鈉 0.1%、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.01%、余量為無(wú)菌水；

所述丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨 0.1%、魚(yú)粉 1.5%、酵母膏0.1%、葡萄糖1.0%、淀粉1.5%、氯化鈉 0.1%、乙酸鈉0.1%、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.01%、吐溫-80 0.5%、硫酸錳 0.01%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.10%、余量為無(wú)菌水。

本實(shí)施例提供的所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的初始菌活數(shù)為8.4×10⁸，初始芽孢數(shù)為7.3×10⁸，其在無(wú)氧環(huán)境中常溫保存60 d后，所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的菌活數(shù)為6.6×10⁸，芽孢數(shù)為5.6×10⁸。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑及其制備方法，本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于：

所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑包括以下的組分：以丁酸梭菌發(fā)酵液的體積計(jì)，丁酸梭菌發(fā)酵液、6%的丙二醇和10%的乳糖水溶液；其中，所述乳糖水溶液的質(zhì)量百分濃度為40%；

所述丁酸梭菌種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨0.7%、蛋白胨0.8%、酵母粉 0.3%、葡萄糖1.4%、淀粉0.22%、氯化鈉 0.53%、乙酸鈉 0.24%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25%、余量為無(wú)菌水；

所述丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨1.36%、魚(yú)粉 0.59%、酵母膏0.82%、葡萄糖4.3%、淀粉0.78%、氯化鈉0.65%、乙酸鈉0.69%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.23%、吐溫-80 0.27%、硫酸錳0.47%、磷酸氫二鉀0.22%、硫酸鎂0.55%、余量為無(wú)菌水。

本實(shí)施例提供的所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的初始菌活數(shù)為8.2×10⁸，初始芽孢數(shù)為7.1×10⁸，其在無(wú)氧環(huán)境中常溫保存60 d后，所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的菌活數(shù)為6.5×10⁸，芽孢數(shù)為5.7×10⁸。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供一種液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑及其制備方法，本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于：

所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑包括以下的組分：以丁酸梭菌發(fā)酵液的體積計(jì)，丁酸梭菌發(fā)酵液、7.5%的丙二醇和8%的紅糖水溶液；其中，所述紅糖水溶液的質(zhì)量百分濃度為42%；

所述丁酸梭菌種子培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨0.65%、蛋白胨0.43%、酵母粉0.35%、葡萄糖1.2%、淀粉0.27%、氯化鈉 0.48%、乙酸鈉0.27%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.20%、余量為無(wú)菌水；

所述丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：胰蛋白胨1.42%、魚(yú)粉 0.43%、酵母膏0.89%、葡萄糖4.5%、淀粉0.80%、氯化鈉0.55%、乙酸鈉0.52%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.19%、吐溫-80 0.27%、硫酸錳0.52%、磷酸氫二鉀0.34%、硫酸鎂0.60%、余量為無(wú)菌水。

對(duì)比試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組：實(shí)施例4提供的液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑。

對(duì)照組：液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑中添加等量無(wú)菌水代替實(shí)施例4中的所述丙二醇和糖類(lèi)添加劑，其他和實(shí)施例4相同。

實(shí)驗(yàn)方法：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑分別在無(wú)氧環(huán)境中常溫保存，其活菌數(shù)及芽孢數(shù)隨時(shí)間變化如表1所示。

表1 液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑的活菌數(shù)及芽孢數(shù)隨時(shí)間變化

由表1可知，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的初始活菌數(shù)和初始芽孢數(shù)比較接近，但是，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，對(duì)照組中活菌數(shù)和芽孢數(shù)迅速下降，60天時(shí)，對(duì)照組的菌活數(shù)由8.1×10⁸降至3.1×10⁸，芽孢數(shù)由7.2×10⁸降至2.3×10⁸；而實(shí)驗(yàn)組在60天時(shí)，活菌數(shù)為6.9×10⁸，芽孢數(shù)為5.8×10⁸。實(shí)驗(yàn)組的菌活數(shù)和芽孢數(shù)均遠(yuǎn)大于對(duì)照組，說(shuō)明本發(fā)明提供的所述液態(tài)丁酸梭菌發(fā)酵制劑中的丙二醇和糖類(lèi)添加劑可以有效提高活菌數(shù)和芽孢數(shù)，提高丁酸梭菌的活性和壽命。

最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)其限制；盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。