本發(fā)明屬于海洋生物
技術(shù)領域：
，具體涉及文蛤多肽及其制備方法與應用。尤其是文蛤多肽mmp13及其類似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)。
背景技術(shù)：
：衰老是人類生命過程的必然規(guī)律，也是一種不可抗拒的自然現(xiàn)象，而當前全球人口老齡化加劇的事實，迫使人類社會面臨著艱巨的養(yǎng)老和抗衰老壓力。衰老的自由基學說認為體內(nèi)的活性氧及其自由基對機體細胞有明顯的破壞作用，會引起各種生物結(jié)構(gòu)的廣泛損傷，包括生物膜變性、染色體移位、dna突變、組織破壞和老化等，最終導致機體衰老。運用衰老相關的現(xiàn)代理論，以食療保健的方式來延緩衰老進程，不失為一種有效的抗衰老策略。以食源性的材料為物質(zhì)基礎，通過適宜的提取、制備方法，尋找具有抗氧化、延壽功能的生物活性成分，有助于開發(fā)延緩衰老功能相關的保健產(chǎn)品。傳統(tǒng)醫(yī)學對延年益壽和神經(jīng)保護有悠久的研究歷史，而豐富的海洋生物資源種類則為之提供了龐大的資源庫。我國海洋資源豐富，海洋生物資源具有鮮明的地域特色，歷代流傳下來的著作頗多且記述詳盡，為海洋資源的研究和開發(fā)提供了寶貴資料。自20世紀70年代以來，人們已經(jīng)從海洋生物中分離出數(shù)萬種新型化合物，包括肽類、蛋白質(zhì)類、多糖類、生物堿類、萜類、大環(huán)聚酯類等類型。其中，肽類是海洋生物活性物質(zhì)中數(shù)量最龐大的一類化合物，達數(shù)萬種之多，包括海洋肽類毒素與海洋生物活性肽等。生物活性肽類具有分子量小、無免疫原性、結(jié)構(gòu)簡單、副作用小、功效顯著等優(yōu)點。此外，由于海洋生物生存的特定環(huán)境，海洋生物多肽的結(jié)構(gòu)與陸生動植物肽(糖肽)有很大不同，多為小分子環(huán)肽，含有豐富的d型氨基酸、羥基酸、噻酚、惡唑環(huán)，有的還含有烯鍵與炔鍵，這大大提高了肽的生物穩(wěn)定性及生物利用度。研究表明生物活性肽具有多種藥理活性，可用于預防和 延緩衰老及衰老相關的多種疾病。kim等從皮氏叫姑魚(johniusbelengerii)中分離活性化肽能夠顯著抑制脂質(zhì)過氧化反應；shoji-kawata等鑒定一種可誘導自噬的多肽，能夠有效地抑制多種致病因子；martorell等從可可(theobromacacao)中分離抗氧化活性肽13l(dnydnsagkwwvt)，可以減少阿爾茨海默病秀麗線蟲aβ沉積，具有預防和治療神經(jīng)退行性疾病的潛能。因此，發(fā)掘海洋生物資源中具有抗氧化、延緩衰老、神經(jīng)保護作用的多肽類活性成分有助于促進海洋生物資源的綜合開發(fā)與利用。貝類性平、味甘、咸，具有滋陰補腎、調(diào)中的功效?！侗静輳男隆酚涊d著貝肉下氣調(diào)中、利五臟、療消渴的功效。其中，文蛤(meretrixmeretrixl.)又稱蛤蜊，屬于雙殼綱簾蛤目簾蛤科的貝類，是我國重要的海洋貝類資源，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，具有很高的食療和藥用價值。目前對文蛤多肽的研究主要集中在其抗腫瘤方面的利用，如公開號為cn102161699a的中國專利中公開了一種經(jīng)硫酸銨分級沉淀、超濾、離子交換層析、疏水層析、反相層析后獲得一種分子量為15kda、n-末端序列為ideiqntgggtnfr、具抗腫瘤活性的文蛤多肽，其應用于生物制藥領域里預防和/或治療惡性腫瘤。然而目前文蛤蛋白多肽在抗氧化、延緩衰老方面的應用和報道并不多，因此，開發(fā)具有延衰作用的文蛤活性多肽將對抗衰老及衰老相關疾病的預防和治療均具有重大的意義，也將為文蛤多肽類產(chǎn)品的開發(fā)應用提供依據(jù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供具有抗氧化和延緩衰老活性的文蛤多肽及其制備方法與應用。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。一種文蛤多肽mmp13，其具有seqidno:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明通過將文蛤軟體勻漿后離心，取上清干燥，乙醇提取、超濾膜截留、凝膠層析分離，反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分離得到文蛤多肽mmp13，其具有seqidno:1所示的氨基酸序列，序列具體為lsdrleetggass。本發(fā)明還提供了在具有seqidno:1所示的氨基酸序列的文蛤多肽mmp13的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨 基酸序列的文蛤多肽mmp13類似物。所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在氨基酸序列的任意位點進行，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗氧化和延緩衰老活性即可。類似的，所取代、缺失或添加的氨基酸的數(shù)目也是任意的，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗氧化和延緩衰老活性。其中，在一些實施方案中，所述文蛤多肽mmp13類似物，其具有seqidno:2所示的氨基酸序列，序列具體為qlsdrleetggass，命名為mmp13-1。在一些實施方案中，所述文蛤多肽mmp13類似物，其具有seqidno:3所示的氨基酸序列，序列具體為ieqlsdrleetggass，命名為mmp13-2。在一些實施方案中，所述文蛤多肽mmp13類似物，其具有seqidno:4所示的氨基酸序列，序列具體為qieqlsdrleetggass，命名為mmp13-3。在一些實施方案中，所述文蛤多肽mmp13類似物，其具有seqidno:5所示的氨基酸序列，序列具體為lsdrleetggassiqhe，命名為mmp13-4。在一些實施方案中，所述文蛤多肽mmp13類似物，其具有seqidno:6所示的氨基酸序列，序列具體為qieqlsdrleetggassiqhe，命名為mmp13-5。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物的dna分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定多肽的核苷酸序列。對于編碼本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物的dna分子，本領域技術(shù)人員可以很容易的利用現(xiàn)有公知的方法制造合成。諸如，通過選擇對應于構(gòu)成所述的氨基酸序列的氨基酸殘基的密碼子，可很容易地確定和提供相應于文蛤多肽mmp13及其類似物多肽的氨基酸序列的dna分子。本發(fā)明還提供了所述文蛤多肽的制備方法，文蛤軟體勻漿后離心，取上清干燥，乙醇提取醇溶多肽，用截留分子量為3kda超濾膜截留，收集分子量<3kda的超濾組分，凝膠色層析法分離后，反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分離。作為優(yōu)選，所述的制備方法中，所述勻漿后離心為5000g～15000g離心10min～50min。作為優(yōu)選，所述的制備方法中，所述乙醇提取為加入60％～80％乙醇提取，提取時間為12～24h。作為優(yōu)選，所述的制備方法中，所述凝膠層析法分離具體為sephadexg-25的凝膠層析柱對mw<3kda多肽組分進行分離，以500μl的上樣體積和20 mg/ml的濃度進行進針加樣，以水為流動相、1ml/min的速度進行洗脫，紫外檢測器檢測各個時間點的洗脫液在280nm處的吸光值，收集200min內(nèi)的洗脫組分。作為優(yōu)選，所述的制備方法中，反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分離具體為取收集的200min內(nèi)的洗脫組分，溶解于含0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液中，納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析；所述納升液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析為在納升液相色譜的捕集柱上進樣，以0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液以2.5μl/min的流速洗脫10min，然后以0.1v/v％甲酸、2v/v％水的乙腈溶液進行梯度洗脫，液相洗脫梯度為50min內(nèi)b液從5～35％，分析柱為反相色譜柱，同時進行質(zhì)譜掃描分析。所述分析柱可以為c18反相色譜柱，規(guī)格為75μm×15cm，3μm，百草枯是一類電子受體，作用于細胞的氧化還原反應，在細胞內(nèi)活化為氧自由基是毒作用的基礎，所形成的過量超氧化陰離子自由基及過氧化氫(h2o2)等可引起多組織器官細胞膜脂質(zhì)過氧化，從而造成多系統(tǒng)組織器官的損害。因此，抑制其對細胞的氧化損傷能夠有效緩解神經(jīng)毒性。本發(fā)明將所述文蛤多肽mmp13加入百草枯造模的秀麗線蟲培養(yǎng)液中，定時統(tǒng)計秀麗線蟲存活的比率，檢測所述文蛤多肽mmp13對百草枯誘導的氧化脅迫的影響，結(jié)果顯示本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13具有顯著的抗氧化作用。壽命作為衰老的最可靠、最具代表性的衡量指標，可從整體水平評價了生物個體或群體的衰老程度。本發(fā)明將所述文蛤多肽mmp13及其類似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)后，定時統(tǒng)計秀麗線蟲的存活情況，檢測所述文蛤多肽mmp13及其類似物對秀麗線蟲壽命的影響。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物能夠延長秀麗線蟲在自然條件下的存活時間，具有延緩衰老進程的作用。因此，本發(fā)明提供了所述文蛤多肽mmp13及其類似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)在制備抗氧化、抗衰老的藥物中的應用。本領域技術(shù)人員可將本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)直接或間接加入 制備不同劑型時所需的藥學上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)還可以制備成抗氧化、抗衰老的保健品。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了文蛤多肽及其制備方法與應用。本發(fā)明所述文蛤多肽其具有seqidno:1所示的氨基酸序列。實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物均具有很好的抗氧化、抗衰老作用。本發(fā)明提供的制備方法，能夠充分利用文蛤豐富資源得到具有強抗氧化、抗衰老作用文蛤多肽mmp13及其類似物。本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物可以用于制備成抗氧化、抗衰老藥物或者抗氧化、抗衰老保健品，應用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟和社會效應。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示實施例1凝膠層析分離色譜圖；圖2示文蛤多肽mmp13的高效液相色譜圖；圖3示文蛤多肽mmp13的質(zhì)譜圖；圖4示實施例2抗百草枯誘導的氧化脅迫實驗中文蛤多肽mmp13對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；圖5示實施例3秀麗線蟲壽命實驗中文蛤多肽mmp13對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；圖6示實施例3秀麗線蟲壽命實驗中文蛤多肽mmp13-1對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；圖7示實施例3秀麗線蟲壽命實驗中文蛤多肽mmp13-2對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；圖8示實施例3秀麗線蟲壽命實驗中文蛤多肽mmp13-3對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；圖9示實施例3秀麗線蟲壽命實驗中文蛤多肽mmp13-4對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；圖10示實施例3秀麗線蟲壽命實驗中文蛤多肽mmp13-5對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細闡述。實施例1、文蛤多肽mmp13的制備新鮮的文蛤進行去殼處理，用水先后清洗3～4次清洗掉泥沙，將文蛤軟體進行充分勻漿，勻漿液經(jīng)5000g離心10min，取上清真空冷凍干燥，加入60～80％乙醇提取24h，10000g離心30min，取上清液用截留分子量為3kda超濾膜截留后，得mw<3kda的超濾組分。利用sephadexg-25的凝膠層析柱(1.5cm×1.2m，bio-rad公司)對mw<3kda的多肽組分進行凝膠層析分離。以500μl的上樣體積和20mg/ml的濃度進行進針加樣，以液相恒流泵為動力、一級水為流動相、1ml/min的速度進行洗脫，并通過uv紫外檢測器檢測各個時間點的洗脫液在280nm處的吸光值。結(jié)果見圖1由圖1結(jié)果可見mw<3kda的多肽組分在經(jīng)凝膠層析法分離后，主要得到5個組分，分別為f1、f2、f3、f4和f5。取f1組分溶解于含0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液中，進行在線的納升液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，納升液相色譜為美國absciex公司的eksigent nanolc-ultratm二維系統(tǒng)，質(zhì)譜為tripletof5600系統(tǒng)。在納升流量的捕集柱(3μm,)上進樣，動力泵以0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液、流速為2.5μl/min進行脫鹽10min，然后以0.1v/v％甲酸、2v/v％水的乙腈溶液進行梯度洗脫，液相洗脫梯度為50min內(nèi)b液從5～35％，分析柱為75μm×15cm，c18-3μm，同時進行質(zhì)譜掃描分析，結(jié)果如表1。表1文蛤多肽序列多肽名稱氨基酸序列序列編號mmp13lsdrleetggassseqidno:1mmp13-1qlsdrleetggassseqidno:2mmp13-2ieqlsdrleetggassseqidno:3mmp13-3qieqlsdrleetggassseqidno:4mmp13-4lsdrleetggassiqheseqidno:5mmp13-5qieqlsdrleetggassiqheseqidno:6實施例2、抗百草枯誘導的氧化脅迫實驗將實施例1制備的文蛤多肽mmp13按照濃度為0.5mm、1mm、2mm和4mm分別加入70mm百草枯造模的秀麗線蟲培養(yǎng)液中，陽性對照組加入2mm的還原型谷胱甘肽(gsh)作陽性受試物，同時空白對照組加等體積的smedium，置于20℃培養(yǎng)，每隔約12h統(tǒng)計一次秀麗線蟲存活率，直至全部蟲子死亡。存活率以生存曲線表示，采用kaplan-meier法分析比較文蛤多肽mmp13及其類似物組和對照組的差異性。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，實施例1制備的文蛤多肽mmp13濃度為0.5mm、1mm、2mm和4mm時均具有顯著的抗氧化作用，且優(yōu)于同等濃度下的gsh的抗氧化作用。實施例3、壽命實驗將實施例1制備的文蛤多肽mmp13按照1mm、2mm和4mm的濃度，并將實施例1制備的文蛤多肽mmp13的類似物mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5以4mm的濃度，分別加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中，對照組加入等體積的smedium，置于20℃持續(xù)培養(yǎng)，并在顯微鏡下每隔1天統(tǒng)計一次各組秀麗線蟲的存活情況，直至所有秀麗線蟲死 亡。統(tǒng)計處理各組線蟲的存活率，并以生存曲線表示結(jié)果，采用kaplan-meier法分析比較文蛤多肽mmp13及其類似物和對照組的差異性。結(jié)果如圖5-10所示。結(jié)果顯示，實施例1制備的文蛤多肽mmp13在濃度為1mm、2mm和4mm時，能夠延長秀麗線蟲在自然條件下的平均生存時間，且在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，且以濃度4mm的延壽效果為最佳；同時，我們發(fā)現(xiàn)以最佳濃度為4mm的mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5也能夠顯著地延長秀麗線蟲在自然條件下壽命，表明本發(fā)明所述文蛤多肽mmp13及其類似物具有延緩衰老進程的作用。當前第1頁12