本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種可作為基因載體的兩親性多肽分子。

背景技術(shù)：

基因治療是近年來發(fā)展非常迅速的先進治療方法，是將有治療作用的基因通過合適的載體導入人體靶細胞以發(fā)揮治療疾病目的的生物醫(yī)學技術(shù)?；蜉d體包括病毒類載體和非病毒載體，其中病毒類載體有很大的安全隱患，會引起并發(fā)癥甚至導致患者死亡，而非病毒載體因其安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點則已成為病毒類載體最有希望的替代者。

一個分子要成為非病毒基因載體，不僅需要其具有高效的dna/rna凝聚效果，還需要其能夠有效地將dna/rna載入細胞內(nèi)部并成功釋放，從而實現(xiàn)有效轉(zhuǎn)染。目前研究較多的dna轉(zhuǎn)染試劑多為高分子陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺等。但是，陽離子聚合物作為dna凝聚試劑用作基因載體存在兩個突出問題：第一，在生理條件下陽離子聚合物易于與dna發(fā)生解離，而裸dna分子容易被核酸酶降解、傳輸過程中又易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而清除；第二，高分子量和較高濃度的陽離子聚合物雖然具有較理想的轉(zhuǎn)染效率，但由于其富含正電荷且在體內(nèi)不可降解，具有較強的細胞毒性。因此，研發(fā)具有毒性低、可降解的高效的非病毒基因轉(zhuǎn)染試劑對基因治療的發(fā)展有著重要意義和廣闊應(yīng)用前景。

肽分子由氨基酸殘基組成，具有生物相容性高、毒性低、體內(nèi)可降解等優(yōu)點，且短肽分子的可設(shè)計性強，因此，如果能夠設(shè)計一種合適的短肽分子，在其中引入較多正電荷使其具有強的dna/rna結(jié)合能力，并使分子具有較高的細胞結(jié)合能力和穿透性，從而得到高效的基因轉(zhuǎn)染試劑將是本領(lǐng)域所研究的重要課題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了一種可作為基因載體的兩親性多肽分子，能夠與基因分子結(jié)合，誘導其有效凝聚，進而將其轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部，實現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)染。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種可作為基因載體的兩親性多肽分子，所述兩親性多肽分子具有如下序列：

ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2，具體結(jié)構(gòu)如下：

其中，arg為精氨酸，gly為甘氨酸，asp為天冬氨酸，pro為脯氨酸，ala為丙氨酸，ile為異亮氨酸。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述兩親性多肽分子含有具有細胞結(jié)合能力的arg-gly-asp片段，具有基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性的gly-pro-leu-gly-leu-ala片段，以及具有與基因分子結(jié)合并將基因分子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部的arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg片段。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述兩親性多肽分子在ph為7.0的tris緩沖液中，濃度在達到1.0mm以上時，呈球狀聚集體結(jié)構(gòu)，直徑為5-100nm。

本發(fā)明又提供了一種由上述任一項技術(shù)方案所述的可作為基因載體的兩親性多肽分子所制備得到的基因轉(zhuǎn)染試劑。由于上述技術(shù)方案所提供的兩親性多肽分子結(jié)構(gòu)中分別含有具有細胞結(jié)合能力的片段、具有基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性的片段，以及具有與基因分子結(jié)合并將基因分子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部的片段，因此，其可作為基因載體與基因分子結(jié)合，誘導其發(fā)生凝聚，進而將其轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部，因此，可制備成為具有高效基因轉(zhuǎn)染效率的基因轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明還提供了一種由上述任一項技術(shù)方案所述的可作為基因載體的兩親性多肽分子在制備基因轉(zhuǎn)染試劑中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述兩親性多肽分子在濃度100μm以下時對人體細胞不具有毒性。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述人體細胞選自人胚腎細胞293e、人肺癌細胞a549、人宮頸癌細胞hela和人肝癌細胞hepg2中的至少一種。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述兩親性多肽分子在與λ-dna分子混合時，混合體系在600nm波長處的熒光強度隨所述兩親性多肽分子所帶正電荷數(shù)量與λ-dna分子所帶負電荷數(shù)量的比值的增加而減小，并在比值在3-10之間達到平衡，使λ-dna分子由伸展構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槟蹣?gòu)象。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，混合體系達到平衡時，λ-dna分子與所述兩親性多肽分子的復合物結(jié)構(gòu)呈球狀或棒狀，尺寸為50-200nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于：

1、本發(fā)明提供的可作為基因載體的兩親性多肽分子結(jié)構(gòu)中分別含有具有細胞結(jié)合能力的片段、具有基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性的片段，以及具有與基因分子結(jié)合并將基因分子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部的片段，因此，該兩親性多肽分子能夠與基因分子結(jié)合，誘導其有效凝聚，進而將其轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部，實現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)染。

2、本發(fā)明提供的可作為基因載體的兩親性多肽分子在與λ-dna分子混合時，當兩親性多肽分子正電荷數(shù)目與λ-dna分子負電荷數(shù)目的比值在3-10之間達到平衡時，可使λ-dna分子由伸展構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨葔嚎s的凝聚構(gòu)象。

3、本發(fā)明提供的可作為基因載體的兩親性多肽分子在濃度≤100μm時，對人體細胞以及動物細胞不具有毒性。

4、本發(fā)明提供的可作為基因載體的兩親性多肽分子作為基因載體，在轉(zhuǎn)運質(zhì)粒進入人體細胞內(nèi)部并實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染時，表達出高效的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率高達70％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例所提供的不同濃度的可作為基因載體的兩親性多肽分子溶液的圓二色譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例所提供的不同濃度的可作為基因載體的兩親性多肽分子溶液的原子力顯微鏡形貌圖，其中(a)0.1mm，(b)1.0mm；

圖3(a)為本發(fā)明實施例所提供的可作為基因載體的兩親性多肽分子和λ-dna分子(濃度為10μg/ml)的混合溶液(溶液中同時存在濃度為1.54×10-3mm的溴化乙錠)中，體系在600nm波長處的熒光強度(激發(fā)波長：520nm)隨兩親性多肽分子正電荷數(shù)目與λ-dna分子負電荷數(shù)目的比值(+/-)變化圖；(b)為兩親性多肽分子/λ-dna混合溶液(+/-＝3)時聚集體結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡形貌圖；

圖4為本發(fā)明實施例所提供的不同種類的細胞在兩親性多肽分子存在下的存活率表征圖；

圖5為本發(fā)明實施例所提供的由兩親性多肽/綠色熒光蛋白質(zhì)粒pegfp-n2(+/-＝50)構(gòu)成的質(zhì)?；旌象w系對人胚腎細胞293e細胞轉(zhuǎn)染效果的倒置熒光顯微鏡照片。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

可作為基因載體的兩親性多肽分子的合成(以合成0.25mmol肽分子為例)

1、材料

(1)稱取負載量為0.318mmol/g的mbha樹脂0.982g，dcm溶脹一夜；

(2)配制濃度為0.2mol/l的下列氨基酸的dmf(二甲基甲酰胺)溶液：

fmoc-ala-oh(n-芴甲氧羰酰基-丙氨酸)：體積11ml，質(zhì)量0.82g；

fmoc-gly-oh(n-芴甲氧羰?；?甘氨酸)：體積56ml，質(zhì)量1.90g；

fmoc-pro-oh(n-芴甲氧羰?；?脯氨酸)：體積11ml，質(zhì)量0.74g；

fmoc-ile-oh(n-芴甲氧羰?；?異亮氨酸)：體積32ml，質(zhì)量2.26g；

fmoc-lys(boc)-oh(n-芴甲氧羰?；?n’-叔丁氧羰?；?賴氨酸)：體積32ml，質(zhì)量3.00g；

fmoc-arg(pbf)-oh(n-芴甲氧羰?；?2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)：體積84ml，質(zhì)量10.92g；

fmoc-leu-oh(n-芴甲氧羰?；?亮氨酸)：體積21ml，質(zhì)量1.51g；

fmoc-d-asp-otbu(n-芴甲氧羰基-d-天冬氨酸-1-叔丁酯)：體積1ml，質(zhì)量0.96g；

配置上述溶液后，充分攪拌溶解，氨基酸用量均以2倍計算，保證充分反應(yīng)。

(3)配制下列合成試劑：

a)活化劑(0.45mhbtu、0.45mhobt的dmf溶液)：稱取11.44ghbtu和4.07ghobt充分溶解于67mldmf溶液；

b)活化堿(2mdiea的dmf溶液)：量取11.84ml二異丙基乙胺(diea)和22.17mldmf充分混合；

c)脫保護劑(20％(v/v)哌啶/0.1mhobt的dmf溶液)：量取74.8ml哌啶，稱取5.05ghobt充分溶解于300ml的dmf溶液；

d)蓋帽劑(20％(v/v)乙酸酐、0.125mdiea、0.015mhobt的dmf溶液):量取2.2ml乙酸酐、0.24mldiea，稱取0.0223ghobt，充分溶解于8.8mldmf溶液；

e)裂解劑(體積比tfa:tis:water＝95:2.5:2.5)：量取14.25mltfa，0.375mltis，0.375mlwater充分混合。

(4)利用cem公司的liberty微波多肽合成儀、應(yīng)用fmoc固相合成法合成多肽，得到尚未裂解的連接有樹脂的多肽粗產(chǎn)品。

(5)反應(yīng)完成后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶內(nèi)，在35℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去dcm(二氯甲烷)、tfa等殘余液體。用滴管將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的液體逐滴加入7-8倍殘液體積的冰乙醚內(nèi)，靜置產(chǎn)生沉淀后，用高速冷凍離心機在9000rpm、4℃條件下離心10min，反復乙醚沉淀，離心5-6次。除去上層清液，保留沉淀，通風櫥內(nèi)待乙醚揮發(fā)完之后，向沉淀中加超純水，超聲搖勻，放入冰箱中預凍1h，再使用凍干機-60℃冷凍干燥24h左右，得到純化產(chǎn)品，即兩親性多肽，于-20℃密封保存。

實施例2

可作為基因載體的兩親性多肽分子的形貌及二級結(jié)構(gòu)的探究

配制一系列兩親性多肽分子的tris緩沖液(ph7.0)，分子序列如下：

ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2，其濃度分別為0.015mm，0.040mm，0.100mm，0.250mm和1.0mm，室溫放置3天，觀察圓二色性譜圖結(jié)果和原子力顯微鏡結(jié)果。

圓二色性譜圖結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)分子在所配溶液濃度范圍內(nèi)皆呈現(xiàn)為α-螺旋二級結(jié)構(gòu)；原子力顯微鏡結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)在1.0mm濃度以下溶液中有許多球狀聚集體存在，直徑為5-100nm。

實施例3

可作為基因載體的兩親性多肽分子與λ-dna分子混合之后的形貌及結(jié)構(gòu)探究

將兩親性多肽分子，分子序列如下：

ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2與λ-dna分子混合，其中，固定λ-dna的濃度為10μg/ml，混合溶液中同時加入濃度為1.54×10^3-mm溴化乙錠etbr，控制兩親性多肽分子濃度，使其正電荷數(shù)目與λ-dna分子負電荷數(shù)目的比值(+/-)從小到大依次增加，并在600nm波長處觀察混合體系的熒光強度變化(激發(fā)波長：520nm)。

熒光強度變化結(jié)果如圖3a所示，熒光強度隨比值(+/-)的增加而減小，并在比值(+/-)>3.0時達到平衡，這說明兩親性多肽分子能夠有效取代etbr與λ-dna分子結(jié)合。進一步，可觀察發(fā)現(xiàn)兩親性多肽分子在與λ-dna分子復合后，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為球狀或者棒狀，尺寸為50-200nm，如圖3b所示。

實施例4

細胞毒性試驗

首先在無菌的96孔板中接種100μl密度為1×10⁵細胞/ml的細胞，置于37℃培養(yǎng)箱中24h，待其貼壁后將孔板中的培養(yǎng)液吸出，向每個孔中加入100μl新鮮培養(yǎng)液和100μl經(jīng)過過濾的不同濃度的兩親性多肽溶液，其吸光度為abspeptide，每個濃度設(shè)立4個平行，另外用只加tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、不加兩親性多肽的孔作為對照組，其吸光度為abstris，之后將孔板重新置于37℃培養(yǎng)箱中6h，作用完成后，向每個孔中加入20μl濃度為5mg/ml的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后將孔板中的液體吸出，在每個孔中加入150μl的二甲基亞砜，并向空白孔中加入等量的二甲基亞砜作為調(diào)零孔，其吸光度為absblank，然后將孔板置于搖床上震蕩10min使之充分混勻，最后用酶標儀測定570nm處的吸光值。細胞存活率的計算公式為：

細胞存活率＝1-(abstris-abspeptide)/(abstris-absblank)

由圖4可以看出，兩親性多肽分子的濃度在100μm以下時，人胚腎細胞293e、人肺癌細胞a549、人宮頸癌細胞hela和人肝癌細胞hepg2的存活率都在80％以上，也就是說該兩親性多肽分子在濃度100μm以下時對所研究的細胞基本沒有毒性。

實施例5

細胞轉(zhuǎn)染試驗

在24孔板中培養(yǎng)貼壁人胚腎細胞293e；將2.4μg兩親性多肽分子溶于50μldmem溶液，室溫放置5分鐘；將0.8μg綠色熒光蛋白質(zhì)粒pegfp-n2溶于50μldmem溶液，室溫放置5分鐘；將兩親性多肽分子溶液加入到pegfp-n2溶液中，控制其濃度使兩親性多肽分子所帶正電荷與質(zhì)粒所帶負電荷比值從0到10依次增加，室溫放置20分鐘；小心移除24孔板中的培養(yǎng)介質(zhì)，新加入500μl不含血清的培養(yǎng)介質(zhì)，并加入100μl兩親性多肽/pegfp-n2混合溶液，放置4小時；小心移除培養(yǎng)介質(zhì)，加入500μl含有fbs的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時；用倒置熒光顯微鏡觀察綠色蛋白表達情況，判斷轉(zhuǎn)染效果。

由圖5可以看出，本實施例所提供的兩親性多肽分子可以作為基因載體，轉(zhuǎn)運pegfp-n2質(zhì)粒進入人胚腎細胞293e內(nèi)部并實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，表達出綠色熒光蛋白(gfp)，轉(zhuǎn)染效率高達70％以上。