本發(fā)明屬于生物工程中的dna重組技術領域，具體涉及利用gst原核表達體系制備gst-pias387-121aa(aminoacid)融合蛋白的多克隆抗體及應用。

背景技術：

pias3是信號轉導和轉錄激活因子3(stat3)的抑制蛋白,能夠特異的與活化的stat3結合進而阻止stat3與dna結合。hpias3全長定位于人類第1號染色體1q21上，包含14個外顯子。

pias3在人類正常組織廣泛表達，而對于癌組織中的表達目前的研究結果有一定的爭議性。對來源于人體腦、乳腺、腎、肺、前列腺、皮膚、肝臟、食管、胃和結直腸10個部位的103例惡性腫瘤標本的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，pias3蛋白在其中100例(大約97％)中都有程度不同的高表達。而另外一些實驗組的研究表明pias3在胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和子宮內膜癌等癌癥中均表達減少或缺失。這種爭議性是否由于對不同剪接型pias3蛋白檢測的結果，值得深入研究?？贵w是蛋白質檢測和功能研究中的最有力工具之一，我們制備的針對pias3exon2特異表達肽段的高效價抗體對于系統(tǒng)研究68kdpias3全長蛋白在各種組織和細胞中的表達和作用機制具有十分重大的意義。另外，研究表明pias3蛋白能夠誘導前列腺癌凋亡，是前列腺癌抑癌蛋白，我們制備的抗體為pias3潛在分子機制的研究奠定了基礎。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種能夠用于表達pias3exon2特異肽段蛋白的檢測的模型，為從蛋白水平深入研究pias3功能及相關疾病提供必要的實驗工具。

利用基因工程技術，將pias3exon2特異表達肽段87-121位氨基酸(35aa)對應dna片段克隆到原核表達載體pgex-4t-1中。經酶切和序列分析后，用重組質粒轉化大腸桿菌bl21，并經異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導產生gst-pias3exon235aa融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清，并應用proteina/g將其純化，獲得多克隆抗體?？贵w的效價及特異性采用elisa和westernblot檢測，并應用免疫印跡和免疫組化檢測了pias3蛋白在前列腺癌細胞和前列腺癌組織中的表達與定位。

本發(fā)明的gst-pias3exon235aa融合蛋白是將利用特殊序列(pias3exon2特異表達肽段87-121位氨基酸對應dna片段)構建gst-pias3exon235aa融合蛋白原核表達載體，轉化bl21得到的高效表達特異性的gst-pias3exon235aa融合蛋白，這段87-121位氨基酸序列為：

其對應核苷酸序列為：

這種gst-pias3exon235aa融合蛋白及其多克隆抗體制備包括以下步驟：

第一步，克隆載體的構建

以人pias3cdna為模板，應用pcr技術,擴增得到的目的片段與pmd18-t載體連接，經轉化、提取等步驟得到重組質粒后，酶切鑒定并測序。

第二步，原核表達載體pgex-4t-1的構建

將克隆質粒和質粒pgex-4t-1雙酶切后，利用回收試劑盒獲得pias3基因該區(qū)片段和載體連接。經轉化、提取等步驟獲得重組的表達載體。酶切鑒定重組體，并且測序進一步確定。

第三步，gst-pias3exon235aa融合蛋白的誘導表達和純化

重組質粒pgex-4t-1/pias3exon235aa轉化大腸桿菌bl21，利用iptg誘導，gst-pias3exon235aa融合蛋白的表達。以sds-page進行鑒定，并優(yōu)化表達條件，進行大量擴增誘導。用超聲裂解細菌，所獲蛋白用glutathione-sepharose4b柱純化，sds-page鑒定純化產物。

第四步，兔抗pias3exon235aa抗血清的制備及純化

以純化的pias3exon235aa融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用300μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點注射。免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。2周后進行第1次加強免疫，300μg純化的gst-pias3exon235aa融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2周加強免疫1次。于末次免疫后1周取耳血，用elisa法測定抗體的效價，當抗體效價達到1∶100000時，頸動脈放血，收集血清。用proteina/g純化抗pias3exon235aa血清，準備蛋白asepharosecl-4b親和柱，親和層析使抗體結合在柱子上，經2次洗滌后，將抗體洗脫，達到純化目的，sds-page鑒定純化產物，獲得該發(fā)明的多克隆抗體。應用多種免疫學方法檢測其效價及特異性，結果顯示該抗體可特異性的與pias3蛋白結合。

利用pias3exon2特異表達肽段蛋白對應基因序列成功構建gst-pias3exon235aa融合蛋白原核表達載體，轉化bl21后可高效表達特異性的gst-pias3exon235aa融合蛋白。以該融合蛋白免疫兔子獲得抗gst-pias3exon235aa融合蛋白的高效價抗體經多種免疫學方法檢測抗體效價及特異性，結果表明抗體效價高達1∶1000000，且特異性良好?？贵w可應用于pias3蛋白的檢測，對于系統(tǒng)研究68kdpias3全長蛋白在各種組織和細胞中的表達和作用機制具有十分重大的意義。另外，pias3蛋白能夠誘導前列腺癌凋亡，是前列腺癌抑癌蛋白，我們制備的抗體為潛在機制的研究奠定了基礎。

附圖說明：

圖1：pcr擴增出的pias3基因87-121氨基酸片段dna瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2：雙酶切質粒pgex-4t-1；

圖3：pgex-4t-1/pias3exon235aa重組體酶切鑒定結果；

圖4：純化后的gst及gst-pias3exon235aa融合蛋白sds-page圖；

圖5：proteina/g純化后的pias3exon235aa抗體和純化前的抗pias3exon235aa血清sds-page圖；

圖6：間接elisa法測定抗體的效價；

圖7：pias3exon235aa抗體特異性的westernblot分析；

圖8：免疫組化檢測pias3在前列腺和前列腺癌組織中的表達；

具體實施方式：

實施例1：抗gst-pias3exon235aa血清的在制備

1.pcr-pmd18-t/pias3exon235aa重組質粒的構建

pias3mrna全長從genebank得到，基因序列號為genbank:nm_006099。pias3mrna序列從genebank得到，基因序列號為nm_006099。以cdna為模板，上游引物為5’-gaattcgtaggctcccctggtcctctagctcccattcccccaacgctgttggcccctggcaccctgc(含ecori酶切位點)；下游：5’-ctcgagtcactggggcagaggggg(含xhoi酶切位點)，應用pcr成功擴增出了pias3exon287-121氨基酸對應dna序列長度105bp【圖1】。擴增得到的片段與pmd18-t載體連接，將連接產物轉入感受態(tài)大腸桿菌dh5α中，在含amp⁺瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質粒后，以ecori和sali單酶切鑒定。

2.原核表達載體pgex-4t-1的構建

將含有pias3exon2特異表達肽段蛋白對應基因序列的pmd18-t質粒經ecori和xhoi雙酶切后(片段105bp)，利用回收試劑盒獲得pias3基因該區(qū)片段，同時用相同的酶處理質粒pgex-4t-1(約5kbp)【圖2】。然后將回收的pias3exon2特異表達肽段蛋白對應基因序列片段和經酶切的載體pgex-4t-1在t4dna連接酶作用下于16℃連接過夜。酶切鑒定重組體，結果顯示該pias3exon2特異表達肽段蛋白對應基因序列正確【圖3】。

3.gst-pias3exon235aa融合蛋白的誘導表達和純化

重組質粒pgex-4t-1/pias3exon235aa轉化大腸桿菌bl21，挑取單菌落接入lb/amp⁺培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)物按1∶50的比例轉接于含amp⁺的lb培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃搖床培養(yǎng)至對數生長中期。在培養(yǎng)液的a600為0.5～0.6時，加入iptg至終濃度為0.08mmol/l，不加入iptg者為陰性對照，置25℃繼續(xù)培養(yǎng)4～5h。離心收集菌體，以sds-page進行鑒定gst-pias3exon235aa融合蛋白的表達，并優(yōu)化表達條件，進行大量擴增誘導。以5000r/min于4℃離心5mins，收集菌體,用60ml冰預冷的netn懸浮1l菌液的沉淀。用超聲裂解細菌,再以9600rpm，于4℃離心15min，取上清，過glutathione-sepharose4b柱，先以等體積洗脫緩沖液1(含20mm谷胱甘肽、50mmtris-cl，ph＝8.0)洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2(含100mm谷胱甘肽)洗兩遍，收集洗脫液,sds-page鑒定純化產物【圖4】。

4.兔抗pias3exon235aa抗血清的制備

以純化的gst-pias3exon235aa融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用300μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點注射。免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。2wk后進行第1次加強免疫，300μg純化的gst-pias3exon235aa融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2wk加強免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用elisa法測定抗體的效價，當抗體效價達到1∶1000000時，頸動脈放血，收集血清。

5.proteina/g純化抗pias3exon235aa血清

將proteina/gsepharosecl-4b填料緩慢裝柱，平衡柱子后加入經過稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結合，即親和層析使抗體結合在柱子上，經2次洗滌后，加ph2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并測定各收集管的280nm光密度，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血清用sds-page和考馬斯亮藍染色鑒定。染色結果顯示純化效果明顯，純化后的樣品有清晰的輕、重鏈帶【圖5】。

實施例2:gst-pias3exon235aa抗體的分析及應用

1.gst-pias3exon235aa抗體效價的測定

用gst-pias3exon235aa融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照,將純化后的gst-pias3exon235aa抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后,用間接elisa測定抗體的效價。結果顯示,免疫前的兔血清未測出抗融合蛋白gst-pias3exon235aa的抗體，gst-pias3exon235aa抗體的滴度高達1∶1000000以上【圖6】。

2.gst-pias3exon235aa抗體應用于組織中pias3exon235aa蛋白的檢測

收集lncap和du145細胞，裂解超聲后用bca蛋白定量試劑盒對其進行蛋白定量，之后將樣品按差異蛋白量進行sds-page，再電轉移至硝酸纖維素膜上。以5％脫脂奶粉封閉1h，依次滴加兔抗pias3exon235aa抗體(室溫2h，pbs洗3次)及山羊抗兔igg2hrp(室溫反應1h，pbs洗滌3次),最后加底物dab顯色，并拍照。結果顯示【圖7】，我們制備的pias3deta抗體與lncap細胞所表達的pias3蛋白發(fā)生了抗原-抗體反應而在marker指示的68kd處出現(xiàn)了一條特異的蛋白帶，證明pias3exon235aa抗體特異性好。

3.前列腺組織pias3蛋白定位分析

將人前列腺癌穿刺組織切片經ph8.0edta熱修復后，pbs洗三次，每次5mins，滴加pbs(對照組)或兔抗pias3exon235aa抗體室溫1h，pbs洗3次；滴加二抗，室溫孵育30mins，pbs洗三次，每次5mins；dab染色，室溫染色3mins，自來水終止染色；蘇木精復染，脫水，封片并拍照。結果顯示【圖8】，pias3特異性的表達于前列腺上皮細胞，而在前列腺癌組織中表達缺失。

<110>東北師范大學

<120>利用gst表達體系制備抗人pias3高效價抗體及應用

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