本發(fā)明涉及串聯(lián)穿膜肽，特別是涉及可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┘捌渲苽浞椒ㄅc應(yīng)用，該應(yīng)用涉及納米顆粒抗菌劑在制備治療腦部感染及其他細(xì)菌或真菌感染疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦部感染長期作為最重要的感染性致死原因之一，可由細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和真菌如白色念珠菌引起。在急性腦膜炎患者中，即使細(xì)菌是敏感菌，并且很早給予抗生素治療，高死亡率仍可能發(fā)生在幾小時內(nèi)，且幸存者可能遭受永久性視覺損害、聽力喪失、神經(jīng)功能障礙及行動障礙。盡管抗生素治療的重大進(jìn)展，由于藥物很難穿透血腦屏障進(jìn)入腦脊液和腦組織，腦部感染患者仍然存在很高的致病率和死亡率。臨床上只有少數(shù)抗生素可用于治療腦部感染，但其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肝腎等器官的較高的毒性限制了其使用。影響治療效果的另一個因素是近年來不斷加強(qiáng)的細(xì)菌耐藥性及增多的耐藥菌株。

近年來，穿膜肽因其超強(qiáng)的穿膜能力及攜帶分子進(jìn)入細(xì)胞的載體功能，引起了廣泛關(guān)注。聚精氨酸r9(或聚賴氨酸k9)是有名的穿膜肽之一，而np1(或np2)是2015年sangholim等從人nlbp蛋白中首次發(fā)現(xiàn)的穿膜肽，其有極強(qiáng)的穿膜及蛋白運(yùn)輸作用，且其序列存在于許多物種體內(nèi)。

自組裝肽納米顆粒因其廣譜抗菌活性和抑制耐藥微生物的能力，有望成為新型的抗菌藥物。因此，通過改進(jìn)穿膜肽開發(fā)新型抗菌藥物十分有意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦l(fā)明基于將穿膜肽np1(或np2)及r9(或k9)串聯(lián)并進(jìn)行修飾，設(shè)計了可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑，且其能克服細(xì)菌耐藥性，可用于治療腦部感染及其他感染疾病。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦涸摽咕鷦┑慕Y(jié)構(gòu)通式為cn-x-y，其中x和y均為穿膜肽，且x和y串聯(lián)形成親水部分；cn表示與穿膜肽偶聯(lián)的疏水部分脂肪酸鏈；穿膜肽為l型氨基酸；所述脂肪酸鏈的碳原子個數(shù)為12-20；

所述x為陽離子穿膜肽；

所述y為np1或np2；所述np1序列為kkdkkderrrk；所述np2序列為kikkvkkkgrk。

為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述脂肪酸為月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸或花生酸。

優(yōu)選地，所述陽離子穿膜肽為九聚精氨酸r9或九聚賴氨酸k9。

優(yōu)選地，所述自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑具有100-500nm的平均直徑。

所述可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┑闹苽浞椒?，包括如下步驟：

1)采用fmoc固相合成法制備串聯(lián)穿膜肽，先溶漲樹脂，洗滌并脫保護(hù)后，將第一個fmoc-氨基酸和hobt進(jìn)行縮合，脫保護(hù)并洗滌后，茚檢確認(rèn)脫保護(hù)完全；然后縮合第二個氨基酸，重復(fù)以上步驟，由c-端向n-端，直至多肽鏈合成完成；

2)將合成完成的多肽鏈用裂解液裂解，減壓過濾后用冷乙醚沉淀獲得粗肽，并通過液相色譜進(jìn)一步純化；

3)脂肪酸與串聯(lián)穿膜肽中陽離子穿膜肽的n-端偶聯(lián)，將棕櫚酸加至含有三乙胺和串聯(lián)穿膜肽的dmf中攪拌反應(yīng)后，通氮?dú)馊コ齞mf，用二乙醚清洗，并使用透析膜進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物。

所述可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┰谥苽淇菇瘘S色葡萄球菌、大腸桿菌、耐甲氧西林金葡菌或白色念珠菌藥物中的應(yīng)用。

所述可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑在制備治療腦部金黃色葡萄球菌感染藥物中的應(yīng)用。

所述可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┑闹苽浞椒ㄊ菍⒅舅崤c串聯(lián)穿膜肽中陽離子穿膜肽的n-端偶聯(lián)。cn優(yōu)選棕櫚酸時，自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┙Y(jié)構(gòu)為：c16-r9-np1、c16-k9-np1、c16-r9-np2、c16-k9-np2。任意一項(xiàng)自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑，具有約100到約500nm的平均直徑。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明提供了新型的自組裝納米多肽，增加了自組裝納米多肽的類型。

(2)本發(fā)明自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦﹏端以脂肪酸修飾以增加疏水性，便于提高肽的兩親性，更易于自組裝的進(jìn)行。其在純水中即可在很低的肽濃度下自組裝形成納米顆粒，無需劇烈攪拌、超聲處理等機(jī)械作用，且具有較好的穩(wěn)定性。

(3)本發(fā)明自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦Ω锾m氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性菌，真菌及耐藥細(xì)菌均有較好的抑菌作用，且其抗菌效果遠(yuǎn)強(qiáng)于單一的穿膜肽。因此，可應(yīng)用于研制適于臨床上使用的新型納米抗菌藥物，有利于微生物感染疾病的治療。

(4)本發(fā)明自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┲邪舜?lián)的穿膜肽，且自組裝后串聯(lián)穿膜肽分布在納米顆粒表面，有利于增加細(xì)胞膜的通透性，使得自組裝穿膜肽納米顆粒能穿過血腦屏障。

(5)本發(fā)明自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┛捎糜谥苽渲委熌X部感染疾病藥物，有效抑制受感染的腦組織內(nèi)的微生物。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1所得自組裝串聯(lián)穿膜肽的三維分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是實(shí)施例1所得自組裝串聯(lián)穿膜肽的高效液相色譜圖，結(jié)果顯示它的純度是95.89％。

圖3是實(shí)施例1所得自組裝串聯(lián)穿膜肽的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示它的分子量為2984.6。

圖4是實(shí)施例3中自組裝串聯(lián)穿膜肽自組裝成納米顆粒的分子動力學(xué)模擬圖。

圖5是實(shí)施例3中自組裝串聯(lián)穿膜肽在超純水溶液中的掃描電鏡納米形貌圖，其中肽樣品的濃度是0.5mg/ml。

圖6是實(shí)施例4中自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒處理前后的微生物形貌圖。

圖7是實(shí)施例4中自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒對人紅細(xì)胞的溶血作用圖。

圖8是實(shí)施例5中，通過靜脈注射自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒后，大鼠腦脊液樣品的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析圖。

圖9是實(shí)施例5中，通過自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒治療后，受感染的腦組織中的細(xì)菌菌落數(shù)。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。

實(shí)施例1

當(dāng)x為九聚精氨酸r9，y為np2，cn為棕櫚酸長鏈時，自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑的結(jié)構(gòu)通式為：c16-r-r-r-r-r-r-r-r-r-k-i-k-k-v-k-k-k-g-r-k。其合成方式如下：

1、材料

棕櫚酸、fmoc‐arg(pbf)‐oh(n‐芴甲氧羰?；\2，2，4，6，7‐五甲基二氫苯并呋喃‐5‐磺酰精氨酸)、fmoc‐lys(boc)‐oh(n‐芴甲氧羰?；\n'‐叔丁氧羰?；\賴氨酸)、fmoc‐ile‐oh(n‐芴甲氧羰?；\異亮氨酸)、fmoc‐val‐oh(n‐芴甲氧羰?；\纈氨酸)、fmoc‐gly‐oh(n‐芴甲氧羰?；\甘氨酸)、rinkamide一mbharesin、dblk(六氫吡啶+dmf)、hbtu(o‐苯并三唑‐1‐基‐n、n、n、n‐四甲基尿六氟磷酸脂)和hobt(1‐羥基苯并三氮唑)；哌啶、醋酸酐、dmf(n、n‐二甲基甲酰胺)、tfa(三氟乙酸)、nmm(n‐甲基嗎啉)、乙醚、甲醇、dcm(二氯甲烷)。

2、制備方法

采用fmoc(芴甲氧羰?；?保護(hù)的固相合成法，其工藝步驟如下：

(1)稱取20g0.5mmol/g的rinkamide-mbharesin(樹脂)于肽合成器皿中，取200mldcm溶漲樹脂30min，然后抽濾，再取用300mldmf洗滌樹脂，分三次進(jìn)行，每次的洗滌時間為2min，抽濾干洗滌液后向肽合成器中加入100ml哌啶/dblk(體積比20％)震蕩反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，再抽濾出反應(yīng)液，再用400mldmf分四次洗滌樹脂，洗畢后取少量樹脂做茚三酮檢測試驗(yàn)，樹脂呈陽性，向肽合成器皿中加入以下原料：

上述原料加完后，震蕩反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，用300mldmf分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間2分鐘，取少許樹脂做茚三酮試驗(yàn)檢測，樹脂呈陰性。

(2)向肽合成器皿中加入5ml哌啶/dblk(體積比20％)震蕩反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后抽濾出反應(yīng)液，再用40mldmf分四次洗滌樹脂，洗畢取少許樹脂做茚三酮試驗(yàn)檢測，結(jié)果樹脂呈陽性，向反應(yīng)器皿中加入以下原料：

上述原料加完后，震蕩反應(yīng)40min，反應(yīng)結(jié)束后，用40mldmf分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間為2min，取少許樹脂做茚三酮檢測，樹脂呈陰性。

(3)變換步驟(2)中的(a)原料，保持(b)(c)(d)(e)原料及加入量不變，重復(fù)步驟(2)的操作，由c-端向n-端依次縮合氨基酸。即(a)原料依次替換為fmoc-gly-oh(9.37g)、fmoc-lys(boc)-oh(18.74g)、fmoc-lys(boc)-oh(18.74g)、fmoc-lys(boc)-oh(18.74g)、fmoc-val-oh(13.58g)、fmoc-lys(boc)-oh(18.74g)、fmoc-lys(boc)-oh(18.74g)、fmo-ile-oh(14.14g)、fmoc-lys(boc)-oh(18.74g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)、fmoc-arg(pbf)-oh(25.95g)，(b)hbtu(15.16g)、(c)hobt(5.40g)、(d)nmm(4.39ml)、(e)dmf(160ml)加入量不變。

(4)最后一個arg合成結(jié)束后，脫出fmoc-保護(hù)基，再加入5ml哌啶/dblk(體積比1:5)反應(yīng)30min，洗凈樹脂，加入160ml醋酸酐/dmf(體積比1:2)反應(yīng)30min，用40mldmf洗凈樹脂，再用甲醇洗滌樹脂8次，除去dmf。氮?dú)獯蹈珊?，用tfa(三氟乙酸)/dcm強(qiáng)酸裂解液(體積比1:1)，裂解3小時，將合成得到的多肽從樹脂上裂解下來，同時脫去所有保護(hù)基團(tuán)，收集溶有合成肽的裂解液，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在濾液中的多肽，再抽濾得到白色固體，即得串聯(lián)穿膜肽的肽粗品。肽粗品經(jīng)高效液相色譜純化，收集主峰，經(jīng)過冷凍干燥后，將棕櫚酸(51.23g)與陽離子穿膜肽r9的精氨酸n-端偶聯(lián)獲得c16r9np2，步驟如下：在0℃攪拌下將溶于15mldmf的棕櫚酸緩慢添加至5ml含有70μl三乙胺和串聯(lián)穿膜肽的dmf中。在反應(yīng)24小時后，通過吹掃干燥氮?dú)鈴幕旌衔锶コ齞mf，然后用二乙醚清洗混合物3次以去除未反應(yīng)的棕櫚酸，即完成n端修飾。使用分子量截斷值為1000da的膜用dmf透析6天以進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物。然后通過真空干燥去除dmf以產(chǎn)生終產(chǎn)物獲得終產(chǎn)物c16r9np2。通過hplc和maldi-tof分析證明了c16r9np2的成功合成(如下)。

3、產(chǎn)物檢測

合成得到的c16r9np2二維分子結(jié)構(gòu)通過chembiodraw軟件繪制，其三維分子模型通過chembio3d軟件繪制。如圖1所示，通過該圖可知其氨基酸及脂肪酸鏈的空間分布。圖中可見，串聯(lián)穿膜肽中陽離子穿膜肽n-端與棕櫚酸偶聯(lián)，np2為末端結(jié)構(gòu)。

通過反相高效液相色譜hplc檢測合成得到的c16r9np2純度。以cromasil-c-18柱(5μm)作為固定相，乙腈和水的混合物作為流動相，記錄0-30min的峰形。檢測結(jié)果見圖2，圖中14.032min處對應(yīng)的峰即為目標(biāo)產(chǎn)物峰，根據(jù)峰面積百分比結(jié)果確定其純度達(dá)到95.89％。

將等體積的肽溶液(1.0mg/ml)與α-氰基-4-羥基肉桂酸(hcca)溶液(飽和于體積比為50％的乙腈水溶液)混合，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜maldi-tof檢測合成得到的c16r9np2。檢測結(jié)果見圖3，圖中最大強(qiáng)度峰，即對應(yīng)數(shù)值為2584.6的峰為產(chǎn)物的分子離子峰，表示其分子量為2584.6，與由結(jié)構(gòu)式計算的理論分子量一致，結(jié)果證明了目標(biāo)產(chǎn)物c16r9np2的合成。

實(shí)施例2

本發(fā)明所述其他脂肪酸修飾的可穿透血腦屏障的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┛梢酝ㄟ^替換實(shí)施例1中的氨基酸及脂肪酸，采用fmoc(芴甲氧羰?；?保護(hù)的固相合成法，按照實(shí)施例1所述制備方法合成純化得到。

即按實(shí)施例1的制備方法(1)中所述，溶脹樹脂，然后用dmf洗滌，加入哌啶/dblk震蕩反應(yīng)后洗滌樹脂，經(jīng)茚三酮檢測呈陽性后加入氨基酸原料、hbtu、hobt、nmm、dmf，震蕩反應(yīng)結(jié)束后用dmf洗滌樹脂，茚三酮檢驗(yàn)呈陰性。然后按照實(shí)施例1的制備方法(2)中所述，根據(jù)不同串聯(lián)穿膜肽的氨基酸序列，依次加入不同氨基酸原料(由c-端向n-端順序)，重復(fù)震蕩反應(yīng)、洗滌、茚三酮檢測步驟。再按實(shí)施例1的制備方法(3)中所述，經(jīng)脫保護(hù)、dmf洗滌、裂解液裂解、乙醚沉淀、純化，完成串聯(lián)穿膜肽的合成。最后按照實(shí)施例1的制備方法(4)中所述，將脂肪酸加至三乙胺和串聯(lián)穿膜肽的dmf溶液中反應(yīng)，經(jīng)氮?dú)獯祾?、二乙醚清洗完成n端修飾。通過透析膜純化，干燥去除dmf后得到終產(chǎn)物即不同脂肪酸修飾的串聯(lián)穿膜肽。

再按實(shí)施例1中檢測方法進(jìn)行反相高效液相色譜檢測和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測得到的產(chǎn)物。脂肪酸優(yōu)選棕櫚酸時，得到序列如下：c16-r9-np1、c16-k9-np1、c16-r9-np2、c16-k9-np2。在此過程中不同的合成實(shí)驗(yàn)參數(shù)及檢測結(jié)果如下表1所示：

表1本發(fā)明所述部分自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦┑牟煌铣蓪?shí)驗(yàn)參數(shù)及檢測結(jié)果

實(shí)施例3

自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦ヽ16r9np2的自組裝分子動力學(xué)模擬及掃描電鏡形貌觀察

1、分子動力學(xué)模擬

對實(shí)施例1中自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦ヽ16r9np2進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。所用軟件為materialstudio，通過粗?；Ｐ?，計算其與水作用的flory-huggins參數(shù)，進(jìn)一步建立力場，進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。模擬結(jié)果如圖4所示，串聯(lián)穿膜肽在水溶液中自組裝形成了納米顆粒，其中內(nèi)部為疏水性棕櫚酸，外部為串聯(lián)穿膜肽。

2、掃描電鏡形貌觀察

利用冷場發(fā)射掃描電鏡(jsm-6330f)觀察c16r9np2在水溶液中的自組裝形態(tài)。用超純水將c16r9np2配制成0.5mg/ml肽溶液，取20μl肽溶液置于云母片上，并在室溫下自然風(fēng)干。將云母片固定于鋁柱上，然后鍍金用于觀察。圖5為14000倍下加速電壓為15.0kev時的c16r9np2水溶液的掃描電鏡圖，結(jié)果表明棕櫚酸修飾的串聯(lián)穿膜肽c16r9np2在水中自組裝形成了直徑小于150nm的顆粒。

該實(shí)施例自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑n端以脂肪酸修飾以增加疏水性，便于提高肽的兩親性，更易于自組裝的進(jìn)行。其在純水中即可在很低的肽濃度下自組裝形成納米顆粒，無需劇烈攪拌、超聲處理等機(jī)械作用，且具有較好的穩(wěn)定性。

實(shí)施例4

自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒抗菌劑c16r9np2在制備新型納米抗菌藥物中的應(yīng)用

1、最小抑菌濃度

受試菌株均來自廣東微生物種質(zhì)資源庫。金黃色葡萄球菌atcc29213，大腸桿菌cmcc44825，耐甲氧西林-金黃色葡萄球菌atcc43300在37℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。白色念珠菌atcc10231在37℃的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。利用微量稀釋法來測定肽納米顆粒的最小抑菌濃度mic。簡單來說，將50μl濃度為4.2到100.4μm的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒溶液和對照品r9肽溶液置于96孔板的每個孔中，再將相同體積的受試菌液添加到每個孔中以得到600nm處0.1到0.2的光密度讀數(shù)。放置于37℃的振蕩培養(yǎng)箱中溫育10～16h，每隔2小時在酶標(biāo)儀測量600nm處的光密度值，以觀察不到細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為該樣品的最低抑菌濃度。試驗(yàn)重復(fù)三次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，自組裝串聯(lián)穿膜肽c16r9np2納米顆粒以及陽性對照穿膜肽r9的最低抑菌濃度測定結(jié)果如表2所示。

表2最低抑菌濃度測定結(jié)果

結(jié)果表明，本發(fā)明所述的自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒對測試微生物均具有較好的抑菌效果，其對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為13.4μm，對大腸桿菌、耐甲氧西林金葡菌最小抑菌濃度為8.4μm，對白色念珠菌的最小抑菌濃度為50.3μm。而未自組裝的單一穿膜肽r9對測試細(xì)菌和真菌的抑制能力極低，表現(xiàn)為極高的最小抑菌濃度。納米顆粒的形成明顯增強(qiáng)了肽的抗菌能力，降低了最小抑菌濃度，因此本發(fā)明所述自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？砂l(fā)展成為有效的抑制微生物增殖的抗菌藥物。

2、掃描電子顯微鏡觀察微生物形貌變化

將培養(yǎng)好的菌溶液及經(jīng)串聯(lián)穿膜肽納米顆粒處理的菌溶液，在6000rpm離心10min后，用磷酸緩沖鹽溶液(pbs)洗滌細(xì)胞三次，然后在含有5％甲醛的pbs中隔夜固定。用一系列濃度梯度乙醇進(jìn)行脫水，然后冷凍干燥，固定于鋁柱上。在sem分析前用金包被樣品。圖6中a為空白對照的金黃色葡萄球菌，細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿完整，細(xì)胞表面呈光滑的圓形；b為經(jīng)串聯(lián)穿膜肽納米顆粒(最小抑菌濃度)處理后的金黃色葡萄球菌，其形貌發(fā)生明顯變化，可觀察到明顯的細(xì)胞破裂和細(xì)胞碎片；c為空白對照的白色念珠菌，其細(xì)胞表面完整光滑；d為經(jīng)串聯(lián)穿膜肽納米顆粒(最小抑菌濃度)處理后的的白色念珠菌，其形貌發(fā)生明顯變化，可見細(xì)胞膜消溶，細(xì)胞裂解死亡。掃描電子顯微鏡觀察到的微生物形貌變化，驗(yàn)證了本發(fā)明串聯(lián)穿膜肽納米顆粒c16r9np2的抗菌能力，表明其作用機(jī)制主要為破壞微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

3、溶血作用檢測

用pbs洗滌新鮮的人紅細(xì)胞，并稀釋成4％(按體積計)懸液，取100μl紅細(xì)胞懸液置于96孔板的每個孔中，然后向每孔添加100μl肽納米顆?；騼尚悦顾豣溶液(水溶性)，在37℃溫育1小時。之后取出細(xì)胞懸液于1000g離心取等份上清(100μl)轉(zhuǎn)移到96孔板，利用酶標(biāo)儀在540nm監(jiān)測血紅蛋白釋放。

使用下列公式計算溶血作用百分比:

溶血作用(％)＝[(納米顆粒溶液中的o.d.540nm-pbs中的o.d.540nm)/(0.1％tritonx-100中的o.d.540nm-pbs中的o.d.540nm)]x100

結(jié)果如圖7所示，納米顆粒具有低溶血作用，在25mg/l，對大腸桿菌和耐甲氧西林金葡菌的最小抑菌濃度，其溶血作用小于4％；在50mg/l，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度，其溶血作用小于5％。在同等濃度下，串聯(lián)穿膜肽納米顆粒比陽性對照藥物兩性霉素(水溶性)的溶血作用低。臨床上認(rèn)為小于5％溶血作用的醫(yī)用材料是安全的，因此，自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒c16r9np2的低溶血作用顯示出其作為有效的抗菌藥物的安全性，能用于感染疾病的治療。

實(shí)施例5

自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆?？咕鷦ヽ16r9np2穿透血腦屏障的檢測，以及在治療腦部感染中的應(yīng)用

所有涉及動物的程序均得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會(iacuc)的批準(zhǔn)，并且按照nationalinstituteofhealthguideforthecareanduseoflaboratoryanima1s(nihpublicationsno.85-23，1996年修訂)中闡述的指南進(jìn)行。

1、自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒的穿血腦屏障作用

實(shí)驗(yàn)過程參考任長虹等(大鼠腦脊液抽取的新方法，實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)，2012)，通過尾靜脈給成年sd大鼠(重量約為250g)注射c16r9np2純納米顆粒溶液。取腦脊液，1000g離心取上清，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測。腦脊液樣品檢測結(jié)果如圖8所示，分子離子峰對應(yīng)的數(shù)值為2984.254，與c16r9np2標(biāo)品2984.56一致，故為肽納米顆粒的特征峰，結(jié)果表明肽納米顆粒能夠穿過大鼠血腦屏障，進(jìn)入腦脊液，進(jìn)而能進(jìn)一步進(jìn)入腦組織。

2、自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒在治療腦部細(xì)菌感染中的作用

實(shí)驗(yàn)過程參考yi-yanyang等(self-assembledcationicpeptidenanoparticlesasanefficientantimicrobialagent，naturenanotechnology，2009)。向sd大鼠延髓池注入50μl的金黃色葡萄球菌液，通過尾靜脈每12h注射c16r9np2納米顆粒溶液，空白對照組注射生理鹽水，陽性對照組注射萬古霉素溶液。48h后取大鼠腦組織稱重并勻漿，取100μl勻漿液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布，計算其菌落數(shù)，即菌落形成單位，以lg菌落形成單位/克腦組織表示。結(jié)果如圖9所示，經(jīng)肽納米顆粒治療后，大鼠腦組織菌落數(shù)相較空白對照組(即未治療組)明顯減少，與經(jīng)兩性霉素治療組結(jié)果相近，表明其在治療大鼠腦部金葡菌感染中取得了明顯效果，抑制了細(xì)菌增長。因此，本發(fā)明所述自組裝串聯(lián)穿膜肽納米顆粒在制備治療腦部感染疾病的抗菌藥物中具有良好的應(yīng)用前景，可有效抑制受感染的腦部細(xì)菌的生長。

本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。