本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域，具體涉及一種tpbg抗體及其制備方法、其偶聯(lián)物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在對胚胎干細(xì)胞滋養(yǎng)層和癌細(xì)胞進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞表面分子，滋養(yǎng)層特異性糖蛋白(tpbg，又稱為5t4)，是胚胎滋養(yǎng)層表達(dá)的特異性蛋白。人類tpbg蛋白的分子量約為72kda，包含420個氨基酸，其n端低聚糖結(jié)構(gòu)具有多樣性，能夠防止蛋白質(zhì)水解，并且在細(xì)胞膜信號傳導(dǎo)過程中與其他分子有交互作用。tpbg蛋白共包含7個重復(fù)的亮氨酸結(jié)構(gòu)域(lrr)，可參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。滋養(yǎng)層是胎盤和胎兒之間的一層特殊的胚胎干細(xì)胞，tpbg廣泛表達(dá)于胚胎發(fā)育期的各種滋養(yǎng)層細(xì)胞。對于正常成人組織中，tpbg只在有限的幾種上皮細(xì)胞中有表達(dá)。但是，tpbg在很多癌細(xì)胞中表達(dá)，如子宮癌、結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌或腎癌組織中都檢測到tpbg的表達(dá)，在結(jié)腸癌、胃癌或卵巢癌中有證據(jù)表明tpbg的表達(dá)量與癌癥的低治愈率相關(guān)。而在非小細(xì)胞肺癌、腎癌或胰腺癌的組織中，tpbg的表達(dá)高達(dá)95％以上。很多研究顯示，過表達(dá)該tpbg能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，同時還能夠避免免疫監(jiān)控。在小鼠纖維原細(xì)胞中過表達(dá)tpbg能夠誘導(dǎo)細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘體形態(tài)，降低細(xì)胞粘附。在小鼠正常上皮細(xì)胞中，同樣發(fā)現(xiàn)tpbg能夠抑制上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(e-cadherin)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。而tpbg在細(xì)胞內(nèi)的部分有抑制細(xì)胞骨架形成的功能。同時，tpbg與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)移(emt)相關(guān)，tpbg作為胚胎干細(xì)胞發(fā)育的早期標(biāo)志物，增加細(xì)胞間質(zhì)蛋白酶的活性，干擾肌動蛋白細(xì)胞骨架的排列，下調(diào)e-cadherin的表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)，tpbg與cxcr4共定位于細(xì)胞膜表明，能夠誘導(dǎo)其配體cxcl12趨化因子的結(jié)合，促進(jìn)炎癥和腫瘤的擴散。在tpbg陰性細(xì)胞中，cxcl12結(jié)合另一個受體cxcr7，抑制趨化反應(yīng)，有利于細(xì)胞的生長和存活。wnt/b-catenin信號通路對發(fā)育和細(xì)胞再生起到非常重要的作用，tpbg通過抑制lrp6與wnt受體的內(nèi)吞，抑制wnt信號通路，從而抑制細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架的形成，促進(jìn)腫瘤的遷移和擴散。還有證據(jù)表明tpbg在乳腺癌和胃癌細(xì)胞中參與非經(jīng)典的wnt通路，同樣促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和浸潤?？贵w藥物偶聯(lián)藥物，是由抗體與高效小分子藥物通過連接物偶聯(lián)形成的抗體藥物偶聯(lián)物，能夠使高毒性小分子藥物特異識別癌細(xì)胞上的靶點蛋白，從而特異性殺死癌細(xì)胞。近一百年間，基于抗體的免疫療法與基于化學(xué)藥物的化學(xué)療法，一直是臨床上癌癥治療的兩大治療策略。抗體以腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的抗原為靶點，多種治療性單抗已經(jīng)在臨床上取得了巨大成功。在臨床實踐中，治療性抗體雖然具有很好的靶向性，但是殺傷作用存在局限性。小分子化學(xué)藥物雖然具備對癌細(xì)胞的高效殺傷作用，但是對非癌細(xì)胞也造成同樣的傷害。因此臨床上抗體藥物以及小分子藥物各自的局限性，對藥物研發(fā)提出了新的要求。新一代抗體藥物偶聯(lián)物，利用抗體對靶細(xì)胞的特異結(jié)合能力，輸送高細(xì)胞毒的化學(xué)藥物，實現(xiàn)對癌細(xì)胞的靶向高效殺傷。隨著新型化學(xué)連接技術(shù)的出現(xiàn)，抗體藥物偶聯(lián)藥在八十年代末開始進(jìn)入臨床研究，目前已經(jīng)有2個adc藥物經(jīng)fda批準(zhǔn)上市。adc藥物的開發(fā)涉及：藥物靶點的篩選、重組抗體的制備、連接物技術(shù)開發(fā)以及高細(xì)胞毒性化合物的篩選優(yōu)化等幾個方面。tpbg作為癌細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白，是adc藥物的候選靶點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服目前缺少tpbg抗體的不足，提供一種親和力高、特異性強的tpbg抗體及其制備方法和應(yīng)用，所述的tpbg抗體與人源、小鼠源或食蟹猴源的tpbg蛋白具有高度親和力。本發(fā)明還提供一種藥物活性成分的偶聯(lián)物，其包括所述的tpbg抗體和與其偶聯(lián)的、具有抗腫瘤的功能的小分子化合物，所述的偶聯(lián)物能夠進(jìn)入細(xì)胞，對tpbg陽性的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒殺傷作用，能夠運用于治療腫瘤等藥物的制備中。本發(fā)明以人源tpbg蛋白或者過表達(dá)人源tpbg蛋白的重組細(xì)胞株作為免疫原，采用傳統(tǒng)的雜交瘤制備技術(shù)(kohlerandmilstein，nature，1975，256:495)，通過一系列的調(diào)整和改進(jìn)，獲得tpbg抗體的先導(dǎo)抗體。再通過對先導(dǎo)抗體的初步生產(chǎn)、純化和檢定，獲得具備與人源tpbg蛋白等蛋白具有高度親和力的tpbg抗體。該tpbg抗體與小分子化合物如mmaf偶聯(lián)得偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物能夠進(jìn)入細(xì)胞，對tpbg陽性細(xì)胞有優(yōu)異的細(xì)胞毒殺傷作用。然后通過分子生物學(xué)方法測序獲知所得的tpbg抗體的重鏈可變區(qū)和tpbg抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。本發(fā)明提供一種分離的蛋白質(zhì)，其包括tpbg抗體的重鏈cdr1、重鏈cdr2和重鏈cdr3中的一種或多種，和/或，tpbg抗體的輕鏈cdr1、輕鏈cdr2和輕鏈cdr3中的一種或多種，其中，所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.2、seqidno.10、seqidno.18、seqidno.26、seqidno.34、seqidno.42、seqidno.50、seqidno.58、seqidno.66或seqidno.74所示；所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.3、seqidno.11、seqidno.19、seqidno.27、seqidno.35、seqidno.43、seqidno.51、seqidno.59、seqidno.67或seqidno.75所示；所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.4、seqidno.12、seqidno.20、seqidno.28、seqidno.36、seqidno.44、seqidno.52、seqidno.60、seqidno.68或seqidno.76所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno.6、seqidno.14、seqidno.22、seqidno.30、seqidno.38、seqidno.46、seqidno.54、seqidno.62、seqidno.70或seqidno.78所示；所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno.7、seqidno.15、seqidno.23、seqidno.31、seqidno.39、seqidno.47、seqidno.55、seqidno.63、seqidno.71或seqidno.79所示；所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno.8、seqidno.16、seqidno.24、seqidno.32、seqidno.40、seqidno.48、seqidno.56、seqidno.64、seqidno.72或seqidno.80所示；或者，所述重鏈cdr1的氨基酸序列與如序列表中seqidno.2、seqidno.10、seqidno.18、seqidno.26、seqidno.34、seqidno.42、seqidno.50、seqidno.58、seqidno.66或seqidno.74所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重鏈cdr2的氨基酸序列與如序列表中seqidno.3、seqidno.11、seqidno.19、seqidno.27、seqidno.35、seqidno.43、seqidno.51、seqidno.59、seqidno.67或seqidno.75所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重鏈cdr3的氨基酸序列與如序列表中seqidno.4、seqidno.12、seqidno.20、seqidno.28、seqidno.36、seqidno.44、seqidno.52、seqidno.60、seqidno.68或seqidno.76所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列與如序列表中seqidno.6、seqidno.14、seqidno.22、seqidno.30、seqidno.38、seqidno.46、seqidno.54、seqidno.62、seqidno.70或seqidno.78所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述輕鏈cdr2的氨基酸序列與如序列表中seqidno.7、seqidno.15、seqidno.23、seqidno.31、seqidno.39、seqidno.47、seqidno.55、seqidno.63、seqidno.71或seqidno.79所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述輕鏈cdr3的氨基酸序列與如序列表中seqidno.8、seqidno.16、seqidno.24、seqidno.32、seqidno.40、seqidno.48、seqidno.56、seqidno.64、seqidno.72或seqidno.80所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示。較佳地，所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.3所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.4所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.10所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.11所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.12所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.18所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.19所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.20所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.26所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.27所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.28所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.34所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.35所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.36所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.42所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.43所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.44所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.50所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.51所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.52所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.58所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.59所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.60所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.66所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.67所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.68所示；所述重鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.74所示，所述重鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.75所示，且所述重鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.76所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.6所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.7所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.8所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.14所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.15所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.16所示；或，所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.22所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.23所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.24所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.30所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.31所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.32所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.38所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.39所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.40所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.46所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.47所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.48所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.54所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.55所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.56所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.62所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.63所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.64所示；所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.70所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.71所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.72所示；或，所述輕鏈cdr1的氨基酸序列如序列表seqidno.78所示，所述輕鏈cdr2的氨基酸序列如序列表seqidno.79所示，且所述輕鏈cdr3的氨基酸序列如序列表seqidno.80所示。本發(fā)明還提供一種分離的蛋白質(zhì)，其包括tpbg抗體的重鏈可變區(qū)和/或tpbg抗體的輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中seqidno.1、seqidno.9、seqidno.17、seqidno.25、seqidno.33、seqidno.41、seqidno.49、seqidno.57、seqidno.65或seqidno.73所示；所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中seqidno.5、seqidno.13、seqidno.21、seqidno.29、seqidno.37、seqidno.45、seqidno.53、seqidno.61、seqidno.69或seqidno.77所示。較佳地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.1所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.5所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.9所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.13所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.17所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.21所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.25所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.29所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.33所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.37所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.41所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.45所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.49所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.53所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.57所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.61所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.65所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.69所示；或，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.73所示，且所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表seqidno.77所示。綜上所述，上述氨基酸序列的編號如表1所示：表1tpbg抗體蛋白序列編號其中，表1中的數(shù)字即為序列表中序列號，如12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno.1，而12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的氨基酸序列為seqidno.2。較佳地，所述的蛋白質(zhì)還包括抗體重鏈恒定區(qū)和/或抗體輕鏈恒定區(qū)，所述的抗體重鏈恒定區(qū)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為小鼠源抗體重鏈恒定區(qū)或人源抗體重鏈恒定區(qū)，更佳地為人源抗體重鏈恒定區(qū)。所述的抗體輕鏈恒定區(qū)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為小鼠源輕鏈抗體恒定區(qū)或人源抗體輕鏈恒定區(qū)，更佳地為人源抗體輕鏈恒定區(qū)。所述的蛋白質(zhì)為本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白質(zhì)，較佳地為tpbg抗體，更佳地為抗體全長蛋白、抗原抗體結(jié)合域蛋白質(zhì)片段、雙特異性抗體、多特異性抗體、單鏈抗體(singlechainantibodyfragment，scfv)、單域抗體(singledomainantibody，sdab)和單區(qū)抗體(signle-domainantibody)中的一種或多種，以及上述抗體所制得的單克隆抗體或多克隆抗體。所述單克隆抗體可以由多種途徑和技術(shù)進(jìn)行研制，包括雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、單淋巴細(xì)胞基因克隆技術(shù)等，主流是通過雜交瘤技術(shù)從野生型或轉(zhuǎn)基因小鼠制備單克隆抗體。所述的抗體全長蛋白為本領(lǐng)域常規(guī)的抗體全長蛋白，其包括重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。所述的蛋白質(zhì)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)與人源重鏈恒定區(qū)和人源輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成全人源抗體全長蛋白。較佳地，所述的抗體全長蛋白為igg1、igg2、igg3或igg4。所述的單鏈抗體為本領(lǐng)域常規(guī)的單鏈抗體，其包括重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和15～20個氨基酸的短肽。所述的抗原抗體結(jié)合域蛋白質(zhì)片段為本領(lǐng)域常規(guī)的抗原抗體結(jié)合域蛋白質(zhì)片段，其包括輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)的fd段。較佳地，所述的抗原抗體結(jié)合域蛋白質(zhì)片段為fab和f(ab’)2。所述的單域抗體為本領(lǐng)域常規(guī)的單域抗體，其包括重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)。所述的單區(qū)抗體為本領(lǐng)域常規(guī)的單區(qū)抗體，其僅包括重鏈可變區(qū)。其中，所述蛋白質(zhì)的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法。所述制備方法較佳地為：從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得或者通過人工合成蛋白質(zhì)序列獲得。所述的從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得優(yōu)選如下方法：將編碼所述蛋白質(zhì)并且?guī)в悬c突變的核酸分子克隆到重組載體中，將所得重組載體轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化體中，得到重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，通過培養(yǎng)所得重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，即可分離純化獲得所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供一種核酸，其編碼上述的蛋白質(zhì)。較佳地，編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.81、序列表seqidno.83、序列表seqidno.85、序列表seqidno.87、序列表seqidno.89、序列表seqidno.91、序列表seqidno.93、序列表seqidno.95、序列表seqidno.97或序列表seqidno.99所示；和/或，編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.82、序列表seqidno.84、序列表seqidno.86、序列表seqidno.88、序列表seqidno.90、序列表seqidno.92、序列表seqidno.94、序列表seqidno.96、序列表seqidno.98或序列表seqidno.100所示。更佳地，編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.81所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.82所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.83所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.84所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.85所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.86所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.87所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.88所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.89所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.90所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.91所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.92所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.93所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.94所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.95所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.96所示；編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.97所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.98所示；或，編碼所述重鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.99所示，且編碼所述輕鏈可變區(qū)的核酸的核苷酸序列如序列表seqidno.100所示。綜上所述，上述核苷酸序列的編號如表2所示：表2tpbg抗體基因序列編號克隆號重鏈蛋白可變區(qū)輕鏈蛋白可變區(qū)12b12c7c381825g4h10g5838437h9c5g2858639a11g5f2878852c9e9f6899028d4e6a9919236a10d8b12939499e12c7h19596103e2e9c29798106d5g3d1099100其中，表2中的數(shù)字即為序列表中序列號，如編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)的核苷酸序列為seqidno.81。其中，編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.81中的第91位至第105位；編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.81中的第151位至第198位；編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.81中的第295位至第327位；編碼12b12c7c3的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.82中的第70位至第114位；編碼12b12c7c3的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.82中的第157位至第180位；編碼12b12c7c3的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.82中的第277位至第303位；編碼5g4h10g5的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.83中的第91位至第105位；編碼5g4h10g5的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.83中的第148位至第198位；編碼5g4h10g5的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.83中的第295位至第330位；編碼5g4h10g5的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.84中的第70位至第102位；編碼5g4h10g53的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.84中的第148位至第168位；編碼5g4h10g5的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.84中的第265位至第288位；編碼37h9c5g2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.85中的第91位至第105位；編碼37h9c5g2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.85中的第151位至第198位；編碼37h9c5g2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.85中的第295位至第327位；編碼37h9c5g2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.86中的第70位至第102位；編碼37h9c5g2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.86中的第148位至第168位；編碼37h9c5g2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.86中的第265位至第291位。編碼39a11g5f2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.87中的第91位至第105位；編碼39a11g5f2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.87中的第151位至第198位；編碼39a11g5f2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.87中的第295位至第315位；編碼39a11g5f2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.88中的第70位至第102位；編碼39a11g5f2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.88中的第148位至第168位；編碼39a11g5f2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.88中的第265位至第291位。編碼52c9e9f6的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.89中的第91位至第105位；編碼52c9e9f6的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.89中的第151位至第198位；編碼52c9e9f6的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.89中的第295位至第315位；編碼52c9e9f6的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.90中的第70位至第102位；編碼52c9e9f6的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.90中的第148位至第168位；編碼52c9e9f6的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.90中的第268位至第291位。編碼28d4e6a9的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.91中的第91位至第105位；編碼28d4e6a9的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.91中的第148位至第198位；編碼28d4e6a9的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.91中的第295位至第327位；編碼28d4e6a9的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.92中的第70位至第102位；編碼28d4e6a9的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.92中的第148位至第168位；編碼28d4e6a9的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.92中的第265位至第291位。編碼36a10d8b12的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.93中的第91位至第108位；編碼36a10d8b12的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.93中的第154位至第198位；編碼36a10d8b12的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.93中的第295位至第324位；編碼36a10d8b12的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.94中的第70位至第102位；編碼36a10d8b12的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.94中的第148位至第168位；編碼36a10d8b12的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.94中的第265位至第291位。編碼99e12c7h1的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.95中的第91位至第105位；編碼99e12c7h1的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.95中的第151位至第198位；編碼99e12c7h1的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.95中的第295位至第318位；編碼99e12c7h1的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.96中的第70位至第102位；編碼99e12c7h1的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.96中的第148位至第168位；編碼99e12c7h1的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.96中的第265位至第291位。編碼103e2e9c2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.97中的第91位至第105位；編碼103e2e9c2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.97中的第151位至第198位；編碼103e2e9c2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.97中的第295位至第324位；編碼103e2e9c2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.98中的第70位至第105位；編碼103e2e9c2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.98中的第151位至第171位；編碼103e2e9c2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.98中的第268位至第294位。編碼106d5g3d10的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.99中的第91位至第105位；編碼106d5g3d10的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.99中的第151位至第198位；編碼106d5g3d10的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.99中的第295位至第318位；編碼106d5g3d10的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.100中的第70位至第99位；編碼106d5g3d10的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.100中的第145位至第165位；編碼106d5g3d10的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.100中的第262位至第294位。所述核酸的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，較佳地，包括以下的步驟：通過基因克隆技術(shù)獲得編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，編碼上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的堿基序列可以適當(dāng)引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明中多聚核苷酸的同系物可以通過對編碼該蛋白序列基因的一個或多個堿基在保持抗體活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺失或增加來制得。本發(fā)明還提供一種包含所述核酸的重組表達(dá)載體。其中所述重組表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得，即：將本發(fā)明所述的核酸分子連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，只要其能夠容載前述核酸分子即可。所述載體較佳地包括：各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等。本發(fā)明還提供一種包含上述重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。其中，所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，較佳地為：將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中制得。所述的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主細(xì)胞，只要能滿足使上述重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶所述的核酸可被有效表達(dá)即可。較佳地，所述宿主細(xì)胞為e.colitg1或bl21細(xì)胞(表達(dá)單鏈抗體或fab抗體)，或者cho-k1細(xì)胞(表達(dá)全長igg抗體)。將前述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。其中所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，較佳地為化學(xué)轉(zhuǎn)化法，熱激法或電轉(zhuǎn)法。本發(fā)明還提供一種tpbg抗體的制備方法，其包括如下步驟：培養(yǎng)上述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得tpbg抗體。本發(fā)明提供一種免疫偶聯(lián)物，其包括共價附著至細(xì)胞毒劑的上述的蛋白質(zhì)。較佳地，所述的免疫偶聯(lián)物中，上述的1當(dāng)量的蛋白質(zhì)通過x當(dāng)量接頭與y當(dāng)量的細(xì)胞毒劑相連，具有如式1所示的結(jié)構(gòu)，ab-(l)x-(d)y式1其中，ab為上述的蛋白質(zhì)；l為接頭；d為細(xì)胞毒劑；所述x為本領(lǐng)域常規(guī)的交聯(lián)度，x為自然數(shù)，優(yōu)選1-20的整數(shù)；y為0或自然數(shù)，優(yōu)選0-20的整數(shù)；x和y各自獨立地優(yōu)選為1～2，或2～4，或4～8，或8～20的整數(shù)；x和y的比例優(yōu)選為1:1。所述l是本領(lǐng)域常規(guī)的接頭(或稱交聯(lián)劑或偶聯(lián)劑)。所述l包含2個官能團(tuán)，即與抗體反應(yīng)的基團(tuán)，和與藥物反應(yīng)的基團(tuán)(例如，醛或酮)。藥物經(jīng)由接頭分子與上述的蛋白質(zhì)偶聯(lián)。所述l進(jìn)入細(xì)胞后釋放，其包括但不限于如下的官能團(tuán)，活性酯、碳酸鹽類、氨基甲酸酯類、亞胺磷酸酯、肟類、腙類、縮醛類、原酸酯類、氨基類、小肽段或核苷酸片段。較佳地，所述l主要含有式2所示結(jié)構(gòu)，其為l中離去基團(tuán)離去后對應(yīng)的剩余部分；(co-alk1-sp1-ar-sp2-alk2-c(z1)＝q-sp)式2其中，alk1和alk2獨立地是鍵或分支的或不分支的(c1-c10)亞烷基鏈；sp1是-s-、-o-、-conh-、-nhco-、-nr’-、-n(ch2ch2)2n-、或-x-ar’-y-(ch2)n-z，其中x、y和z是獨立的鍵、-nr’-、-s-或-o-，條件是當(dāng)n＝0時，y和z中的至少一個必須是鍵，且ar’是由(c1-c5)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-(ch2)ncoor’、s(ch2)ncoor’、-o(ch2)nconhr’或-s(ch2)nconhr’的1、2或3個基團(tuán)任選取代的1，2-、1，3-或1，4-亞苯基，n是0-5的整數(shù)，條件是當(dāng)alk1是鍵時，sp1是鍵；r’是由-oh、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、(c1-c3)二烷基氨基、或(c1-c3)三烷基銨-a的一個或2個基團(tuán)任選取代的分支的或不分支的(c1-c5)鏈，其中a是完成鹽的藥學(xué)上可接受的陰離子；ar是由(c1-c6)烷基、(c1-c5)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-o(ch2)ncoor’、-s(ch2)ncoor’、-o(ch2)nconhr”或-s(ch2)nconhr’的1、2或3個基團(tuán)任選取代的1,2-、1,3-或1,4-亞苯基，其中n和r’如上述的定義，或ar是1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亞萘基，其中亞萘基或吩噻嗪各任選地由(c1-c6)烷基、(c1-c5)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-o(ch2)ncoor’、-s(ch2)ncoor’、或-s(ch2)nconhr’的1、2、3或4個基團(tuán)取代，其中n和r’如上文定義，條件是當(dāng)ar是吩噻嗪時，sp1是僅與氮連接的鍵；sp2是鍵、-s-或-o-，條件是當(dāng)alk2是鍵時，sp2是鍵；z1是h、(c1-c5)烷基、或由(c1-c5)烷基、(c1-c5)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-o(ch2)ncoor’、-s(ch2)ncoor’、-o(ch2)nconhr’或-s(ch2)nconhr’的1、2、或3個基團(tuán)任選取代的苯基，其中n和r’如上文定義；sp是直鏈或支鏈二價或三價(c1-c18)基團(tuán)，二價或三價芳基或雜芳基基團(tuán)，二價或三價(c3-c18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)，二價或三價芳基或雜芳基-芳基(c1-c18)基團(tuán)，二價或三價環(huán)烷基或雜環(huán)烷基-烷基(c1-c18)基團(tuán)，或二價或三價(c2-c18)不飽和的烷基基團(tuán)，其中雜芳基優(yōu)選是呋喃基、噻吩基，n-甲基吡咯基、吡啶基、n-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基。喹啉基、異喹啉基、n-甲基咔唑基、氨基豆素基、或吩嗪基、并且其中如果sp是三價基團(tuán)，那么sp還可以由低級(c1-c5)二烷基氨基、低級(c1-c5)烷氧基、羥基、或低級(c1-c5)烷硫基任選取代；且，q是＝nhnco-、＝nhncs-、＝nhnconh-、＝nhncsnh-或＝nho-。優(yōu)選地，alk1是分支或不分支的(c1-c5)亞烷基鏈，sp1是鍵、-s-、-o-、-conh-、-nhco-或-nr’,其中r’如上文定義，條件是當(dāng)alk1是鍵時，sp1是鍵；ar是由(c1-c6)烷基、(c1-c5)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-o(ch2)ncoor’、-s(ch2)ncoor’、-o(ch2)nconhr’或-s(ch2)nconhr’的1、2或3個基團(tuán)任選取代的1,2-、1,3-或1,4-亞苯基，其中n和r’如上文定義，或ar是各自由c1-c6)烷基、(c1-c5)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-o(ch2)ncoor’、-s(ch2)ncoor’、-o(ch2)nconhr’或-s(ch2)nconhr’的1、2、3或4個基團(tuán)任選取代的1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亞萘基。z1是(c1-c5)烷基、或由(c1-c5)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-coor’、-conhr’、-o(ch2)ncoor’、-s(ch2)ncoor’、-o(ch2)nconhr’或-s(ch2)nconhr’的1、2、或3個基團(tuán)任選取代的苯基；alk2和sp2均為鍵；且sp和q如僅在上文中所定義的。上述的鍵的含義為共價鍵。所述l優(yōu)選為馬來酰亞胺基己酰(maleimidocaproyl，mc)、馬來酰亞胺基己酰-l-纈氨酸-l-瓜氨酸對氨基芐醇(mc-vc-pab)或4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(smcc)。所述d為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞毒劑，較佳地選自細(xì)胞毒素、化學(xué)治療劑、放射性同位素、治療性核酸、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗增殖促凋亡劑或細(xì)胞溶解酶。其中，所述細(xì)胞毒素為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞毒素，一般指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的活性劑。較佳地選自抗生素、微管蛋白聚合的抑制劑、烷化劑、蛋白合成抑制劑、蛋白激酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蛋白激酶、磷酸酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶或細(xì)胞周期蛋白。更佳地選自多柔比星、柔紅霉素、依達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾加霉素、美諾立爾、吡柔比星、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉屈濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌呤霉素、替加氟、噻唑羧胺核苷、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、博來霉素、氮芥、強的松、甲基芐肼、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素類似物、鉑類(如順鉑和卡鉑)、絲裂霉素、噻替派、紫杉烷、道諾紅菌素、放線菌素、安曲霉素、氮絲氨酸、它莫西芬、多拉司他汀、奧瑞他汀及其衍生物、哈米特林、埃斯波霉素或美登素類化合物，最佳地選自甲基奧瑞他汀e(mmae)、甲基奧瑞他汀f(mmaf)或n2’-脫乙酰-n2’-3-巰基-1氧代丙基-美登素(dm1)。其中，所述化學(xué)治療劑為本領(lǐng)域常規(guī)的化學(xué)治療劑，較佳地選自烷化劑、烷基磺酸酯類化學(xué)治療劑、氮丙啶類化學(xué)治療劑、乙烯酰胺類和甲基密胺類化學(xué)治療劑、氮芥、硝基脲類化學(xué)治療劑、抗生素、抗代謝物、葉酸類化學(xué)治療劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、雄激素、抗腎上腺素、葉酸補充劑、美登醇、多糖復(fù)合物、紫杉烷、鉑類似物或類視黃醇，或者，其在藥學(xué)上可接受的鹽、酸和衍生物。所述的烷化劑為本領(lǐng)域常規(guī)的烷化劑，較佳地選自噻替派或環(huán)磷酰胺。所述的烷基磺酸酯類化學(xué)治療劑為本領(lǐng)域常規(guī)的烷基磺酸酯類化學(xué)治療劑，較佳地選自白消安、英丙舒凡或哌泊舒凡。所述的氮丙啶類化學(xué)治療劑為本領(lǐng)域常規(guī)的氮丙啶類化學(xué)治療劑，較佳地選自氮丙唳如、卡巴醌、美妥替哌或烏瑞替派。所述乙烯酰胺類和甲基密胺類化學(xué)治療劑為本領(lǐng)域常規(guī)的乙烯酰胺類和甲基密胺類化學(xué)治療劑，較佳地選自六甲蜜胺、三乙撐蜜胺、三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺或三羥甲蜜胺。所述的氮芥為本領(lǐng)域常規(guī)的氮芥，較佳地選自苯丁酸氮芥、萘氮芥、雌氮芥(estramustine)、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氧氮芥鹽酸鹽、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼氮芥、曲磷胺或尿嘧啶氮芥。所述硝基脲類化學(xué)治療劑為本領(lǐng)域常規(guī)的硝基脲類化學(xué)治療劑，較佳地選自卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀或雷莫司汀。所述抗生素為本領(lǐng)域常規(guī)的抗生素，較佳地選自阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c、加力車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依達(dá)比星、發(fā)波霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、靜司他丁或佐柔比星。所述的抗代謝物為本領(lǐng)域常規(guī)的抗代謝物，較佳地選自氨甲喋呤或5-氟尿嘧啶(5-fu)。所述的葉酸類化學(xué)治療劑為本領(lǐng)域常規(guī)的葉酸類化學(xué)治療劑，較佳地選自二甲葉酸、蝶羅呤或三甲曲沙。所述的嘌呤類似物為本領(lǐng)域常規(guī)的嘌呤類似物，較佳地選自氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤或硫鳥嘌呤。所述的嘧啶類似物為本領(lǐng)域常規(guī)的嘧啶類似物，較佳地選自安西他濱、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷或5-eu。所述的雄激素為本領(lǐng)域常規(guī)的雄激素，較佳地選自卡普睪酮、丙酸甲雄烷酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷或睪內(nèi)酯。所述的抗腎上腺素為本領(lǐng)域常規(guī)的抗腎上腺素，較佳地選自安魯米特、米托坦或曲洛司坦。所述的葉酸補充劑為本領(lǐng)域常規(guī)的葉酸補充劑，較佳地選自亞葉酸、醋葡全內(nèi)酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依達(dá)曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鳥氨酸、依利醋銨、埃坡西龍、依托格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖或氯尼達(dá)明。所述的美登醇為本領(lǐng)域常規(guī)的美登醇，較佳地選自美登素、安絲菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌達(dá)醇、二胺硝吖啶、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼或丙卡巴肼。所述的多糖復(fù)合物為本領(lǐng)域常規(guī)的多糖復(fù)合物，較佳地選自雷佐生、根霉素、西佐喃、鍺螺胺、細(xì)交鏈孢菌酮酸、三亞胺醌2，2′，2″-三氯三乙胺、單端孢霉烯族毒素、烏拉坦、長春地辛、達(dá)卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺或噻替派。更佳地選自t-2毒素、疣孢菌素a、桿孢菌素a或anguidine。所述紫杉烷為本領(lǐng)域常規(guī)的紫杉烷，較佳地選自紫杉醇、無氫化蓖麻油、紫杉醇的白蛋白工程化納米顆粒制劑(americanpharmaceuticalpartners，schaumberg，illinois)、多西他賽、苯丁酸氮芥、吉西他濱、6-硫代鳥嘌呤、巰嘌呤或甲氨蝶呤。所述的鉑類似物為本領(lǐng)域常規(guī)的鉑類似物，較佳地選自順鉑、卡鉑、長春堿、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、長春新堿、諾安托、替尼泊苷、依達(dá)曲沙、道諾霉素、氨基蝶呤、卡培他濱伊班膦酸鹽、cpt-11、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑rfs2000或二氟甲基鳥氨酸。所述的類視黃醇為本領(lǐng)域的類視黃醇，較佳地為視黃酸。其中，所述放射性同位素為本領(lǐng)域常規(guī)的放射性同位素，較佳地，其與上述蛋白質(zhì)直接結(jié)合，或者通過螯合劑與上述蛋白質(zhì)結(jié)合。更佳地，其與所述蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基直接結(jié)合。較佳地，所述放射性同位素選自適于放射治療的α-發(fā)射體、β-發(fā)射體和俄歇電子以及適于診斷的正電子發(fā)射體或γ-發(fā)射體。更佳地，所述放射性同位素選自18氟、64銅、65銅。67鎵、68鎵、77溴、80m溴、95釕、97釕、103釕、105釕、99m锝、107汞、203汞、123碘、124碘、125碘、126碘、131碘、133碘、111銦、113銦、99m錸、105錸、101錸、186錸、188錸、121m碲、99锝、122m碲、125m碲、165銩、167銩、168銩、90釔、213鉍、213鉛或225錒，或者其衍生的氮化物或氧化物。其中，所述治療性核酸為本領(lǐng)域常規(guī)的核酸，較佳地為編碼免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗增殖劑或促凋亡劑的基因。所述治療劑包括所述治療劑、其衍生物和所述治療劑在藥學(xué)上可接受的鹽、酸及衍生物。其中，所述的免疫調(diào)節(jié)劑為本領(lǐng)域常規(guī)的免疫調(diào)節(jié)劑，即引發(fā)免疫應(yīng)答，包括體液免疫應(yīng)答(例如抗原特異性抗體的產(chǎn)生)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(例如淋巴細(xì)胞增殖)的試劑。較佳地選自細(xì)胞因子、生長因子、激素、抗激素藥、免疫抑制劑或皮質(zhì)類固醇。所述細(xì)胞因子為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞因子，較佳地選自黃嘌呤、白介素或干擾素。所述的生長因子為本領(lǐng)域常規(guī)的生長因子，較佳地選自tnf、csf、gm-csf或g-csf。所述的激素為本領(lǐng)域常規(guī)的激素，較佳地選自雌激素、雄激素或孕激素。更佳地，所述的雌激素為已烯雌酚或雌二醇。更佳地，所述的雄激素為睪酮或氟甲睪酮。更佳地，所述的孕激素為乙酸甲地孕酮或乙酸甲羥孕酮。所述的皮質(zhì)類固醇為本領(lǐng)域常規(guī)的皮質(zhì)類固醇，較佳地選自強的松、地塞米松或化可的松。所述抗激素藥為本領(lǐng)域常規(guī)的抗激素藥，其能阻斷激素對腫瘤的作用，抑制細(xì)胞因子生產(chǎn)，下調(diào)自身抗原表達(dá)、或掩蔽mhc抗原的免疫抑制劑。較佳地選自抗雌激素藥、抗雄激素藥或抗腎上腺素藥。更佳地，所述抗雌激素藥選自它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑類、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬或托瑞米芬。所述抗雄激素藥選自氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林或戈舍瑞林。所述免疫抑制劑為本領(lǐng)域常規(guī)的免疫抑制劑，較佳地選自2-氨基-6芳基-5取代的嘧啶類、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、溴隱亭、達(dá)那唑、氨苯砜、戊二醛、針對mhc抗原和mhc片段的抗獨特型抗體、環(huán)孢菌素a、類固醇例如糖皮質(zhì)類固醇、鏈激酶、tgfb、雷帕霉素、t細(xì)胞受體、t細(xì)胞受體片段、細(xì)胞因子受體拮抗劑或t細(xì)胞受體抗體。更佳地，所述細(xì)胞因子受體拮抗劑選自抗干擾素抗體、抗il10抗體、抗tnfa抗體或抗il2抗體。其中，所述的抗血管生成劑為本領(lǐng)域常規(guī)的抗血管生成劑，較佳地選自法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、cox-2抑制劑、vegf抑制劑、bfgf抑制劑、類固醇硫酸酯酶抑制劑、白介素-24、凝血栓蛋白、metallospondin蛋白質(zhì)、i類干擾素、白介素12、魚精蛋白、血管他丁、層粘連蛋白、內(nèi)皮他丁或催乳激素片段。更佳地為2-甲氧基雌二醇二氨基磺酸酯(2-meoe2bismate)。其中，所述抗增殖促凋亡劑為本領(lǐng)域常規(guī)的抗增殖促凋亡劑，較佳地選自ppar-γ激活劑、類視黃醇、三萜類化合物、egf受體抑制劑、端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑、鐵螯合劑、凋亡蛋白、bcl-2和bcl-x(l)的抑制劑、tnf-α/fas配體/tnf相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體及其信號傳導(dǎo)的激活物或pi3k-akt存活途徑信號抑制劑。所述ppar-γ激活劑為本領(lǐng)域常規(guī)的ppar-γ激活劑，較佳地為環(huán)戊烯酮前列腺素(cypgs)。所述三萜類化合物為本領(lǐng)域常規(guī)的三萜類化合物，較佳地選自環(huán)菠蘿蜜烷、羽扇豆烷、烏蘇烷、齊敦果烷、木栓烷、達(dá)瑪烷、葫蘆素、檸檬苦素類似物或三萜類化合物。所述egf受體抑制劑為本領(lǐng)域常規(guī)的egf受體抑制劑，較佳地選自her4、雷帕霉素或1，25-二羥基膽鈣化醇(維生素d)。所述的鐵螯合物為本領(lǐng)域常規(guī)的鐵螯合物，較佳地為3-氨基吡啶-2-甲醛硫代縮氨基脲。所述的凋亡蛋白為本領(lǐng)域常規(guī)的凋亡蛋白，較佳地為雞貧血病病毒的病毒蛋白質(zhì)3-vp3。所述pi3k-akt存活途徑信號抑制劑為本領(lǐng)域常規(guī)的pi3k-akt存活途徑信號抑制劑，較佳地為ucn-01或格爾德霉素。其中，所述細(xì)胞溶解酶為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞溶解酶，較佳地為rna酶。本發(fā)明優(yōu)選地，式1中x＝y(tǒng)＝n；由此在一個優(yōu)選實施例中，-(l)x-(d)y為：其中m為1～10，優(yōu)選m為5。在一個優(yōu)選實施例中，-(l)x-(d)y為：在一個優(yōu)選實施例中，-(l)x-(d)y為：最佳地，所述d為微管蛋白合成酶抑制劑——甲基奧瑞他汀f(mmaf)，且所述接頭l為馬來酰亞胺基己酰(maleimidocaproyl，mc)，所述免疫偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如式3所示，或者，所述l為4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯；d為n2’-脫乙酰-n2’-3-巰基-1氧代丙基)-美登素(dm1)，所述免疫偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如式4所示，或者，l為馬來酰亞胺基己酰-l-纈氨酸-l-瓜氨酸對氨基芐醇，d為甲基奧瑞他汀e(mmae)，所述免疫偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如式5所示，其中，n為自然數(shù)，優(yōu)選為1～20的整數(shù)，更優(yōu)選為1～2，或2～4，或4～8，或8～20的整數(shù)。所述的免疫偶聯(lián)物的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地采用doronina，2006，bioconjugatechem.17,114-124所記載的制備方法。較佳地，所述的制備方法產(chǎn)生具有最低限度的低偶聯(lián)級分(lcf)小于10％的免疫偶聯(lián)物。更佳地，所述的制備方法包括以下的步驟：將上述蛋白質(zhì)經(jīng)過ph6.5～8.5的硼酸鈉緩沖液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(tcep)，其中tcep與上述蛋白質(zhì)的摩爾比比率為2～10，室溫下還原1～4小時，得反應(yīng)液a。將反應(yīng)液a洗脫去除多余的上述蛋白質(zhì)得反應(yīng)液b。向反應(yīng)液b中加入mc-mmaf，其中mc-mmaf與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為5～20，10～37℃下反應(yīng)4小時。所述的免疫偶聯(lián)物能夠以本領(lǐng)域所知的任何物理形態(tài)而存在，較佳地為澄清溶液。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包括上述的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)可接受的載體。所述的藥學(xué)可接受的載體為本領(lǐng)域常規(guī)的載體，所述的載體可以為任意合適的生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領(lǐng)域常規(guī)的藥物輔料，較佳地包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組合物包括0.01～99.99％的上述蛋白質(zhì)和0.01～99.99％的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的質(zhì)量百分比。較佳地，所述的藥物組合物是抗腫瘤的藥物。更佳地為抗鱗狀/腺瘤性肺癌(非小細(xì)胞肺癌)、浸潤性乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、鱗狀宮頸癌、浸潤性子宮內(nèi)膜腺癌、浸潤性胰腺癌、卵巢癌、鱗狀膀胱癌、絨毛膜癌、支氣管癌、乳腺癌、子宮頸癌、胰腺癌或精囊癌的藥物。本發(fā)明所述的藥物組合物的給藥途徑較佳地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內(nèi)注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組合物為本領(lǐng)域常規(guī)的各種劑型，較佳地為固體、半固體或液體的形式，即可以為水溶液、非水溶液或混懸液，更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。更佳地為經(jīng)由血管內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用。較佳地，所述藥物組合物還可以作為氣霧劑或粗噴霧劑施用，即經(jīng)鼻施用；或者，鞘內(nèi)、髓內(nèi)或心室內(nèi)施用。更佳地，所述的藥物組合物還可以透皮、經(jīng)皮、局部、腸內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或經(jīng)直腸施用。本發(fā)明所述的藥物組合物的給藥劑量水平可以根據(jù)達(dá)到所需診斷或治療結(jié)果的組合物量而調(diào)整。施用方案也可以為單次注射或多次注射，或進(jìn)行調(diào)整。所選擇的劑量水平和方案依賴于包括所述藥物組合物的活性和穩(wěn)定性(即，半衰期)、制劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病癥、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫(yī)療史等各種因素而進(jìn)行合理地調(diào)整。對于本發(fā)明的所述藥物組合物的治療有效劑量可以最初在細(xì)胞培養(yǎng)實驗或動物模型例如嚙齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進(jìn)行估計。動物模型也可以用于測定合適的施用濃度范圍和途徑。隨后可以用于確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調(diào)整以及何時和如何進(jìn)行此類調(diào)整的評估為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。對于組合療法，上述蛋白質(zhì)、上述免疫偶聯(lián)物和/或另外的治療或診斷劑可以各自作為單一藥劑，在適合于執(zhí)行預(yù)期治療或診斷的任何時間范圍內(nèi)進(jìn)行使用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即作為單一制劑或在數(shù)分鐘或數(shù)小時內(nèi))或以按順序連續(xù)施用。例如，這些單一藥劑可以在一年內(nèi)，或10、8、6、4或2個月內(nèi)，或4、3、2、或1周內(nèi)，或5、4、3、2或1天內(nèi)施用。關(guān)于制劑、劑量、施用方案和可測量的治療結(jié)果的另外指導(dǎo)，參見berkow等人(2000)themerckmanualofmedicalinformation(merck醫(yī)學(xué)信息手冊)和merck&co.inc.,whitehousestation,newjersey；ebadi(1998)crcdeskreferenceofclinicalpharmacology(臨床藥理學(xué)手冊)等著作。本發(fā)明提供一種上述的蛋白質(zhì)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種上述的免疫偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種上述的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種上述的蛋白質(zhì)在治療腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種上述的免疫偶聯(lián)物在治療腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種上述的藥物組合物在治療腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種檢測過表達(dá)tpbg蛋白的細(xì)胞的方法，包括如下的步驟：上述的蛋白質(zhì)與待檢樣品在體外接觸，檢測上述的蛋白質(zhì)與所述待檢樣品的結(jié)合即可。所述的過表達(dá)的含義為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為待檢樣品中，細(xì)胞經(jīng)過流式檢測，上述的蛋白質(zhì)的平均熒光密度(mfi)值是亞型igg的mfi值的3倍及以上。所述結(jié)合的檢測方式是本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方式，較佳地為facs檢測。本發(fā)明所述的“tpbg陽性”的細(xì)胞即為過表達(dá)tpbg蛋白的細(xì)胞，如nci-h1568細(xì)胞株；反之，則稱為“tpbg陰性”的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞系nci-h1770。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明所述的tpbg抗體是一嵌合抗體，其與tpbg蛋白具有高度親和力，能夠在蛋白水平和細(xì)胞水平結(jié)合tpbg蛋白受體的胞外區(qū)。所述的tpbg抗體與如mc-mmaf的小分子化合物偶聯(lián)后得到一偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物能夠有效地對tpbg陽性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒殺傷作用。此外，tpbg抗體能把小分子化合物，如mmaf，通過內(nèi)吞作用帶入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)降解釋放小分子化合物，從而起到細(xì)胞毒殺傷作用。因此所述的tpbg抗體制備的抗體交聯(lián)藥，能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞，治療腫瘤。附圖說明圖1為人tpbg蛋白轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞facs篩選檢測結(jié)果。圖2為人tpbg蛋白轉(zhuǎn)染的chok1細(xì)胞facs篩選檢測結(jié)果。圖3為食蟹猴tpbg蛋白轉(zhuǎn)染的chok1細(xì)胞facs篩選檢測結(jié)果。圖4為小鼠tpbg蛋白轉(zhuǎn)染的chok1細(xì)胞facs篩選檢測結(jié)果。圖5為elisa檢測tpbg免疫后小鼠血清抗體效價情況。圖6a和圖6b為elisa檢測tpbg抗體與人tpbg-hfc蛋白的結(jié)合反應(yīng)。圖7a和圖7b為facs檢測tpbg抗體與chok1-htpbg的結(jié)合反應(yīng)。圖8a和圖8b為facs檢測tpbg抗體與chok1-ctpbg的結(jié)合反應(yīng)。圖9a和圖9b為facs檢測tpbg抗體與chok1-mtpbg的結(jié)合反應(yīng)。圖10a和圖10b為facs檢測tpbg抗體與chok1的結(jié)合反應(yīng)。圖11a和圖11b為tpbg抗體-mmaf抗體交聯(lián)藥對tpbg表達(dá)陽性非小肺癌細(xì)胞株nci-h1568的細(xì)胞殺傷作用。圖11c為tpbg抗體對tpbg表達(dá)陽性非小肺癌細(xì)胞株nci-h1568的細(xì)胞殺傷作用。圖12a和圖12b為tpbg抗體-mmaf抗體交聯(lián)藥對tpbg表達(dá)陰性非小肺癌細(xì)胞株nci-h1770的細(xì)胞殺傷作用。圖13為tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1299的細(xì)胞殺傷作用。圖14a為tpbg嵌合抗體12b12的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的腫瘤體積變化圖。圖14b為tpbg嵌合抗體5g4的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的腫瘤體積變化圖。圖14c為tpbg嵌合抗體39a11的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的腫瘤體積變化圖。圖14d為tpbg嵌合抗體28d4的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的腫瘤體積變化圖。圖14e為tpbg嵌合抗體36a10的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的腫瘤體積變化圖。圖15a為tpbg嵌合抗體12b12的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的小鼠體重變化圖。圖15b為tpbg嵌合抗體5g4的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的小鼠體重變化圖。圖15c為tpbg嵌合抗體39a11的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的小鼠體重變化圖。圖15d為tpbg嵌合抗體28d4的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的小鼠體重變化圖。圖15e為tpbg嵌合抗體36a10的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的小鼠體重變化圖。圖16a和16b分別為tpbg嵌合抗體12b12及其偶聯(lián)了不同的小分子藥的抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1299的細(xì)胞殺傷作用。圖16c和16d分別為tpbg嵌合抗體12b12及其偶聯(lián)了不同的小分子藥的抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1568的細(xì)胞殺傷作用。圖17a和17b為tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的表達(dá)tpbg的293-htpbg穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的細(xì)胞殺傷作用。圖17c和17d為tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對不表達(dá)tpbg的293細(xì)胞株的，細(xì)胞殺傷作用。具體實施方式下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例中所述的室溫為本領(lǐng)域常規(guī)的室溫，一般為10～30℃。若無特別說明，實施例中所述的pbs為pbs磷酸緩沖液，ph7.2。實施例1tpbg抗體的制備將含有編碼人源tpbg蛋白胞外區(qū)氨基酸序列32-355(ser32-ser355)(其中，編碼人源tpbg蛋白的核苷酸序列在genebank的編號為genebankid:aah37161.1)的核苷酸序列克隆到帶有人iggfc片段(hfc)的pcpc載體(購自invitrogen，v044-50)并按已建立的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備質(zhì)粒。具體方法參見sambrook,j.,fritsch,e.f.,andmaniatis,t.(1989).molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition(plainview,newyork:coldspringharborlaboratorypress)。對hek293細(xì)胞(購自invitrogen)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染(聚醚酰亞胺pei，購自polysciences)并使用freestyletm293(購自invitrogen)在37℃下進(jìn)行擴大培養(yǎng)。4天后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞成分，得含tpbg蛋白胞外區(qū)的培養(yǎng)上清液。將培養(yǎng)上清液上樣到蛋白a親和層析柱(mabselectsure，購自gehealthcare)，同時用紫外(uv)檢測儀監(jiān)測紫外吸收值(a280nm)的變化。上樣后用pbs磷酸鹽緩沖液(ph7.2)清洗蛋白a親和層析柱直到紫外吸收值回到基線，然后用0.1m甘氨酸鹽酸(ph2.5)洗脫，收集從蛋白a親和層析柱上洗脫下來的帶hfc標(biāo)簽的tpbg蛋白(即人源tpbg-hfc)。用pbs磷酸鹽緩沖液(ph7.2)在4℃冰箱透析過夜。透析后的蛋白經(jīng)0.22微米無菌過濾后分裝于-80℃保存，即獲得純化的免疫原a。免疫原a在使用前需要進(jìn)行一系列質(zhì)控檢測，如檢測其蛋白濃度、純度、分子量、生物活性等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫原a各項指標(biāo)良好，能夠作為抗原進(jìn)行后續(xù)制備tpbg抗體的試驗。(二)、免疫原b的制備編碼人源tpbg全長氨基酸序列的核苷酸序列(其中，編碼人源tpbg蛋白的核苷酸序列在genebank的編號為genebankid:aah37161.1)被克隆到pires載體(購自clontech)并制備質(zhì)粒。對hek293細(xì)胞系和chok1細(xì)胞系(均購自invitrogen)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(pei，購自polysciences)后，在含0.5μg/ml的含10％(w/w)胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中選擇性培養(yǎng)2周，用有限稀釋法在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆，并置于37℃、5％(v/v)co2培養(yǎng)，大約2周后選擇部分單克隆孔擴增到6孔板中。對擴增后的克隆用已知的tpbg抗體(購自sigma，貨號#sab1404485)經(jīng)流式細(xì)胞分析法進(jìn)行篩選。選擇長勢較好、熒光強度較高、單克隆的細(xì)胞系繼續(xù)擴大培養(yǎng)并液氮凍存，即獲得免疫原b。具體選擇結(jié)果如表3和圖1所示，igg亞型對照為小鼠igg對照。表3說明，已經(jīng)制得一系列tpbg陽性表達(dá)的hek293細(xì)胞系。圖1中，橫坐標(biāo)為細(xì)胞熒光強度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。圖1的結(jié)果說明，5e5e9為tpbg高水平表達(dá)細(xì)胞株，其中抗tpbg抗體標(biāo)記的細(xì)胞平均細(xì)胞熒光密度為216，遷移率為98.5％。表3人源tpbg蛋白轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞facs篩選檢測結(jié)果(三)、雜交瘤細(xì)胞的制備和抗體篩選a、免疫原a免疫采用6～8周齡balb/canncrl小鼠或sjl/jorllcocrl小鼠(均購自上海斯萊克公司)，小鼠在spf條件下飼養(yǎng)。初次免疫時，免疫原a用弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射0.25ml，即每只小鼠注射50μg免疫原a蛋白。加強免疫時，免疫原a用弗氏不完全佐劑乳化后腹腔注射0.25ml，即每只小鼠注射50微克免疫原a。初次免疫與第一次加強免疫之間間隔2周，以后每次加強免疫之間間隔3周。每次加強免疫1周后采血，用elisa和facs檢測血清中免疫原a的抗體效價和特異性，結(jié)果如圖5和表4所示。表4說明，經(jīng)免疫原a免疫的小鼠的免疫后血清對免疫原a均有不同程度的結(jié)合，呈現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)，其中最高稀釋度在一百萬左右。其中空白對照為1％(w/w)bsa，其中批次指第二次加強免疫后第七天的小鼠血清，表中的數(shù)據(jù)為od450nm值。表4elisa檢測tpbg蛋白免疫后balb/c小鼠血清抗體效價b、免疫原b免疫采用6～8周齡balb/canncrl小鼠或sjl/jorllcocrl小鼠(均購自上海斯萊克公司)，小鼠在spf條件下飼養(yǎng)。含有編碼人源tpbg全長氨基酸序列的核苷酸序列的pires質(zhì)粒[參見實施例1步驟(二)]轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞系，得含有人源tpbg的hek293穩(wěn)定細(xì)胞系(轉(zhuǎn)染使用x-tremegenehpdnatransfectionreagent，購自roche公司，貨號cat#06366236001，并按說明書操作)。在t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)至90％匯合度，吸盡培養(yǎng)基，用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(購自invitrogen)洗滌2次，然后用無酶細(xì)胞解離液(購自invitrogen)37℃處理直至細(xì)胞從培養(yǎng)皿壁上可脫落，收集細(xì)胞。用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌2次，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液稀釋至2╳107細(xì)胞每ml。每只小鼠每次免疫時腹腔注射0.5ml細(xì)胞懸液。第一次與第二次免疫之間間隔2周，以后每次免疫間隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用facs檢測血清中抗體效價和特異性。在第二次加強免疫后，facs檢測血清抗體效價達(dá)到1:1000以上。a～b步驟完成前，將所選擇的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射100微克純化的免疫原a(針對免疫原a進(jìn)行免疫反應(yīng)的小鼠)或含有人源tpbg的hek293穩(wěn)定細(xì)胞系(針對免疫原b進(jìn)行免疫反應(yīng)的小鼠)，5天后處死小鼠，收集脾細(xì)胞。加入nh4oh至終濃度1％(w/w)，裂解脾細(xì)胞中參雜的紅細(xì)胞，獲得脾細(xì)胞懸液。用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基1000轉(zhuǎn)每分鐘離心清洗細(xì)胞3次，然后按照活細(xì)胞數(shù)目5:1比率與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0(購自atcc)混合，采用高效電融合方法(參見methodsinenzymology,vol.220)進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞稀釋到含20％(w/w)胎牛血清、1╳hat的dmem培養(yǎng)基中。然后按1╳105/200微升每孔加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入5％(v/v)co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。14天后用elisa和acumen(微孔板細(xì)胞檢測法)篩選細(xì)胞融合板上清，將elisa中od450nm>1.0和acumen中mfi值>100的陽性克隆擴增到24孔板，在含10％(w/w)ht胎牛血清的dmem(invitrogen)中，于37℃、5％(v/v)co2條件下擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后取24孔板中擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，收集上清液，對上清液進(jìn)行抗體亞型分析，用elisa、facs確定對tpbg蛋白和tpbg陽性細(xì)胞的結(jié)合活性(結(jié)合活性的檢測方法分別參見實施例3a和實施例3b中的相關(guān)內(nèi)容)，以及小鼠源tpbg抗體-mmaf間接細(xì)胞毒殺傷實驗(間接細(xì)胞毒殺傷活性檢測方法參見實施例4中的相關(guān)內(nèi)容)。根據(jù)24孔板篩選結(jié)果，挑選elisa實驗中od450nm>1.0、facs實驗中mfi值>50和間接細(xì)胞毒殺傷實驗中雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對tpbg陽性細(xì)胞殺傷率達(dá)到50％的雜交瘤細(xì)胞為符合條件的陽性克隆，選擇符合條件的雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法在96孔板進(jìn)行亞克隆，在含10％(w/w)fbs的dmem培養(yǎng)基中(購自invitrogen)37℃、5％(v/v)co2條件下培養(yǎng)。亞克隆后10天用elisa和acumen進(jìn)行初步篩選，挑選單個陽性單克隆擴增到24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。3天后用facs確定抗原結(jié)合陽性并用小鼠源tpbg抗體-mmaf間接細(xì)胞毒殺傷實驗評估生物活性，評估標(biāo)準(zhǔn)為elisa實驗中od450nm>1.0、facs實驗中mfi值>50和間接細(xì)胞毒殺傷實驗中雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對tpbg陽性細(xì)胞殺傷率達(dá)到50％及以上。根據(jù)24孔板樣品檢測結(jié)果，挑選出最優(yōu)的克隆，并于含10％(w/w)fbs的dmem培養(yǎng)基中(購自invitrogen)在37℃、5％(v/v)co2條件下將該最優(yōu)的克隆進(jìn)行擴大培養(yǎng)，液氮凍存即得本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞，并可用于后續(xù)的獲得先導(dǎo)抗體、生產(chǎn)和純化抗體。實施例2先導(dǎo)抗體的生產(chǎn)和純化雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體濃度較低，大約僅1-10μg/ml，濃度變化較大。且培養(yǎng)基中細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的多種蛋白和培養(yǎng)基所含胎牛血清成分對很多生物活性分析方法都有不同程度的干擾，因此需要進(jìn)行小規(guī)模(1-5mg)抗體生產(chǎn)純化。將實施例1所得的雜交瘤細(xì)胞接種到t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶并用生產(chǎn)培養(yǎng)基(hybridomaserumfreemedium，購自invitrogen公司)馴化傳代3代。待其生長狀態(tài)良好，接種細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶。每個2升的培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中加入200ml生產(chǎn)培養(yǎng)基，接種細(xì)胞密度為1.0╳105/ml。蓋緊瓶蓋，將轉(zhuǎn)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中的轉(zhuǎn)瓶機上，轉(zhuǎn)速3轉(zhuǎn)/分鐘。連續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)14天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，過濾去除細(xì)胞，并用0.45μm的濾膜過濾至培養(yǎng)上清液澄清，得澄清的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。澄清的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液可立即進(jìn)行純化或于-30℃凍存。將獲得的的培養(yǎng)上清液(200ml)中的tpbg抗體用2ml蛋白a柱(購自gehealthcare)純化。蛋白g柱先用平衡緩沖液(pbs磷酸緩沖液，ph7.4)平衡，然后將培養(yǎng)上清液上樣到蛋白a柱，控制流速在3ml/分鐘。上樣完畢后用平衡緩沖液清洗蛋白g柱，平衡緩沖液的體積為蛋白a柱柱床體積的4倍。用洗脫液(0.1m檸檬酸鈉緩沖液，ph3.5)洗脫結(jié)合在蛋白a柱上的tpbg抗體，用紫外檢測器監(jiān)測洗脫情況(a280nm紫外吸收峰)。收集洗脫的抗體，加入10％(v/v)1.0mtris-hcl緩沖液中和ph，然后立即用pbs磷酸緩沖液透析過夜，第二天換液1次并繼續(xù)透析3小時。收集透析后的tpbg抗體，用0.22μm的濾器進(jìn)行無菌過濾，無菌保存，即得純化的tpbg抗體。將純化的tpbg抗體進(jìn)行蛋白濃度(a280nm/1.4)、純度、內(nèi)毒(lonza試劑盒)等檢測分析，結(jié)果如表5所示，表5說明，抗體最終產(chǎn)品內(nèi)毒素濃度在1.0eu/mg以內(nèi)。表5純化的tpbg抗體檢測分析實施例3先導(dǎo)抗體的檢定a、酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)檢測tpbg抗體與tpbg蛋白的結(jié)合對實施例2所得的純化的tpbg抗體進(jìn)行與人源tpbg-hfc蛋白(免疫原a)進(jìn)行反應(yīng)。將實施例1獲得的純化的免疫原a(其制備方法參見實施例1步驟(一)用pbs稀釋到終濃度1.0μg/ml，然后以100μl每孔加到96孔elisa板。用塑料膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液[含0.01％(v/v)tween20的pbs]洗板2次，加入封閉液[含0.01％(v/v)tween20和1％(w/w)bsa的pbs]室溫封閉2小時。倒掉封閉液，加入實施例2所得的純化的tpbg抗體100μl每孔。37℃孵育2小時后，用洗板液[含0.01％(v/v)tween20的pbs]洗板3次。加入hrp(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的二抗(購自sigma)，37℃孵育2小時后，用洗板液[含0.01％(v/v)tween20的pbs]洗板3次。加入tmb底物100μl每孔，室溫孵育30分鐘后，加入終止液(1.0nhcl)100μl每孔。用elisa讀板機(spectramax384plus，購自moleculardevice)讀取a450nm數(shù)值，結(jié)果如圖6和表6所示，表6說明，純化的tpbg抗體與tpbg重組蛋白在elisa水平結(jié)合。表6中igg對照為對照小鼠igg，表中的數(shù)據(jù)為od450nm值，blank的含義為板中只有pbs緩沖液時的od450nm值。表6elisa檢測tpbg抗體與人tpbg-hfc蛋白的結(jié)合反應(yīng)b、流式細(xì)胞實驗(facs)檢測tpbg抗體與tpbg表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合將實施例1步驟(二)中所述含有編碼人源tpbg全長氨基酸序列的核苷酸序列的pires質(zhì)粒轉(zhuǎn)染chok1細(xì)胞株得含人源tpbg的chok1穩(wěn)定細(xì)胞株(此處稱為chok1-hpd1穩(wěn)定細(xì)胞株)。類似地，將帶有猴源tpbg全長基因的pires質(zhì)粒(其制備方法與實施例1步驟(一)“免疫原a的制備”中帶有人源iggfc片段(hfc)的pcpc載體的制備方法相同，食蟹猴tpbg全長氨基酸序列(genebankid:bae00432.1)轉(zhuǎn)染chok1細(xì)胞株得含猴tpbg的chok1穩(wěn)定細(xì)胞株(此處稱為chok1-ctpbg穩(wěn)定細(xì)胞株)。將帶有小鼠源tpbg全長基因的pires質(zhì)粒(其制備方法與實施例1步驟(一)“免疫原a的制備”中帶有人源iggfc片段(hfc)的pcpc載體的制備方法相同，小鼠tpbg全長氨基酸序列(genebankid:caa09931.1)轉(zhuǎn)染chok1細(xì)胞株得含小鼠tpbg的chok1穩(wěn)定細(xì)胞株(此處稱為chok1-mtpbg穩(wěn)定細(xì)胞株)。用facs檢測血清中tpbg抗體的效價和特異性，檢測方法參見實施例1步驟(二)“免疫原b的制備”中鑒定hek293-htpbg穩(wěn)定細(xì)胞株的方法。檢測結(jié)果如表7和圖2～4所示，圖2～4中橫坐標(biāo)為細(xì)胞熒光強度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。其中，chok1-htpbg3a2f1為用來篩選的人tpbg表達(dá)細(xì)胞株,其facs篩選檢測結(jié)果如圖2所示；chok1-ctpbg3f13g4為用來篩選的食蟹猴tpbg表達(dá)細(xì)胞株，其facs篩選檢測結(jié)果如圖3所示；chok1-mtpbg3a3為用來篩選的小鼠tpbg表達(dá)細(xì)胞株，其facs篩選檢測結(jié)果如圖4所示。表7的結(jié)果說明，chok1-htpbg穩(wěn)定細(xì)胞株、chok1-ctpbg穩(wěn)定細(xì)胞株和chok1-mtpbg穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞膜上分別過表達(dá)人、猴或小鼠的tpbg蛋白，其可以用于篩選tpbg抗體。表7人/猴/小鼠tpbg轉(zhuǎn)染的chok1細(xì)胞facs篩選檢測結(jié)果將chok1-htpbg穩(wěn)定細(xì)胞株、chok1-ctpbg穩(wěn)定細(xì)胞株、chok1-mtpbg穩(wěn)定細(xì)胞株(即表7所示的chok1-htpbg3a2f1、chok1-ctpbg3f13g4和chok1-mtpbg3a3)以及chok1細(xì)胞分別在t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)至90％匯合度，吸盡培養(yǎng)基，用hbss緩沖液(hanksbalancedsaltsolution)(購自invitrogen)洗滌2次，然后用無酶細(xì)胞解離液(versenesolution:購自lifetechnology公司)處理和收集細(xì)胞。用hbss緩沖液洗滌細(xì)胞2次，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后將細(xì)胞用hbss緩沖液稀釋至2╳106個細(xì)胞/ml，加入10％山羊血清封閉液，所述百分比為質(zhì)量百分比，冰上孵育30分鐘，然后用hbss緩沖液離心洗滌2次。將收集的細(xì)胞用facs緩沖液(hbss+1％bsa，所述百分比為質(zhì)量百分比)懸浮至2╳106個細(xì)胞/ml，按每孔100微升加入到96孔facs反應(yīng)板中，加入實施例2所得的純化的tpbg抗體待測樣品每孔100微升，冰上孵育2小時。用facs緩沖液離心洗滌2次，加入每孔100微升熒光(alexa488)標(biāo)記的二抗(購自invitrogen)，冰上孵育1小時。用facs緩沖液離心洗滌3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]重懸細(xì)胞，10分鐘后用facs緩沖液離心洗滌2次。用100微升facs緩沖液懸浮細(xì)胞，用facs(facscalibur，購自bd公司)檢測和分析結(jié)果。通過軟件(cellquest)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到細(xì)胞的平均熒光密度(mfi)。再通過軟件(graphpadprism5)分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，計算ec50值。分析結(jié)果如表8以及圖7～10所示，圖7～10的數(shù)據(jù)為細(xì)胞的平均熒光密度(mfi)。表8中的數(shù)據(jù)為根據(jù)mfi計算得到的ec50值。表8說明，tpbg抗體可結(jié)合細(xì)胞表面的tpbg蛋白。表8facs分析tpbg抗體與人/猴/小鼠tpbg表達(dá)細(xì)胞株結(jié)合活性實施例4tpbg抗體藥物偶聯(lián)物的細(xì)胞殺傷活性實驗將實施例2所得的純化的tpbg抗體經(jīng)過ph6.5～8.5的硼酸鈉緩沖液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(tcep)，其中tcep與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為2，室溫下還原1小時，得反應(yīng)液a。將反應(yīng)液a經(jīng)過g25柱脫鹽(購自ge)，去除多余的tcep，得反應(yīng)液b。向反應(yīng)液b中加入mc-mmaf(購自南京聯(lián)寧)，其中mc-mmaf與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為5，室溫下反應(yīng)4小時。再加入半胱氨酸用以中和多余的mc-mmaf，并通過g25柱脫鹽除去多余的小分子。得到純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物(偶聯(lián)方法參見doronina，2006，bioconjugatechem.17,114-124)。通過hic分析藥物的交聯(lián)率、純度等參數(shù)后，進(jìn)行細(xì)胞毒活性的分析。所有抗體偶聯(lián)物的藥物交聯(lián)率(dar)為8。其中，dar(drugantibodyratio)指抗體偶聯(lián)后一個抗體分子上攜帶的小分子藥物的平均數(shù)量。將獲得的純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物分別用完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板以2000細(xì)胞/孔加入100微升tpbg陽性的nci-h1568細(xì)胞株(購自atcc，貨號#crl5876)細(xì)胞懸液過夜培養(yǎng)后，每孔分別加入10微升不同濃度的純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物的稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，用celltiter-glo試劑盒(購自promega，使用方法參照產(chǎn)品說明書)檢測細(xì)胞活力。同時選用tpbg陰性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1770(購自atcc，貨號#crl5893)進(jìn)行細(xì)胞殺傷活性檢測，方法同上。結(jié)果如表9以及圖11-12所示，其中表9的ec50指藥物作用后，細(xì)胞的活性受到抑制的半數(shù)有效量，能夠通過檢測細(xì)胞的活性從而反映細(xì)胞殺傷活性。其中，圖11a和11b為純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1568的細(xì)胞殺傷活性檢測，圖12a和12b為純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陰性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1770的細(xì)胞殺傷活性檢測。結(jié)果說明，純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的細(xì)胞有殺傷作用。此外還檢測了單獨使用實施例2所得的純化的tpbg抗體對細(xì)胞的殺傷作用，使用同實施例4中tpbg抗體藥物偶聯(lián)物進(jìn)行細(xì)胞殺傷活性檢測的方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表9以及圖11c所示，結(jié)果說明，單獨的純化的tpbg抗體對tpbg陽性的細(xì)胞并沒有顯著的殺傷作用。表9細(xì)胞殺傷實驗檢測純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性細(xì)胞的特異性殺傷作用實施例5競爭性elisa檢測分析tpbg抗體與抗原的表位分布為了鑒定抗體對抗原的結(jié)合位點，采用競爭elisa的方法對tpbg抗體進(jìn)行分組。純化的待測抗體用pbs稀釋至1μg/ml，以50μl/孔包被96孔高吸附酶標(biāo)板，4℃過夜包被后用250微升封閉液[含有0.01％(v/v)tween20和1％(w/w)bsa的pbs]進(jìn)行室溫一小時封閉，每孔加入0.05μg/ml的生物素標(biāo)記的重組tpbg蛋白。同時加入5μg/ml的競爭抗體，即實施例2所得的純化的tpbg抗體，其克隆號分別為12b12c7c3、5g4h10g5、37h9c5g2、39a11g5f2、52c9e9f6、28d4e6a9、36a10d8b12、99e12c7h1、103e2e9c2和106d5g3d10，并于25-37℃孵育1-2小時。用洗板液[含有0.01％(v/v)tween20的pbs]洗板3次，加入hrp(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的鏈親和素(購自sigma)。37℃孵育0.5小時后，用洗板液[含有0.01％(v/v)tween20的pbs]洗板3次。加入tmb底物100μl每孔，室溫孵育30分鐘后，加入終止液(1.0nhcl)100μl每孔。用elisa讀板機(spectramax384plus，購自moleculardevice)讀取a450nm數(shù)值，結(jié)果如圖6所示。根據(jù)a450nm數(shù)值，計算出抗體相互之間的競爭率，結(jié)果如表10所示。競爭率的數(shù)值越高，表示兩個抗體的抗原表面越是接近。表10tpbg抗體相互之間的競爭率其中，a的含義是各列為包被抗體，濃度為1μg/ml；b的含義是各行為競爭抗體，濃度為5μg/ml。結(jié)果說明，12b12c7c3和106d5g3d10可以互相競爭，為相似表位；5g4h10g5和99e12c7h1可以互相競爭，為相似表位；37h9c5g2和36a10d8b12可以互相競爭，為相似表位；39a11g5f2和52c9e9f6可以互相競爭，為相似表位；28d4e6a9和103e2e9c2可以互相競爭，為相似表位。實施例6輕重鏈可變區(qū)氨基酸序列測定總rna分離：通過離心搜集實施例1所得的雜交瘤細(xì)胞5×107個，加入1mltrizol混勻并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，室溫靜置5分鐘。加0.2ml氯仿，振蕩15秒，靜置10分鐘后于4℃，12000g離心5分鐘，取上清轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10分鐘后于4℃，12000g離心15分鐘，棄上清。加入1ml75％(v/v)乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃，12000g離心5分鐘后棄上清，將沉淀物晾干，加入depc處理過的h2o溶解(55℃水浴促進(jìn)溶解10分鐘)，即得總rna。逆轉(zhuǎn)錄與pcr：取1μg總rna，配置20μl體系，加入逆轉(zhuǎn)錄酶后于42℃反應(yīng)60分鐘，于7℃反應(yīng)10分鐘終止反應(yīng)。配置50μlpcr體系，包括1μlcdna、每種引物25pmol、1μldna聚合酶以及相配的緩沖體系、250μmoldntps；設(shè)置pcr程序，95℃預(yù)變性3分鐘，95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，35個循環(huán)后再額外于72℃延伸5分鐘，得pcr產(chǎn)物。其中逆轉(zhuǎn)錄所用的試劑盒為primescriptrtmastermix，購自takara，貨號rr036；pcr所用的試劑盒包括q5超保真酶，購自neb，貨號m0492?？寺∨c測序：取5μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測陽性樣品使用柱回收試劑盒純化，其中回收試劑盒為gel&pcrclean-up，購自macherey-nagel，貨號740609。進(jìn)行連接反應(yīng)：樣品50ng，t載體50ng，連接酶0.5μl，緩沖液1μl，反應(yīng)體系10μl，于16℃反應(yīng)半小時得連接產(chǎn)物。其中連接的試劑盒為t4dna連接酶，購自neb，貨號m0402；取5μl連接產(chǎn)物加入100μl的感受態(tài)細(xì)胞(ecos101competentcells，購自yeastern，貨號fye607)中，冰浴5分鐘，而后于42℃水浴熱激1分鐘，放回冰上1分鐘后加入650μl無抗生素soc培養(yǎng)基，于37℃搖床上以200rpm的速度復(fù)蘇30分鐘。取出200μl涂布于含抗生素的lb固體培養(yǎng)基上于37℃孵箱過夜培養(yǎng)。次日，使用t載體上引物m13f和m13r配置30μlpcr體系，進(jìn)行菌落pcr，用移液器槍頭蘸取菌落于pcr反應(yīng)體系中吹吸，并吸出0.5μl點于另一塊含100nm氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)皿上以保存菌株。pcr反應(yīng)結(jié)束后，取出5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性樣品進(jìn)行測序和分析[參見kabat，“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，”nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991)]。測序結(jié)果如表11～12所示。表11tpbg抗體蛋白序列編號其中，表11中的數(shù)字即為序列表中序列號，如12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno.1，而12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的氨基酸序列為seqidno.2。表12tpbg抗體基因序列編號其中，表12中的數(shù)字即為序列表中序列號，如編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)的核苷酸序列為seqidno.81。其中，編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.81中的第91位至第105位；編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.81中的第151位至第198位；編碼12b12c7c3的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.81中的第295位至第327位；編碼12b12c7c3的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.82中的第70位至第114位；編碼12b12c7c3的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.82中的第157位至第180位；編碼12b12c7c3的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.82中的第277位至第303位；編碼5g4h10g5的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.83中的第91位至第105位；編碼5g4h10g5的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.83中的第148位至第198位；編碼5g4h10g5的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.83中的第295位至第330位；編碼5g4h10g5的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.84中的第70位至第102位；編碼5g4h10g53的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.84中的第148位至第168位；編碼5g4h10g5的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.84中的第265位至第288位；編碼37h9c5g2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.85中的第91位至第105位；編碼37h9c5g2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.85中的第151位至第198位；編碼37h9c5g2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.85中的第295位至第327位；編碼37h9c5g2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.86中的第70位至第102位；編碼37h9c5g2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.86中的第148位至第168位；編碼37h9c5g2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.86中的第265位至第291位。編碼39a11g5f2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.87中的第91位至第105位；編碼39a11g5f2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.87中的第151位至第198位；編碼39a11g5f2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.87中的第295位至第315位；編碼39a11g5f2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.88中的第70位至第102位；編碼39a11g5f2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.88中的第148位至第168位；編碼39a11g5f2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.88中的第265位至第291位。編碼52c9e9f6的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.89中的第91位至第105位；編碼52c9e9f6的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.89中的第151位至第198位；編碼52c9e9f6的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.89中的第295位至第315位；編碼52c9e9f6的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.90中的第70位至第102位；編碼52c9e9f6的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.90中的第148位至第168位；編碼52c9e9f6的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.90中的第268位至第291位。編碼28d4e6a9的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.91中的第91位至第105位；編碼28d4e6a9的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.91中的第148位至第198位；編碼28d4e6a9的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.91中的第295位至第327位；編碼28d4e6a9的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.92中的第70位至第102位；編碼28d4e6a9的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.92中的第148位至第168位；編碼28d4e6a9的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.92中的第265位至第291位。編碼36a10d8b12的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.93中的第91位至第108位；編碼36a10d8b12的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.93中的第154位至第198位；編碼36a10d8b12的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.93中的第295位至第324位；編碼36a10d8b12的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.94中的第70位至第102位；編碼36a10d8b12的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.94中的第148位至第168位；編碼36a10d8b12的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.94中的第265位至第291位。編碼99e12c7h1的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.95中的第91位至第105位；編碼99e12c7h1的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.95中的第151位至第198位；編碼99e12c7h1的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.95中的第295位至第318位；編碼99e12c7h1的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.96中的第70位至第102位；編碼99e12c7h1的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.96中的第148位至第168位；編碼99e12c7h1的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.96中的第265位至第291位。編碼103e2e9c2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.97中的第91位至第105位；編碼103e2e9c2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.97中的第151位至第198位；編碼103e2e9c2的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.97中的第295位至第324位；編碼103e2e9c2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.98中的第70位至第105位；編碼103e2e9c2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.98中的第151位至第171位；編碼103e2e9c2的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.98中的第268位至第294位。編碼106d5g3d10的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.99中的第91位至第105位；編碼106d5g3d10的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.99中的第151位至第198位；編碼106d5g3d10的重鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.99中的第295位至第318位；編碼106d5g3d10的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr1的核苷酸序列為序列表seqidno.100中的第70位至第99位；編碼106d5g3d10的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr2的核苷酸序列為序列表seqidno.100中的第145位至第165位；編碼106d5g3d10的輕鏈蛋白可變區(qū)中cdr3的核苷酸序列為序列表seqidno.100中的第262位至第294位。實施例7鼠-人嵌合抗體構(gòu)建、以及抗體的生產(chǎn)和純化1.質(zhì)粒構(gòu)建與準(zhǔn)備：根據(jù)實施例6的測序結(jié)果明確了tpbg抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列。將實施例2和實施例3所得的先導(dǎo)抗體的重鏈可變區(qū)序列重組到包含信號肽和人源重鏈抗體igg1恒定區(qū)的表達(dá)載體(其中表達(dá)載體購買自invitrogen，重組步驟也由上海睿智化學(xué)完成)中，將tpbg抗體的輕鏈可變區(qū)序列重組到包含信號肽和人源抗體輕鏈kappa恒定區(qū)的表達(dá)載體當(dāng)中，得重組質(zhì)粒并經(jīng)測序驗證(測序方法與實施例6中測序方法相同)。使用堿裂解法試劑盒(購自macherey-nagel)中量抽提高純度的重組質(zhì)粒，質(zhì)量為500μg以上，經(jīng)0.22μm濾膜(購自millopore)過濾，供轉(zhuǎn)染使用。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：在培養(yǎng)基freestyle293expressionmedium(購自invitrogen)培養(yǎng)293e細(xì)胞(購自invitrogen)。搖床設(shè)置為37℃、130rpm和8％co2(v/v)。freestyle293expressionmedium在轉(zhuǎn)染時添加10％(v/v)f68(購自invitrogen)至f68終濃度為0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)f68的freestyle293表達(dá)培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基a。取5ml培養(yǎng)基a和200μg/mlpei(購自sigma)混勻，得培養(yǎng)基b。取5ml培養(yǎng)基a和100μg/ml步驟(1)所得的重組質(zhì)粒混勻，得培養(yǎng)基c。5分鐘后將培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c合并混勻，靜置15分鐘，得混合液d。將10ml混合液d緩緩加入100ml含293e細(xì)胞的培養(yǎng)基freestyle293expressionmedium中至293e的細(xì)胞密度為1.5×106個/ml，邊加邊振蕩，避免pei過度集中，放入搖床培養(yǎng)。第二天加入蛋白胨至終濃度為0.5％(w/v)。第5～7天，測培養(yǎng)液抗體效價。第6～7天，離心(3500rpm，30分鐘)收集上清，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得濾好的細(xì)胞上清液，以供純化。3.抗體純化：對于連續(xù)生產(chǎn)的無內(nèi)毒素的層析柱和proteina填料，使用0.1mnaoh處理30min或者5個柱體積0.5mnaoh沖洗；對于長期未使用的柱料和層析柱至少使用1mnaoh浸泡1h，用無內(nèi)毒的水沖洗至中性，用10倍柱體積的1％tritonx100對柱料清洗。使用5個柱體積的pbs進(jìn)行平衡，將過濾好的細(xì)胞上清上柱，必要時收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱體積pbs清洗。用5倍柱體積的0.1mph3.0的glycine-hcl進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，并用1/10體積的ph8.5的1mtris-hcl(1.5mnacl)中和。收獲抗體后，在1×pbs中透析過夜，避免內(nèi)毒素污染。透析結(jié)束后，使用分光光度或試劑盒測定濃度，使用hplc-sec測定抗體純度，使用內(nèi)毒素檢測試劑盒(購自lonza)檢測抗體內(nèi)毒素含量。下述實施例中嵌合抗體命名中首段字符選用對應(yīng)的先導(dǎo)抗體克隆號的前3～5位字符，例如嵌合抗體12b12-mmaf對應(yīng)的先導(dǎo)抗體克隆號為12b12c7c3，嵌合抗體5g4-mmaf對應(yīng)的先導(dǎo)抗體克隆號為5g4h10g5等等。實施例8嵌合抗體的體外藥效實驗將實施例7所得的純化的tpbg嵌合抗體與mc-mmaf進(jìn)行偶聯(lián)，方法同實施例4，經(jīng)過ph6.5～8.5的硼酸鈉緩沖液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(tcep)，其中tcep與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為2，室溫下還原1小時，得反應(yīng)液a。將反應(yīng)液a經(jīng)過g25柱脫鹽(購自ge)，去除多余的tcep，得反應(yīng)液b。向反應(yīng)液b中加入mc-mmaf，其中mc-mmaf與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為5，室溫下反應(yīng)4小時。再加入半胱氨酸用以中和多余的mc-mmaf，并通過g25柱脫鹽除去多余的小分子。得到純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物(偶聯(lián)方法參見doronina，2006，bioconjugatechem.17,114-124)。通過hic分析藥物的交聯(lián)率、通過sec分析抗體藥物偶聯(lián)物的純度等參數(shù)后，進(jìn)行細(xì)胞毒活性的分析。所有抗體偶聯(lián)物的藥物交聯(lián)率(dar)為3.0-5.0。其中，dar(drugantibodyratio)指抗體偶聯(lián)后一個抗體分子上攜帶的小分子藥物的平均數(shù)量。將獲得的純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物分別用完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板以2000細(xì)胞/孔加入100微升tpbg陽性的nci-h1299細(xì)胞株(購自atcc，貨號#crl5803)細(xì)胞懸液過夜培養(yǎng)后，每孔分別加入10微升不同濃度的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物的稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，用celltiter-glo試劑盒(購自promega，使用方法參照產(chǎn)品說明書)檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如表13以及圖13所示，其中表13的ic50指藥物作用后，細(xì)胞的活性受到抑制的半數(shù)有效量，能夠通過檢測細(xì)胞的活性從而反映細(xì)胞殺傷活性。圖13為純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1299的細(xì)胞殺傷活性檢測，結(jié)果說明，純化的tpbg抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的細(xì)胞有殺傷作用。表13細(xì)胞殺傷實驗檢測純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性nci-h1299細(xì)胞的特異性殺傷作用實施例9嵌合抗體的體內(nèi)藥效實驗將nci-h1299(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，atcc，crl-5803)(5x106個)200μl接種與balb/cnude小鼠右肋皮下，待7-10天腫瘤長至200mm3后，去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為幾組，每組7只。d0開始尾靜脈注射抗體，4天一次，共給藥4次，每周測2次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體積(v)計算公式為：v＝1/2×a×b2；其中a、b分別表示長、寬。分組如表14。表14tpbg嵌合抗體及其抗體藥物偶聯(lián)物的體內(nèi)藥效實驗結(jié)果見圖14：治療后腫瘤的體積變化圖，和圖15：治療后的鼠重變化圖。其中，圖14a-e分別是嵌合抗體12b12，嵌合抗體5g4，嵌合抗體39a11，嵌合抗體28d4，嵌合抗體36a10的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的腫瘤體積變化圖。圖15a-e分別是嵌合抗體12b12，嵌合抗體5g4，嵌合抗體39a11，嵌合抗體28d4，嵌合抗體36a10的抗體藥物偶聯(lián)物及其裸抗的治療后的小鼠體重變化圖。結(jié)果顯示，幾種adc可以很好的抑制腫瘤nci-h1299的生長，而且對小鼠的體重沒有顯著的影響。實施例10偶聯(lián)不同連接子-毒素的抗體偶聯(lián)物的體外藥效實驗將實施例7所得的純化的tpbg嵌合抗體12b12和28d4分別與mc-mmaf和mc-vc-pab-mmae進(jìn)行偶聯(lián)，方法同實施例8，經(jīng)過ph6.5～8.5的硼酸鈉緩沖液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(tcep)，其中tcep與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為2，室溫下還原1小時，得反應(yīng)液a。將反應(yīng)液a經(jīng)過g25柱脫鹽(購自ge)，去除多余的tcep，得反應(yīng)液b。向反應(yīng)液b中加入mc-mmaf或mc-vc-pab-mmae(購自南京聯(lián)寧)，其中mc-mmaf或mc-vc-pab-mmae與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為5，室溫下反應(yīng)4小時。再加入半胱氨酸用以中和多余的mc-mmaf或mc-vc-pab-mmae，并通過g25柱脫鹽除去多余的小分子，得到純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物——即表格中所述的嵌合抗體12b12-mmaf、12b12-mmae、28d4-mmaf、28d4-mmae(偶聯(lián)方法參見doronina，2006，bioconjugatechem.17,114-124)。通過hic分析藥物的交聯(lián)率、通過sec分析抗體藥物偶聯(lián)物的純度等參數(shù)后，進(jìn)行細(xì)胞毒活性的分析。將實施例7所得的純化的tpbg嵌合抗體12b12和28d4分別與smcc進(jìn)行偶聯(lián)。將實施例7所得的純化的tpbg嵌合抗體12b12和28d4經(jīng)過ph6.5～7.4的磷酸鹽緩沖液透析后，在體積比為30％dma(二甲基乙酰胺)存在下加入4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(smcc)，其中smcc與純化的tpbg嵌合抗體的摩爾比比率為8，室溫下反應(yīng)1小時，得反應(yīng)液a。將反應(yīng)液a經(jīng)過g25柱脫鹽(購自ge)，去除多余的小分子，得反應(yīng)液b。向反應(yīng)液b中加入終體積為10％dma，然后加入dm1(化學(xué)名稱為n2’-脫乙酰-n2’-3-巰基-1氧代丙基)-美登素)，其中dm1與純化的tpbg抗體的摩爾比比率為9，室溫下反應(yīng)3.5小時，得反應(yīng)液c。將反應(yīng)液c經(jīng)過g25柱脫鹽(購自ge)，去除多余的小分子，得到純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物——即表格中所述的嵌合抗體12b12-dm1、28d4-dm1(偶聯(lián)方法參見us5208020)。通過lc-ms分析藥物的交聯(lián)率、通過sec分析抗體藥物偶聯(lián)物的純度等參數(shù)后，進(jìn)行細(xì)胞毒活性的分析，所有嵌合抗體偶聯(lián)物的藥物交聯(lián)率(dar)為3.0-5.0。其中，dar(drugantibodyratio)指抗體偶聯(lián)后一個抗體分子上攜帶的小分子藥物的平均數(shù)量。將獲得的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物分別用完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板以2000細(xì)胞/孔加入100微升tpbg陽性的nci-h1299細(xì)胞株(購自atcc，貨號#crl5803)，或nci-h1568細(xì)胞株(購自atcc，貨號#crl-5876)細(xì)胞懸液過夜培養(yǎng)后，每孔分別加入10微升不同濃度的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物的稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，用celltiter-glo試劑盒(購自promega，使用方法參照產(chǎn)品說明書)檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如表15以及圖16所示，其中表15的ic50指藥物作用后，細(xì)胞的活性受到抑制的半數(shù)有效量，能夠通過檢測細(xì)胞的活性從而反映細(xì)胞殺傷活性。其中，圖16a和16b分別為純化的tpbg嵌合抗體12b12及其偶聯(lián)了不同的小分子藥的抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1299的細(xì)胞殺傷活性檢測；圖16c和16d分別為純化的tpbg嵌合抗體12b12及其偶聯(lián)了不同的小分子藥的抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的腫瘤細(xì)胞系nci-h1568的細(xì)胞殺傷活性檢測。結(jié)果說明，偶聯(lián)不同的小分子毒素的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的細(xì)胞均具有不同程度的殺傷作用，并且偶聯(lián)了mc-mmaf的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物具有較低的ic50，說明其細(xì)胞殺傷能力最強。表15細(xì)胞殺傷實驗檢測純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性nci-h1299，nci-h1568細(xì)胞的特異性殺傷作用將獲得的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物分別用完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板以2000細(xì)胞/孔加入100微升表達(dá)tpbg的293-htpbg穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(構(gòu)建方法參見實施例1：免疫原b的制備)及不表達(dá)tpbg的293細(xì)胞株(購自atcc，貨號#crl-1573)細(xì)胞懸液過夜培養(yǎng)后，每孔分別加入10微升不同濃度的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物的稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，用celltiter-glo試劑盒(購自promega，使用方法參照產(chǎn)品說明書)檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如表16以及圖17所示，其中表16的ic50指藥物作用后，細(xì)胞的活性受到抑制的半數(shù)有效量，能夠通過檢測細(xì)胞的活性從而反映細(xì)胞殺傷活性。圖17a和17b為純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的表達(dá)tpbg的293-htpbg穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的細(xì)胞殺傷活性檢測；圖17c和17d為純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對不表達(dá)tpbg的293細(xì)胞株的細(xì)胞殺傷活性檢測。結(jié)果說明，偶聯(lián)不同的小分子毒素的純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的細(xì)胞有不同程度的殺傷作用，對tpbg陰性的293細(xì)胞不具有細(xì)胞殺傷作用，說明純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性的細(xì)胞的殺傷是特異的，并且偶聯(lián)了mc-mmaf的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物具有較低的ic50，說明其細(xì)胞殺傷能力最強。表16細(xì)胞殺傷實驗檢測純化的tpbg嵌合抗體藥物偶聯(lián)物對tpbg陽性293-htpbg和tpbg陰性的293細(xì)胞的特異性殺傷作用應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<110>上海開拓者生物醫(yī)藥有限公司<120>一種tpbg抗體及其制備方法、其偶聯(lián)物和應(yīng)用<130>p1611280c<150>cn201510990545.6<151>2015-12-24<160>100<170>patentinversion3.5<210>1<211>120<212>prt<213>musmusculus<400>1aspvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serarglysleusercysalaalaserglyphethrpheserasnphe202530glymethistrpvalargglnalaproglulysglyleuglutrpval354045alatyrileserserglyserthrserphetyrtyralaaspthrval505560lysglyargphethrileserargaspasnprolysasnthrleuphe65707580leuglnmetthrserleuargsergluaspthralamettyrtyrcys859095serargthrasnserleuleuargglyphepheaspalatrpglyala100105110glythrthrvalthrvalserser115120<210>2<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>2asnpheglymethis15<210>3<211>16<212>prt<213>musmusculus<400>3ileserserglyserthrserphetyrtyralaaspthrvallysgly151015<210>4<211>10<212>prt<213>musmusculus<400>4thrasnserleuleuargglyphepheasp1510<210>5<211>111<212>prt<213>musmusculus<400>5aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysargalaserglnservalserserser202530sertyrthrtyrleuhistrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuilelysseralaserasnleugluserglyvalproala505560argpheserglythrglyserglythraspphethrleuasnilehis65707580provalgluglugluaspthralathrtyrtyrcysglnhissertrp859095gluileproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>6<211>21<212>prt<213>musmusculus<400>6argalathrilesercysargalaserglnservalserserserser151015tyrthrtyrleuhis20<210>7<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>7seralaserasnleugluser15<210>8<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>8glnhissertrpgluileproleuthr15<210>9<211>121<212>prt<213>musmusculus<400>9gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvalglnproglygly151015serleulysleuphecysalaalaserglyphethrpheserthrtyr202530glyleusertrpvalargglnthrproasplysargleugluleuval354045alathrilethrasnasnaspglyseralatyrtyrproaspserval505560lysglyargphethrileserargasplysalalysasnthrleuphe65707580leuglnmetthrserleulyssergluaspthralamettyrtyrcys859095alaarggluthrglypheglysersertyrleupheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserala115120<210>10<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>10thrtyrglyleuser15<210>11<211>17<212>prt<213>musmusculus<400>11thrilethrasnasnaspglyseralatyrtyrproaspservallys151015gly<210>12<211>12<212>prt<213>musmusculus<400>12gluthrglypheglysersertyrleupheasptyr1510<210>13<211>106<212>prt<213>musmusculus<400>13asnilevalmetthrglnthrprolyspheleuleuvalseralagly151015aspargvalthrilethrcyslysalaserglnservalserasnasp202530valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile354045tyrphealathrasnargtyrthrglyvalproasnargphethrgly505560serglytyrglythrgluphethrphethrileserservalglnala65707580gluaspleualavaltyrphecysglnglnasptyrserserprothr859095pheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>14<211>11<212>prt<213>musmusculus<400>14lysalaserglnservalserasnaspvalala1510<210>15<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>15phealathrasnargtyrthr15<210>16<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>16glnglnasptyrserserprothr15<210>17<211>120<212>prt<213>musmusculus<400>17glnvalglnleuglnglnseraspalagluleuvalargproglyala151015servallysmetsercyslysvalserglytyrthrphethrasphis202530thrilehistrpmetlysglnargprogluglnglyleuglutrpile354045glytyriletyrproargaspglyserglythrtyrasnglulysphe505560lysglylysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr65707580metglnleuasnserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys859095alaargaspglyserserhistyrtrptyrpheaspvaltrpglythr100105110glythrthrvalthrvalserser115120<210>18<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>18asphisthrilehis15<210>19<211>16<212>prt<213>musmusculus<400>19iletyrproargaspglyserglythrtyrasnglulysphelysgly151015<210>20<211>11<212>prt<213>musmusculus<400>20aspglyserserhistyrtrptyrpheaspval1510<210>21<211>107<212>prt<213>musmusculus<400>21aspileglnmetthrglnserproalaserleuseralaservalgly151015gluthrvalthrilethrcysargalasergluileiletyrasntyr202530leualatrptyrglnglnlysglnglylysserproglnleuleuval354045tyrasnalalysthrleualagluglyvalproserargphesergly505560sertyrserglythrglnpheserleuasnileasnserleuglnser65707580gluasppheglyiletyrtyrcysglnhishishisaspthrproleu859095thrpheglyalaglythrlysleuaspleulys100105<210>22<211>11<212>prt<213>musmusculus<400>22argalasergluileiletyrasntyrleuala1510<210>23<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>23asnalalysthrleualaglu15<210>24<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>24glnhishishisaspthrproleuthr15<210>25<211>116<212>prt<213>musmusculus<400>25glnvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlysproglyala15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