本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種豬小腸抗菌肽的制備方法。
背景技術(shù)：
：抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)抗菌作用的活性多肽，是生物先天免疫的重要組成成分。迄今為止，已在許多生物包括動(dòng)物、植物及原核生物中發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)源性抗菌活性肽。豬源抗菌肽是從豬體內(nèi)分離得到的抗菌肽。由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對(duì)分子量較小、熱穩(wěn)定及水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，更為重要的是抗菌肽可作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞且不易使病原微生物產(chǎn)生耐藥的特點(diǎn)；因此，在當(dāng)前人類(lèi)濫用抗生素所帶來(lái)的全球耐藥性的嚴(yán)峻問(wèn)題下，對(duì)于了解豬體內(nèi)自然產(chǎn)生的抗菌肽的功能，以及設(shè)計(jì)一種方法來(lái)制備豬源抗菌肽以求替代抗生素的研究，便顯得極為重要，這勢(shì)必將對(duì)尋找抗生素替代品的研究與應(yīng)用起到積極的促進(jìn)作用?，F(xiàn)有提取豬小腸抗菌肽的方法，一般如下：取新鮮豬小腸，前處理后冷凍剪碎，組織搗碎機(jī)搗碎后，再用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎，勻漿后，按1∶1(v/v)加入5％乙酸，于4℃條件下攪拌過(guò)夜，次日，沸水浴15min，然后冰水浴，使其迅速冷卻。將混合物于4℃條件下，8,000rpm離心30min，取上清，4℃保存。將沉淀物用等體積5％乙酸混合，再次于4℃攪拌浸提過(guò)夜，重復(fù)上述離心過(guò)程，取上清，合并兩次上清液，調(diào)整ph值，再次離心，棄沉淀，上清液冷凍干燥即為抗菌肽類(lèi)物質(zhì)粗制品?，F(xiàn)有技術(shù)在粗提豬小腸抗菌肽組織搗碎的過(guò)程中，因含有較大組織塊，勻漿搗碎時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)器造成較大損傷，并且會(huì)降低原料使用率；當(dāng)組織搗碎不夠充分時(shí)，會(huì)影響反復(fù)凍融時(shí)細(xì)胞破碎的程度，最終影響抗菌肽的提取。另外，提取出的抗菌肽溶液存在滲透壓過(guò)高問(wèn)題，即使在后期加入注射用水降低滲透壓，還是會(huì)造成抗菌肽溶液濃度降低問(wèn)題，從而降低產(chǎn)品質(zhì)量；此外，在進(jìn)行二次浸提時(shí)，不僅提取的多肽類(lèi)物質(zhì)顯著少于第一次提取，而且還會(huì)加重滲透壓過(guò)高的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在不降低抗菌肽溶液濃度的前提下，解決滲透壓過(guò)高問(wèn)題從而提高抗菌肽提取質(zhì)量的豬小腸抗菌肽的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種豬小腸抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用注射用水沖洗干凈，然后將豬小腸放置于80-100℃熱水中處理至腸壁出現(xiàn)褶皺，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；2)將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶90-99混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無(wú)熱源的容器中并置于凍庫(kù)中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融5-6次；3)將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸(分析純)按照質(zhì)量比100∶1-10混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液沸水浴8-15min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，離心，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；4)將上述沉淀物與注射用水按照質(zhì)量比1∶1.8-2.2混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在溫度-10℃以下，冷凍2-4小時(shí)后(待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍)離心，收集二次上清液體；5)合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過(guò)0.22-0.45μm和5-10kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾，收集濾膜透過(guò)液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至5.0-7.2之間，再經(jīng)0.1μm-0.22μm除菌濾器過(guò)濾，得到豬小腸抗菌肽。進(jìn)一步，所述步驟2)，勻漿液與注射用水的質(zhì)量比為100∶97.13。進(jìn)一步，所述步驟3)，反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸的質(zhì)量比為100∶2.87。進(jìn)一步，所述步驟3)，混合液在攪拌條件下進(jìn)行沸水浴。進(jìn)一步，所述步驟3)，冷卻后的混合液于4℃、6000-7500r/min離心20-30min。進(jìn)一步，所述步驟4)，沉淀物與注射用水的質(zhì)量比為1∶2.12。進(jìn)一步，所述步驟4)，冷凍后的浸提液于4℃、6000-7500r/min離心20-30min。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，在豬小腸冷卻絞碎前，增加一個(gè)熱處理步驟，即前期處理后的小腸在溫度為80-100℃熱水中處理15-25s，再迅速冷卻，隨后剪碎，搗碎，該方法可以使豬小腸在絞肉機(jī)及膠體磨中勻漿時(shí)，豬小腸碾磨的比未熱處理的更細(xì)，幾乎不會(huì)有大顆粒的組織存在，不僅提高原料的使用率，而且能夠減少對(duì)儀器的損傷。同時(shí)，由于不存在大顆粒的組織塊，隨后進(jìn)行的反復(fù)凍融過(guò)程，能夠更加充分的破碎細(xì)胞，釋放更多的豬小腸抗菌肽。本發(fā)明所述步驟3)，混合液在沸水浴過(guò)程中，攪拌機(jī)應(yīng)不斷攪拌以保證受熱均勻，反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸按照質(zhì)量比100∶1-10混合均勻，優(yōu)選為1∶2.87％，2.87％的乙酸溶液提取多肽類(lèi)物質(zhì)含量不僅與5％乙酸溶液提取的差異不明顯，而且2.87％的乙酸溶液提取的抗菌肽溶液滲透壓是5％乙酸溶液提取的一半，避免出現(xiàn)滲透壓過(guò)高的現(xiàn)象。本發(fā)明所述步驟4)，將沉淀物與注射用水按照質(zhì)量比1∶1.8-2.2混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)得到浸提液，以注射用水當(dāng)?shù)诙谓嵋海粌H可以起到和2.87％乙酸溶液相同的作用，而且所獲得的二次上清液跟一次上清液液混合之后能夠起到平衡滲透壓的作用。本發(fā)明所述步驟5)，合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過(guò)0.22-0.45μm、5-10kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾以及0.1μm-0.22μm除菌濾器過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾過(guò)液ph值至5.0-7.2之間，從而獲得豬小腸抗菌肽溶液。經(jīng)過(guò)微濾、超濾和除菌過(guò)濾的豬小腸抗菌肽溶液符合獸藥生物制品無(wú)菌及無(wú)內(nèi)毒素要求，可直接使用于動(dòng)物注射，避免由于滲透壓過(guò)高引起動(dòng)物應(yīng)激。具體實(shí)施方式一種豬小腸抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用注射用水沖洗干凈，然后將豬小腸放置于80-100℃熱水中處理至腸壁褶皺，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；2)將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶90-99混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無(wú)熱源的容器中并置于凍庫(kù)中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融5-6次；3)將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸按照質(zhì)量比100∶1-10混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴8-15min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、6000-7500r/min離心20-30min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；4)將上述沉淀物與注射用水按照質(zhì)量比1∶1.8-2.2混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在溫度-10℃以下，冷凍2-4小時(shí)后(待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍)于4℃、6000-7500r/min離心20-30min，收集二次上清液體；5)合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過(guò)0.22-0.45μm和5-10kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾，收集濾膜透過(guò)液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至5.0-7.2之間，再經(jīng)0.1μm-0.22μm除菌濾器過(guò)濾，得到豬小腸抗菌肽。實(shí)施例1一種豬小腸抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用注射用水沖洗干凈，然后將豬小腸放置于90℃熱水中處理至腸壁褶皺，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；2)將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶97.13混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無(wú)熱源的容器中并置于凍庫(kù)中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融6次；3)將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸按照質(zhì)量比100∶2.87混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴10min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、7000r/min離心25min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；4)將上述沉淀物與注射用水按照質(zhì)量比1∶2.12混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)得到浸提液，將浸提液在-10℃條件以下，冷凍3小時(shí)后(待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍)于4℃、7000r/min離心25min，收集二次上清液體；5)合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過(guò)0.22μm和10kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾，收集濾膜透過(guò)液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至6.5，再經(jīng)0.1μm除菌濾器過(guò)濾，得到豬小腸抗菌肽。對(duì)比例1按以下的現(xiàn)有技術(shù)方法提取抗菌肽類(lèi)物質(zhì)。馬衛(wèi)明等.豬小腸抗菌肽的提取及部分生物學(xué)活性研究.《科學(xué)技術(shù)與工程》.2004.第4卷(第3期)，第202-205.取新鮮豬小腸，去脂、漿膜和內(nèi)容物，稱(chēng)重，冷凍剪碎，組織搗碎機(jī)搗碎3次，每次2min，再用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎10次，每次3s。勻漿后，按1∶1(v/v)加入5％乙酸溶液，于4℃條件下攪拌過(guò)夜，次日，隔水煮沸15min，然后冰水浴，使其迅速冷卻。將混合物于4℃條件下，8,000r/min離心30min，取上清，4℃保存。將沉淀物用等體積5％乙酸溶液混合，再次于4℃攪拌浸提過(guò)夜，重復(fù)上述離心過(guò)程，取上清，合并兩次上清液，調(diào)整ph值，再次離心，棄沉淀，上清液冷凍干燥即為抗菌肽類(lèi)物質(zhì)粗制品。將抗菌肽粗制品用注射用水重新溶解至原上清液體積后，依次經(jīng)過(guò)0.22μm和10kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾，收集濾膜透過(guò)液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至6.5，再經(jīng)0.1μm除菌濾器過(guò)濾，得到豬小腸抗菌肽。按照實(shí)施例1的方法與對(duì)比例1的方法提取豬小腸抗菌肽，提取出的抗菌肽溶液滲透壓以及多肽類(lèi)物質(zhì)濃度對(duì)比如表1和表2所示，其中實(shí)施例1和對(duì)比例1均做三次平行試驗(yàn)：表1抗菌肽溶液的滲透壓(mosm/kg)平行試驗(yàn)1平行試驗(yàn)2平行試驗(yàn)3傳統(tǒng)工藝(現(xiàn)有技術(shù))740780843改進(jìn)工藝(實(shí)施例1)295305289表2抗菌肽溶液中多肽物質(zhì)濃度(mg/ml)平行試驗(yàn)1平行試驗(yàn)2平行試驗(yàn)3傳統(tǒng)工藝(現(xiàn)有技術(shù))1.431.451.38改進(jìn)工藝(實(shí)施例1)1.511.391.42由表1可知，本發(fā)明方法提取的抗菌肽溶液滲透壓明顯低于傳統(tǒng)方法，且滲透壓均符合正常動(dòng)物機(jī)體滲透壓的生理標(biāo)準(zhǔn)。由表2可知，本發(fā)明方法提取的抗菌肽溶液在降低滲透壓的同時(shí)，并不降低抗菌肽有效活性成分多肽物質(zhì)的濃度。改進(jìn)工藝與傳統(tǒng)工藝相比較：在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，改進(jìn)工藝不僅提高了生產(chǎn)效率，還降低了生產(chǎn)成本。實(shí)施例2一種豬小腸抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用注射用水沖洗干凈，然后將豬小腸放置于80℃熱水中處理至腸壁褶皺，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；2)將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶90混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無(wú)熱源的容器中并置于凍庫(kù)中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融6次；3)將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸按照質(zhì)量比100∶10混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴8min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、6000r/min離心30min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；4)將上述沉淀物與注射用水按照質(zhì)量比1∶1.8混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在-24℃條件下，冷凍2小時(shí)后(待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍)于4℃、6000r/min離心30min，收集二次上清液體；5)合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過(guò)0.45μm和5kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾，收集濾膜透過(guò)液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至5.0，再經(jīng)0.1μm除菌濾器過(guò)濾，得到豬小腸抗菌肽。實(shí)施例3一種豬小腸抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用注射用水沖洗干凈，然后將豬小腸放置于100℃熱水中處理至腸壁褶皺，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；2)將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶99混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無(wú)熱源的容器中并置于凍庫(kù)中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融5次；3)將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸按照質(zhì)量比100∶1混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴15min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、7500r/min離心20min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；4)將上述沉淀物與注射用水按照質(zhì)量比1∶2.2混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在-10℃條件下，冷凍4小時(shí)后(待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍)于4℃、7500r/min離心20min，收集二次上清液體；5)合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過(guò)0.3μm和7kd濾膜進(jìn)行切向流過(guò)濾，收集濾膜透過(guò)液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至7.2，再經(jīng)0.22μm除菌濾器過(guò)濾，得到豬小腸抗菌肽。當(dāng)前第1頁(yè)12