本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙酰酰胺化七肽、及其純化方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著地球環(huán)境的不斷變化，大氣臭氧層也遭到較為嚴(yán)重的破壞，由此導(dǎo)致紫外線(ultraviolet，uv)輻射強(qiáng)度有所增強(qiáng)。另一方面，隨著人們生活方式的變化，戶外運(yùn)動(dòng)、日光浴機(jī)會(huì)逐漸增多，因而人們將遭受更多的的紫外線照射，這樣一來(lái)造成光損害性皮膚病也逐漸增多。由于紫外線照射而對(duì)皮膚造成的日曬傷急性損傷和光老化、皮膚癌等的慢性累積性傷害，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。

當(dāng)今皮膚老化問題已日益引起人們的重視，因此，開發(fā)具有保護(hù)皮膚免受光損傷、預(yù)防和延緩皮膚衰老的組分或產(chǎn)品，已成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

小分子肽是一類具有高活性的肽類物質(zhì)，小分子肽可以以完整的形式被機(jī)體吸收；主動(dòng)吸收、低耗或不需消耗能量的特點(diǎn)；能夠直接進(jìn)入血液循環(huán)并送到人體各個(gè)部位，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。由于具有親水性，蛋白質(zhì)通常難以跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，提高其膜滲透性改善其細(xì)胞內(nèi)化率是重要的科學(xué)問題。通過(guò)對(duì)小分子肽進(jìn)行修飾使其性能得以改善，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究方向之一。其中，多肽n-端乙?；蚦-端酰胺化是其結(jié)構(gòu)修飾的主要形式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種乙酰酰胺化七肽，其具有良好的抗氧化活性和抗皮膚光老化活性，可應(yīng)用于食品、生物制藥和化妝品等領(lǐng)域。

本發(fā)明提供一種乙酰酰胺化七肽，縮寫為ac-eyfdala-nh2，分子量868.95da，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

所述乙酰酰胺化七肽的氨基酸序列為ac-glu-tyr-phe-asp-ala-leu-ala-nh2。其中，ac表示英文名稱為acetyl，中文名稱為乙?；籲h2表示英文名為amidegroup，中文名稱為酰胺基；glu表示英文名稱為glutamicacid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；tyr表示英文名稱為tyrosine，中文名稱為酪氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；asp表示英文名稱為asparticacid，中文名稱為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；ala表示英文名稱為alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；leu表示英文名稱為leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。

本發(fā)明還提供所述乙酰酰胺化七肽的純化方法，通過(guò)該純化方法對(duì)通過(guò)固相合成法合成的乙酰酰胺化七肽進(jìn)行純化，可以獲得純度大于95％的多肽，且純化方法簡(jiǎn)單，易于操作。包括如下步驟：

將待純化的乙酰酰胺化七肽上樣至色譜柱；

以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，其中流動(dòng)相a為含有0.08～0.12％三氟乙酸的乙腈溶液，流動(dòng)相b為含有0.08～0.12％三氟乙酸的水；梯度洗脫程序?yàn)椋毫鲃?dòng)相a的初始體積比例為18～22％，在上樣后的第0.01min到第25min內(nèi)，流動(dòng)相a的體積比例上升到48～53％，在第25min到第25.1min內(nèi)，流動(dòng)相a的體積比例上升為100％，保持100％運(yùn)行至第30min停止，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；收集目標(biāo)峰的多肽溶液。

進(jìn)一步的，所述色譜柱為c18色譜柱。

優(yōu)選的，流動(dòng)相a為含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流動(dòng)相b為含有0.1％三氟乙酸的水；和/或，梯度洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相a的初始體積比例為20％，在上樣后的第0.01min到第25min內(nèi)，流動(dòng)相a的體積比例上升到50％。

本發(fā)明提供的乙酰酰胺化七肽可在制備抗皮膚光老化、或抗衰老功效的護(hù)膚品中應(yīng)用。

所述乙酰酰胺化七肽還可在制備用于預(yù)防或修復(fù)由于uvb引起的hacat細(xì)胞光損傷的制劑中應(yīng)用。

所述乙酰酰胺化七肽還可在制備抗氧化制劑中應(yīng)用。

本發(fā)明所述乙酰酰胺化七肽還可在制備用于預(yù)防或改善由于uvb輻射而引起的皮膚損傷的制劑中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物中含有如上文所述的乙酰酰胺化七肽。進(jìn)一步的，所述組合物可為化妝品、食品或藥物。

本發(fā)明采用抗氧化化學(xué)模型(abts自由基)、人表皮永生化細(xì)胞(hacat)模型等方法，測(cè)試乙酰酰胺化七肽的抗氧化活性及其對(duì)hacat的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)eyfdala進(jìn)行乙酰酰胺化修飾后，產(chǎn)物ac-eyfdala-nh2的抗氧化活性顯著增強(qiáng)，且乙酰酰胺化七肽對(duì)hacat細(xì)胞的毒性顯著小于五勝肽，且對(duì)uvb老化的hacat細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用。本發(fā)明提供的乙酰酰胺化七肽具有很好的抗氧化活性和抗皮膚光老化活性，可應(yīng)用于食品、生物制藥和化妝品等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為乙酰酰胺化七肽(ac-eyfdala-nh2)的純度鑒定hplc圖；

圖2為乙酰酰胺化七肽(ac-eyfdala-nh2)的esi-ms圖譜。其中橫坐標(biāo)為m/z(質(zhì)荷比值)、縱坐標(biāo)為intensity(信號(hào)強(qiáng)度)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。

以下實(shí)施例中所用細(xì)胞或試劑若未特別說(shuō)明，均為商業(yè)渠道購(gòu)買獲得；實(shí)施例中未特別說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)操作均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)施例中所述七肽均為-eyfdala，所述乙酰酰胺化七肽均為ac-eyfdala-nh2。

通過(guò)多肽固相合成法合成ac-eyfdala-nh2，采用本領(lǐng)域常規(guī)多肽固相合成方法，具體可以通過(guò)商業(yè)化的生物合成公司來(lái)完成該多肽的合成。氨基酸序列采用本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案，下面對(duì)其進(jìn)行介紹以供參考。

多肽固相合成

選用rinkamide樹脂(上海杰肽生物科技有限公司)，由于rinkamide樹脂自帶有氨基，可以直接和氨基酸反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。按照氨基酸序列ac-glu-tyr-phe-asp-ala-leu-ala-nh2的特征，先將ala的羧基以共價(jià)鍵的形式與本身帶有活化好的氨基的rinkamide樹脂相連，然后ala的氨基和leu的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加ala，leu的氨基和ala的羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個(gè)glu氨基酸后，再切除樹脂即得到目標(biāo)多肽。隨后，醋酸酐在哌啶的催化作用下與肽鏈n端的glu的氨基反應(yīng)，該過(guò)程中可以把乙酸當(dāng)成一個(gè)氨基酸來(lái)看參與正常反應(yīng)，只不過(guò)是后面不能再鏈接氨基酸了，此步驟完成后，即可獲得目標(biāo)多肽。

乙酰酰胺化七肽的純化

對(duì)通過(guò)多肽固相合成的乙酰酰胺化七肽ac-eyfdala-nh2進(jìn)行純化，以便獲得純度95％以上的產(chǎn)品。本實(shí)施例按照如下方法純化，采用高效液相色譜純化通過(guò)上文的多肽固相合成所得的乙酰酰胺化七肽ac-eyfdala-nh2，將ac-eyfdala-nh2粗肽經(jīng)kromasilc18-5(4.6*250mm)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫純化，流速為1.0ml/min。以溶劑a為流動(dòng)相a，溶劑b為流動(dòng)相b，其中，流動(dòng)相a為含有0.1％(體積)三氟乙酸的乙腈；溶劑b為含有0.1％(體積)三氟乙酸的水。梯度洗脫如下：a+b的體積總量為100％，a初始體積比例為20％，在上樣后的第0.01min到第25min內(nèi)，a的比例上升到50％，在第25min到第25.1min內(nèi)，a的比例上升為100％，保持100％運(yùn)行至30min停止，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。收集目標(biāo)峰的多肽溶液，液氮速冷，然后凍干。得到純度95％以上的產(chǎn)品，純度鑒定hplc結(jié)果見圖1，并經(jīng)esi-ms鑒定結(jié)構(gòu)(如圖2所示)。經(jīng)鑒定，其結(jié)構(gòu)式為：

多肽的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法介紹

abts自由基清除活性測(cè)定：用pbs(ph7.4)配置5mmol/l的abts溶液，加入過(guò)量的mno2制備自由基，30℃放置12h，隨后在4500r/min條件下離心10min，收集上層清液，用0.2μm尼龍膜過(guò)濾。置于-20℃?zhèn)溆?，作為abts⁺儲(chǔ)備液。用于測(cè)試前，需用pbs溶液將abts⁺儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：加入20μl水+180μlabts溶液，進(jìn)行全波掃描，掃描確定最大吸收波長(zhǎng)為736nm(酶標(biāo)儀程序：振蕩30s，測(cè)定波長(zhǎng)范圍500-800nm)。測(cè)試樣品的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到工作液。樣品的測(cè)定：加入20μl不同濃度的樣品(1-100μg/ml)和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min。樣品的吸光度值記為a樣品，模型組的吸光度值(20μl蒸餾水+180μlabts工作液)記為a模型，設(shè)定空白組，吸光度值記為a空白。

根據(jù)下式計(jì)算abts自由基清除率：abts自由基清除率＝(a模型-a樣品)/(a模型-a空白)

實(shí)施例1-5按照上述方法abts自由基清除活性。

實(shí)施例1

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)736nm，反應(yīng)體系為20μl水+180μlabts溶液，測(cè)試乙酰酰胺化七肽的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl濃度為1μg/ml的樣品和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min，反應(yīng)完畢后，根據(jù)上式計(jì)算abts自由基清除率。

實(shí)施例2

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)736nm，反應(yīng)體系為20μl水+180μlabts溶液，測(cè)試乙酰酰胺化七肽的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl濃度為5μg/ml的樣品和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min，反應(yīng)完畢后，根據(jù)上式計(jì)算abts自由基清除率。

實(shí)施例3

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)736nm，反應(yīng)體系為20μl水+180μlabts溶液，測(cè)試乙酰酰胺化七肽的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl濃度為10μg/ml的樣品和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min，反應(yīng)完畢后，根據(jù)上式計(jì)算abts自由基清除率。

實(shí)施例4

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)736nm，反應(yīng)體系為20μl水+180μlabts溶液，測(cè)試乙酰酰胺化七肽的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl濃度為50μg/ml的樣品和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min，反應(yīng)完畢后，根據(jù)上式計(jì)算abts自由基清除率。

實(shí)施例5

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)736nm，反應(yīng)體系為20μl水+180μlabts溶液，測(cè)試乙酰酰胺化七肽的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl濃度為100μg/ml的樣品和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min，反應(yīng)完畢后，根據(jù)上式計(jì)算abts自由基清除率。

按照實(shí)施例1～5的方法，同時(shí)還考察了七肽eyfdala的abts自由基清除活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于七肽eyfdala，乙酰酰胺化七肽(ac-eyfdala-nh2)對(duì)abts自由基的清除活性顯著增強(qiáng)。eyfdala對(duì)abts自由基的半數(shù)清除濃度(ic50值)為13.4μm，ac-eyfdala-nh2的ic50值為6.18μm。由此可見，對(duì)eyfdala進(jìn)行乙酰酰胺化修飾后，產(chǎn)物ac-eyfdala-nh2的抗氧化活性顯著增強(qiáng)，又因?yàn)楫?dāng)前被廣泛接受的有關(guān)光老化最根本的成因是由于紫外照射產(chǎn)生的自由基，使細(xì)胞合成與代謝能力衰退造成，因此，可考慮以ac-eyfdala-nh2作為活性成分，測(cè)試其對(duì)光老化皮膚的保護(hù)作用，以期達(dá)到抑制皮膚光老化的效果。

實(shí)施例6多肽對(duì)hacat的毒性評(píng)價(jià)

取人表皮永生化細(xì)胞hacat一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來(lái)，離心，用完全培養(yǎng)基dmem懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個(gè)細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的陽(yáng)性對(duì)照五勝肽(matrixyl，palm-kttks)、乙酰酰胺化七肽溶液(ac-eyfdala-nh2)、七肽溶液(eyfdala)，每孔加入200μl樣品溶液(正常對(duì)照組，則用完全培養(yǎng)基替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1所示。

表1乙酰酰胺化七肽對(duì)hacat的毒性

注：小寫字母a和b表示同一濃度不同樣品細(xì)胞存活率之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

由表1可知，乙酰酰胺化七肽與七肽對(duì)對(duì)hacat細(xì)胞的毒性沒有顯著性差異，但是兩者毒性均顯著小于陽(yáng)性對(duì)照五勝肽。結(jié)果表明，乙酰酰胺化七肽具備在化妝品中應(yīng)用的潛力。

實(shí)施例7乙酰酰胺化七肽對(duì)uvb老化hacat細(xì)胞的保護(hù)作用

為了探究多肽對(duì)uvb老化的hacat的保護(hù)作用，建立uvb老化的hacat模型，設(shè)立uvb老化組和non-uvb正常組。在設(shè)定的uvb老化強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，通過(guò)mtt法測(cè)定hacat的存活率以及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率來(lái)確定最適的uvb劑量。結(jié)果表明，當(dāng)uvb輻射強(qiáng)度為35mj/cm²時(shí)，模型組中hacat細(xì)胞的存活率為正常組的47.56±6.40％，差異顯著，接近半數(shù)存活率。同時(shí)，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡結(jié)果表明，模型組的凋亡率明顯高于正常組的hacat細(xì)胞，模型組細(xì)胞g1期的比例顯著小于正常組，同時(shí)，s期細(xì)胞的比例顯著高于正常組。因此，uvb能將hacat細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在s期。結(jié)果表明，紫外線uvb老化的hacat模型建立成功。

在上述uvb老化的hacat模型的基礎(chǔ)上，測(cè)試1-50μg/ml濃度范圍內(nèi)衍生化多肽ac-eyfdala-nh2對(duì)hacat的保護(hù)作用，并與七肽eyfdala、陽(yáng)性對(duì)照五勝肽進(jìn)行比較。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2乙酰酰胺化七肽對(duì)hacat的保護(hù)作用

注：小寫字母a和b表示不同樣品細(xì)胞存活率之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

由表2可知，七肽、乙酰酰胺化七肽與五勝肽對(duì)uvb老化hacat的保護(hù)作用均沒有顯著性差異，結(jié)果表明，乙酰酰胺化七肽具備在化妝品中應(yīng)用的潛力。