本發(fā)明涉及一種細(xì)胞穿膜肽、生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層組成，其內(nèi)部由疏水性的非極性分子構(gòu)成。細(xì)胞膜是物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的屏障，其僅僅允許分子量小于600da的非脂溶性分子進(jìn)入活細(xì)胞。這一屏障雖然對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，但也使一些有價(jià)值的親水性大分子藥物難以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部達(dá)到有效治療濃度，使得這類(lèi)有治療價(jià)值但無(wú)細(xì)胞穿透性且易降解的親水性分子在細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用大大受到限制。

在過(guò)去的幾十年里，人們發(fā)現(xiàn)了一些肽和蛋白質(zhì)能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且多種運(yùn)載分子也可以與這些肽和蛋白質(zhì)連接并易位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這些肽和蛋白質(zhì)載體構(gòu)成一種新的很有潛力的藥物運(yùn)輸載體，即細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,cpps)，它是一大類(lèi)由10-30個(gè)氨基酸組成的短肽，也稱(chēng)為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintranslocationdomain,ptd)。這些肽分子不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞膜的永久性損傷，并且毒性低。特別是人源性穿膜肽(hcpp)，其與其他生物來(lái)源地cpps相比，hcpp引起人體的免疫反應(yīng)的可能性比較小，潛在的不安全因素相對(duì)較少(如hpp10公開(kāi)號(hào)：102863516a)，但對(duì)于hpp10來(lái)說(shuō)，其介導(dǎo)質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染的效率較低，影響其作為藥物胞內(nèi)運(yùn)載工具的應(yīng)用前景。

膽固醇是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，其廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)。其溶解性與脂肪類(lèi)似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑。膽固醇是動(dòng)物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅參與形成細(xì)胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素d以及甾體激素的原料。膽固醇是許多天然生物膜的重要成分，本身并不形成膜的結(jié)構(gòu)，但是能夠以1:1甚至2:1的摩爾比插入磷脂膜中。

在相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)膽固醇可應(yīng)用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體中，其可作為陽(yáng)離子類(lèi)脂疏水尾部。在陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，膽固醇作為疏水尾部，其優(yōu)點(diǎn)有：①在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中，膽固醇的存在加強(qiáng)了微團(tuán)形成的穩(wěn)定性及進(jìn)一步提高了包封率；②由于膽固醇就是形成細(xì)胞膜的重要物質(zhì)，在脂質(zhì)體中加入膽固醇進(jìn)一步提高了與細(xì)胞的結(jié)合率。有研究表明，脂質(zhì)體中含有膽固醇成分對(duì)細(xì)胞攝取的促進(jìn)作用顯著高于無(wú)膽固醇成分的脂質(zhì)體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新型的膽固醇修飾下的人源性細(xì)胞穿膜肽hpp-chol的生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染的方法。

本發(fā)明所涉及的細(xì)胞穿膜肽hpp-chol，其氨基酸序列表達(dá)如下：

chol-kiplprfklkcifckkrrkr。

所述穿膜肽hpp-chol能夠與生物小分子共價(jià)或非共價(jià)作用相互結(jié)合，并攜帶生物小分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

所述穿膜肽hpp-chol在c端或n端共價(jià)或非共價(jià)連接標(biāo)記物或載物分子，并攜帶標(biāo)記物或貨物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，優(yōu)選地所述標(biāo)記物選自由熒光素、生物素、特定的親和基團(tuán)所組成的組；優(yōu)選地所述貨物分子選自由糖類(lèi)、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子、納米微球所組成的組。

本發(fā)明提供上述新型的膽固醇修飾下人源性細(xì)胞穿膜肽的生產(chǎn)方法。該方法既可以在實(shí)驗(yàn)室水平也可在工業(yè)水平進(jìn)行合成，生產(chǎn)方法優(yōu)選化學(xué)合成法。

化學(xué)合成方法生產(chǎn)穿膜肽hpp-chol，本發(fā)明中優(yōu)選樹(shù)脂：fmoc-arg(pbf)-wang樹(shù)脂或h-arg(pbf)-2cl樹(shù)脂，采用固相fmoc法合成，具體合成純化步驟如下：

(1)稱(chēng)取一定量樹(shù)脂倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量dmf，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂1-10倍摩爾量的每步投料的氨基酸，1-10倍摩爾量的碳二亞型縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺(dcc))或苯并三唑鎓鹽型縮合劑溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氫呋喃(thf)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)脫除上述多肽鏈n端fmoc-lys(boc)-oh上面的保護(hù)基fmoc，使n端裸露出來(lái)。然后稱(chēng)取1-10倍量的膽固醇甲酰氯，1-10倍量的hbtu，加入dmf溶劑置于搖床中反應(yīng)48小時(shí)后，濾去溶液，用dmf反復(fù)洗滌9次。

(9)將干燥后的樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用tfa洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(10)運(yùn)用hplc/ms法對(duì)所述多肽粗品進(jìn)行多肽的鑒定和純化，純化后得到所需細(xì)胞穿膜肽hpp-chol。

同時(shí)，本發(fā)明提供上述新型的膽固醇修飾下人源性細(xì)胞穿膜肽hpp-chol介導(dǎo)的質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染方法，包括以下步驟：

(1)將質(zhì)粒pegfp或pdsred與合成后穿膜肽分別混合于磷酸鹽緩沖液(pbs)中；

(2)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的n/p比(nh⁺3/po^-4),調(diào)整兩者間n/p比分別為0、1、3、5、10、20、40、80，并添加對(duì)照組，即使用2000進(jìn)行穿膜對(duì)照，室溫或者37℃孵育半個(gè)小時(shí)或一個(gè)小時(shí)；

(3)養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)胞，用沒(méi)有血清的培養(yǎng)基洗兩次，加入質(zhì)粒dna和穿膜肽復(fù)合物加入到500ul培養(yǎng)基中；

(4)6小時(shí)候去掉培養(yǎng)基加含有10％fcs的新鮮培養(yǎng)基；

(5)靜置1-4小時(shí)后即可。

本發(fā)明所述細(xì)胞穿膜肽具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1)低毒安全：本發(fā)明是基于人源性細(xì)胞穿膜肽的改進(jìn)與修飾，免疫原性低，安全低毒；

2)經(jīng)濟(jì)：該穿膜肽由固相合成而得，成本較低且便于質(zhì)量管控；

3)高效：該穿膜肽的穿膜效果顯著，效率高于2000；

本發(fā)明穿膜肽hpp-chol可廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)藥物、保健品、美容或護(hù)膚品、轉(zhuǎn)染試劑或診斷試劑的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說(shuō)明。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例細(xì)胞穿膜肽與質(zhì)粒dna結(jié)合后最優(yōu)n/p比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖2a為本發(fā)明實(shí)施例細(xì)胞穿膜肽用于bhk21細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果示意圖。

圖2b為本發(fā)明實(shí)施例細(xì)胞穿膜肽用于b16細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例細(xì)胞穿膜肽用于bhk21及b16轉(zhuǎn)染得到的熒光值。

圖4a為本發(fā)明實(shí)施例細(xì)胞穿膜肽用于bhk21mtt結(jié)果示意圖。

圖4b為本發(fā)明實(shí)施例1-6細(xì)胞穿膜肽用于b16mtt結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的細(xì)胞穿膜肽hpp-chol，其氨基酸序列表達(dá)如下：

chol-kiplprfklkcifckkrrkr。

穿膜肽hpp-chol能夠與生物小分子共價(jià)或非共價(jià)作用相互結(jié)合，并攜帶生物小分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

穿膜肽hpp-chol在c端或n端共價(jià)或非共價(jià)連接標(biāo)記物或載物分子，并攜帶標(biāo)記物或貨物分子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。標(biāo)記物選自由熒光素、生物素、特定的親和基團(tuán)所組成的組；貨物分子選自由糖類(lèi)、多肽、蛋白、藥物分子前體、納米粒子、納米微球所組成的組。

本發(fā)明提供上述新型的膽固醇修飾下人源性細(xì)胞穿膜肽的生產(chǎn)方法。該方法既可以在實(shí)驗(yàn)室水平也可在工業(yè)水平進(jìn)行合成，生產(chǎn)方法優(yōu)選化學(xué)合成法。

實(shí)施例1：

(1)稱(chēng)取一定量fmoc-arg(pbf)-wang樹(shù)脂或h-arg(pbf)-2cl樹(shù)脂，倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量dmf，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂1倍摩爾量的每步投料的氨基酸，1倍摩爾量的碳二亞型縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺(dcc))或苯并三唑鎓鹽型縮合劑(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸鹽(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氫呋喃(thf)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)脫除上述多肽鏈n端fmoc-lys(boc)-oh上面的保護(hù)基fmoc，使n端裸露出來(lái)。然后稱(chēng)取1-10倍量的膽固醇甲酰氯，1-10倍量的hbtu，加入dmf溶劑置于搖床中反應(yīng)48小時(shí)后，濾去溶液，用dmf反復(fù)洗滌9次。

(9)將干燥后的樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用tfa洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(10)運(yùn)用hplc/ms法進(jìn)行多肽的鑒定和純化，純化條件如下：應(yīng)用高階液相色譜waters2489檢測(cè)器，waters二元泵，分析柱bostonannlytics，在室溫20℃，流速1-5ml/min條件下，a相為0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，b相為0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；應(yīng)用型號(hào)為waterszq2000的質(zhì)譜儀，esi探針，nebulizergasfloe為1.5-3l/min，介質(zhì)為50-80％乙腈。

(11)按照上述化學(xué)合成方法得到穿膜肽hpp-chol，并將質(zhì)粒pegfp或pdsred與上述穿膜肽分別混合于磷酸鹽緩沖液(pbs)中；

(12)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的n/p比(nh⁺3/po^-4),調(diào)整兩者間n/p比分別為0、1、3、5、10、20、40、80；

(13)將上述調(diào)整好n/p比的混合液進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，最優(yōu)n/p比在1左右，質(zhì)粒與穿膜肽已結(jié)合的較好。

實(shí)施例2：

(1)稱(chēng)取一定量fmoc-arg(pbf)-wang樹(shù)脂或h-arg(pbf)-2cl樹(shù)脂，倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量dmf，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂10倍摩爾量的每步投料的氨基酸，10倍摩爾量的碳二亞型縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺(dcc))或苯并三唑鎓鹽型縮合劑(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸鹽(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氫呋喃(thf)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)脫除上述多肽鏈n端fmoc-lys(boc)-oh上面的保護(hù)基fmoc，使n端裸露出來(lái)。然后稱(chēng)取1-10倍量的膽固醇甲酰氯，1-10倍量的hbtu，加入dmf溶劑置于搖床中反應(yīng)50小時(shí)后，濾去溶液，用dmf反復(fù)洗滌10次。

(9)將干燥后的樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用tfa洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(10)運(yùn)用hplc/ms法進(jìn)行多肽的鑒定和純化，純化條件如下：應(yīng)用高階液相色譜waters2489檢測(cè)器，waters二元泵，分析柱bostonannlytics，在室溫20℃，流速1-5ml/min條件下，a相為0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，b相為0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；應(yīng)用型號(hào)為waterszq2000的質(zhì)譜儀，esi探針，nebulizergasfloe為1.5-3l/min，介質(zhì)為50-80％乙腈。

(11)按照上述化學(xué)合成方法得到穿膜肽hpp-chol，并將質(zhì)粒pegfp或pdsred與上述穿膜肽分別混合于磷酸鹽緩沖液(pbs)中；

(12)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的n/p比(nh⁺3/po^-4),調(diào)整兩者間n/p比分別為0、1、3、5、10、20、40、80；

(13)將上述調(diào)整好n/p比的混合液進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，最優(yōu)n/p比在1左右，質(zhì)粒與穿膜肽已結(jié)合的較好。

實(shí)施例3：

(1)稱(chēng)取一定量fmoc-arg(pbf)-wang樹(shù)脂或h-arg(pbf)-2cl樹(shù)脂，倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量dmf，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂5倍摩爾量的每步投料的氨基酸，5倍摩爾量的碳二亞型縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺(dcc))或苯并三唑鎓鹽型縮合劑(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸鹽(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氫呋喃(thf)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)脫除上述多肽鏈n端fmoc-lys(boc)-oh上面的保護(hù)基fmoc，使n端裸露出來(lái)。然后稱(chēng)取1-10倍量的膽固醇甲酰氯，1-10倍量的hbtu，加入dmf溶劑置于搖床中反應(yīng)48小時(shí)后，濾去溶液，用dmf反復(fù)洗滌9次。

(9)將干燥后的樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用tfa洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(10)運(yùn)用hplc/ms法進(jìn)行多肽的鑒定和純化，純化條件如下：應(yīng)用高階液相色譜waters2489檢測(cè)器，waters二元泵，分析柱bostonannlytics，在室溫20℃，流速1-5ml/min條件下，a相為0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，b相為0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；應(yīng)用型號(hào)為waterszq2000的質(zhì)譜儀，esi探針，nebulizergasfloe為1.5-3l/min，介質(zhì)為50-80％乙腈。

(11)按照上述化學(xué)合成方法得到穿膜肽hpp-chol，并將質(zhì)粒pegfp或pdsred與上述穿膜肽分別混合于磷酸鹽緩沖液(pbs)中；

(12)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的n/p比(nh⁺3/po^-4),調(diào)整兩者間n/p比分別為0、1、3、5、10、20、40、80；

(13)將上述調(diào)整好n/p比的混合液進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，最優(yōu)n/p比在1左右，質(zhì)粒與穿膜肽已結(jié)合的較好。

實(shí)施例4：

(1)稱(chēng)取一定量fmoc-arg(pbf)-wang樹(shù)脂或h-arg(pbf)-2cl樹(shù)脂，倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量dmf，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂3倍摩爾量的每步投料的氨基酸，7倍摩爾量的碳二亞型縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺(dcc))或苯并三唑鎓鹽型縮合劑(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸鹽(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氫呋喃(thf)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)脫除上述多肽鏈n端fmoc-lys(boc)-oh上面的保護(hù)基fmoc，使n端裸露出來(lái)。然后稱(chēng)取1-10倍量的膽固醇甲酰氯，1-10倍量的hbtu，加入dmf溶劑置于搖床中反應(yīng)48小時(shí)后，濾去溶液，用dmf反復(fù)洗滌9次。

(9)將干燥后的樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用tfa洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(10)運(yùn)用hplc/ms法進(jìn)行多肽的鑒定和純化，純化條件如下：應(yīng)用高階液相色譜waters2489檢測(cè)器，waters二元泵，分析柱bostonannlytics，在室溫20℃，流速1-5ml/min條件下，a相為0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，b相為0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；應(yīng)用型號(hào)為waterszq2000的質(zhì)譜儀，esi探針，nebulizergasfloe為1.5-3l/min，介質(zhì)為50-80％乙腈。

(11)按照上述化學(xué)合成方法得到穿膜肽hpp-chol，并將質(zhì)粒pegfp或pdsred與上述穿膜肽分別混合于磷酸鹽緩沖液(pbs)中；

(12)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的n/p比(nh⁺3/po^-4),調(diào)整兩者間n/p比分別為0、1、3、5、10、20、40、80；

(13)將上述調(diào)整好n/p比的混合液進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，最優(yōu)n/p比在1左右，質(zhì)粒與穿膜肽已結(jié)合的較好。

實(shí)施例5：

(1)稱(chēng)取一定量fmoc-arg(pbf)-wang樹(shù)脂或h-arg(pbf)-2cl樹(shù)脂，倒入玻璃反應(yīng)器中，加入合適量的二氯甲烷(dcm)浸泡直至樹(shù)脂溶脹，抽干；

(2)向反應(yīng)器中加入適量脫保護(hù)溶液，通氮?dú)夤膭?dòng)0.5-2小時(shí)，抽干，向反應(yīng)器中加入適量dmf，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)操作1-10次；

(3)稱(chēng)取相當(dāng)于樹(shù)脂1倍摩爾量的每步投料的氨基酸，1倍摩爾量的碳二亞型縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺(dcc))或苯并三唑鎓鹽型縮合劑(如o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸鹽(tbtu))溶于二甲基甲酰胺(dmf)或dcm或四氫呋喃(thf)中加入反應(yīng)器，反應(yīng)1-4h，茚三酮法檢測(cè)直至不顯色時(shí)停止反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-5次；

(5)向反應(yīng)器中加入適量脫帽液，氮?dú)夤膭?dòng)1-3h，抽干，茚三酮法檢測(cè)呈陽(yáng)性；

(6)將反應(yīng)器中的溶液抽干，加適量dmf洗滌，氮?dú)夤膭?dòng)，抽干，重復(fù)洗滌1-10次；

(7)反復(fù)上述操作直至多肽鏈合成完成，得到lys-ile-pro-leu-pro-arg-phe-lys-leu-lys-cys-ile-phe-cys-lys-lys-arg-arg-lys-arg-oh；

(8)脫除上述多肽鏈n端fmoc-lys(boc)-oh上面的保護(hù)基fmoc，使n端裸露出來(lái)。然后稱(chēng)取1-10倍量的膽固醇甲酰氯，1-10倍量的hbtu，加入dmf溶劑置于搖床中反應(yīng)48小時(shí)后，濾去溶液，用dmf反復(fù)洗滌9次。

(9)將干燥后的樹(shù)脂裝入合適的離心管中，加入適量配好的切割液4-30度恒溫機(jī)械攪拌1-4h，過(guò)濾后用tfa洗滌，過(guò)濾，將濾液全部收集到燒瓶中，直接加入5-60倍體積的冰無(wú)水乙醚，放置1-4h，高速離心后得到所需多肽粗品；

(10)運(yùn)用hplc/ms法進(jìn)行多肽的鑒定和純化，純化條件如下：應(yīng)用高階液相色譜waters2489檢測(cè)器，waters二元泵，分析柱bostonannlytics，在室溫20℃，流速1-5ml/min條件下，a相為0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，b相為0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；應(yīng)用型號(hào)為waterszq2000的質(zhì)譜儀，esi探針，nebulizergasfloe為1.5-3l/min，介質(zhì)為50-80％乙腈。

(11)按照上述化學(xué)合成方法得到穿膜肽hpp7k，并將質(zhì)粒pegfp或pdsred與上述穿膜肽分別混合于磷酸鹽緩沖液(pbs)中；

(12)計(jì)算質(zhì)粒與穿膜肽含量間的n/p比(nh⁺3/po^-4),調(diào)整兩者間n/p比分別為0、1、3、5、10、20、40、80；

(13)將上述調(diào)整好n/p比的混合液進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，最優(yōu)n/p比在1左右，質(zhì)粒與穿膜肽已結(jié)合的較好。

實(shí)施例6：

穿膜肽hpp-chol與質(zhì)粒dna結(jié)合后的穿膜效果實(shí)驗(yàn)：

(1)本發(fā)明所合成穿膜肽hpp-chol和pegfp或pdsred按0、2、3、4、5的n/p比混合，室溫或者37℃孵育半個(gè)小時(shí)或一個(gè)小時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組使用2000，按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；

(2)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分別為bhk21和b16細(xì)胞系。培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜，用沒(méi)有血清的培養(yǎng)基洗兩次，加入質(zhì)粒dna和穿膜肽復(fù)合物加入到500ul培養(yǎng)基中；

(3)6小時(shí)候去掉培養(yǎng)基加含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基；

(4)4小時(shí)后顯微鏡觀察，在bhk21細(xì)胞系中，結(jié)果如圖2a所示，hpp-chol與質(zhì)粒dna在n/p比為2的條件下結(jié)合時(shí)，其已能將質(zhì)粒dna帶入胞內(nèi)，且在n/p比為4時(shí)，其穿膜效率最高，且遠(yuǎn)高于2000的穿膜效率。在b16細(xì)胞系中，結(jié)果如圖2b所示，與bhk21細(xì)胞系情況類(lèi)似，hpp-chol與質(zhì)粒dna在n/p比為4的條件下結(jié)合時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率較高，但穿膜效率也遠(yuǎn)高于2000的穿膜效率。

(5)bhk21或b16細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)上述處理4h后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，得到熒光定量結(jié)果，在bhk21及b16細(xì)胞系中，如圖3所示，hpp-chol在1.2um時(shí)，其熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2000的熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例7

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞bhk21和b16，以每孔1×10⁴個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁；

(2)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換成無(wú)血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)；

(3)配置不同濃度的穿膜肽hpp-chol，同時(shí)設(shè)置三個(gè)陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔(2000)，陽(yáng)性對(duì)照孔(2000)按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-24h；

(4)孵育時(shí)間結(jié)束后，每孔加入pbs洗滌；

(5)貼壁細(xì)胞每孔加入20ulmtt(0.5％)，繼續(xù)孵育4-6h之后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150uldmso(二甲基亞砜)，震蕩10min；

(6)比色：選擇490nm或570nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀免疫檢測(cè)儀上測(cè)定光吸收值，處理數(shù)據(jù)得到細(xì)胞存活率，對(duì)于bhk21細(xì)胞系，結(jié)果如圖4a所示，本發(fā)明細(xì)胞穿膜肽hpp-chol在0-1.6umol/l的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差別；對(duì)于b16細(xì)胞系，結(jié)果如圖4b所示，本發(fā)明細(xì)胞穿膜肽hpp-chol在0-1.6umol/l的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率也與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差別。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明涉及的細(xì)胞穿膜肽安全低毒，其毒性與2000無(wú)差別，且各濃度的毒性變化不大，無(wú)濃度依賴(lài)性。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上具體實(shí)施方式僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。