本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種文蛤多肽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

衰老是人類生命過程的必然規(guī)律，也是一種不可抗拒的自然現(xiàn)象，而當前全球人口老齡化加劇的事實，迫使人類社會面臨著艱巨的養(yǎng)老和抗衰老壓力。衰老的自由基學說認為體內(nèi)的活性氧及其自由基對機體細胞有明顯的破壞作用，會引起各種生物結(jié)構(gòu)的廣泛損傷，包括生物膜變性、染色體移位、dna突變、組織破壞和老化等，最終導致機體衰老。運用衰老相關(guān)的現(xiàn)代理論，以食療保健的方式來延緩衰老進程，不失為一種有效的抗衰老策略。以食源性的材料為物質(zhì)基礎(chǔ)，通過適宜的提取、制備方法，尋找具有抗氧化、延壽功能的生物活性成分，有助于開發(fā)延緩衰老功能相關(guān)的保健產(chǎn)品。

我國海洋面積遼闊，海產(chǎn)品類資源豐富。其中，魚貝類等水產(chǎn)食品不僅是人類蛋白質(zhì)的重要來源，而且也顯現(xiàn)出多種保健和疾病防治功能，對促進人類健康有很重要作用。貝類性平、味甘、咸，具有滋陰補腎、調(diào)中的功效?！侗静輳男隆酚涊d著貝肉下氣調(diào)中、利五臟、療消渴的功效。其中，文蛤(meretrixmeretrixl.)又稱蛤蜊，屬于雙殼綱簾蛤目簾蛤科的貝類，是我國重要的海洋貝類資源，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，具有很高的食療和藥用價值。目前對文蛤多肽的研究主要集中在其抗腫瘤方面的利用，如公開號為cn102161699a的中國專利中公開了一種經(jīng)硫酸銨分級沉淀、超濾、離子交換層析、疏水層析、反相層析后獲得一種分子量為15kda、n-末端序列為ideiqntgggtnfr、具抗腫瘤活性的文蛤多肽，其應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域里預(yù)防和/或治療惡性腫瘤。然而目前文蛤蛋白多肽在抗氧化、延緩衰老方面的應(yīng)用和報道并不多，因此，開發(fā)具有延衰作用的文蛤活性多肽將對抗衰老及衰 老相關(guān)疾病的預(yù)防和治療均具有重大的意義，也將為文蛤多肽類產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化和延緩衰老活性的文蛤多肽及其制備方法與應(yīng)用。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種文蛤多肽，其制備方法為文蛤軟體勻漿后離心，取上清，加入乙醇至乙醇含量為60％～80％，靜置過夜后離心取上清液。

其中，所述文蛤軟體為新鮮的文蛤去殼后用水清洗3～4次得到。

作為優(yōu)選，所述勻漿后離心為5000g～15000g離心10min～50min。

本發(fā)明所述文蛤多肽其制備方法離心的上清液中加入乙醇后靜置以沉淀去除多糖。

其中，作為優(yōu)選，所述加入的乙醇為95％乙醇。

加入乙醇的具體操作優(yōu)選邊攪拌邊緩慢加入。

加入乙醇后靜置的時間可以為靜置過夜，也可以為靜置8h以上。

作為優(yōu)選，所述靜置過夜后離心為5000g～15000g離心10min～50min。

靜置過夜后離心收集上清液即獲得本發(fā)明所述文蛤多肽。

進一步的，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以按照公知的方法對收集的上清液進行冷凍干燥。

本發(fā)明還提供了一種文蛤多肽的制備方法，取文蛤軟體勻漿后離心，取上清，加入乙醇至乙醇含量為60％～80％，靜置過夜后離心取上清液。

優(yōu)選的，所述勻漿后離心為5000g～15000g離心10min～50min。

優(yōu)選的，所述加入的乙醇為95％乙醇。

優(yōu)選的，所述靜置過夜后離心為5000g～15000g離心10min～50min。

百草枯是一種聯(lián)吡啶陽離子類除草劑，在體內(nèi)能誘導產(chǎn)生活性氧自由基，從分子水平上氧化多種生命物質(zhì)，使機體處于氧化脅迫環(huán)境，進而出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。本發(fā)明將所述文蛤多肽加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)，加入百草枯對秀麗線蟲進行氧化脅迫造模，定時統(tǒng)計秀麗線蟲存活的比率，檢 測所述文蛤多肽對百草枯誘導的氧化脅迫的影響，結(jié)果顯示本發(fā)明所述文蛤多肽可以顯著延長秀麗線蟲的氧化脅迫存活率，提高秀麗線蟲耐氧化脅迫條件的能力，緩解機體因氧化脅迫而產(chǎn)生早衰的問題。

在秀麗線蟲體內(nèi)，幾乎所有與長壽相關(guān)的基因表達都與抵抗環(huán)境脅迫有關(guān)，例如氧化、缺氧、熱激、uv輻射和重金屬等脅迫條件。除抗氧化脅迫以外，對機體抗熱激脅迫的能力也指示著延緩衰老的作用。本發(fā)明將所述文蛤多肽加入到l1期的野生型秀麗線蟲幼蟲中培養(yǎng)后進行反復(fù)熱激培養(yǎng)直到所有秀麗線蟲死亡，檢測所述文蛤多肽對熱激脅迫的影響。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述文蛤多肽能夠延長秀麗線蟲在熱激脅迫條件下的生存時間，提高存活率，具有抗熱激脅迫活性，緩解由熱激脅迫引起的早衰現(xiàn)象。

本發(fā)明將所述文蛤多肽加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)后統(tǒng)計一次秀麗線蟲的存活情況，檢測所述文蛤多肽對秀麗線蟲壽命的影響。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述文蛤多肽能夠延長秀麗線蟲在自然條件下的存活時間，具有延緩衰老進程的作用。

因此，本發(fā)明提供了所述文蛤多肽在制備抗氧化、抗衰老的藥物中的應(yīng)用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可將本發(fā)明所述文蛤多肽直接或間接加入制備不同劑型時所需的藥學上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。

本發(fā)明所述文蛤多肽還可以制備成抗氧化、抗衰老的保健品。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種文蛤多肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述文蛤多肽其制備方法為文蛤軟體勻漿后離心，取上清，加入乙醇至乙醇含量為60％～80％，靜置過夜后離心取上清液。實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述文蛤多肽可以具有很好的抗氧化、抗衰老作用。本發(fā)明提供的制備方法，能夠充分利用文蛤豐富資源得到具有強抗氧化、抗衰老作用文蛤多肽。本發(fā) 明所述文蛤多肽可以用于制備成抗氧化、抗衰老藥物或者抗氧化、抗衰老保健品，應(yīng)用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟和社會效應(yīng)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1實施例2抗百草枯誘導的氧化脅迫實驗中不同濃度文蛤多肽對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；

圖2實施例3抗熱激脅迫實驗中不同濃度文蛤多肽對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；

圖3實施例4秀麗線蟲壽命實驗中不同濃度文蛤多肽對秀麗線蟲存活率影響的生存曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細闡述。

實施例1、文蛤多肽的制備

新鮮的文蛤進行去殼處理，用水先后清洗3～4次，將文蛤軟體進行充分勻漿，勻漿液經(jīng)5000～15000g離心10～50min，取上清，緩慢加入95％乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量為60％～80％，靜置過夜后，5000～15000g離心10～50min，取上清液，冷凍干燥。

實施例2、抗百草枯誘導的氧化脅迫實驗

將實施例1制備的文蛤多肽按照濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml分別加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中，對照組加入等體積的smedium，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為30mm的百草枯對秀麗線蟲 進行氧化脅迫造模，并開始定時統(tǒng)計秀麗線蟲存活的比率，直至全部蟲子死亡。存活率以生存曲線表示，采用kaplan-meier法分析比較實施例1制備的文蛤多肽組和對照組的差異性。結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示，實施例1制備的文蛤多肽濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml時可以顯著延長秀麗線蟲的氧化脅迫存活率，其中0.5mg/ml濃度效果最佳。表明本發(fā)明所述文蛤多肽能夠提高秀麗線蟲耐氧化脅迫條件的能力，緩解機體因氧化脅迫而產(chǎn)生早衰的問題。

實施例3、抗熱激脅迫實驗

將實施例1制備的文蛤多肽按照濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml分別加入到l1期的野生型秀麗線蟲幼蟲中，對照組加入等體積的smedium，置于20℃培養(yǎng)66h至l4期后，收集各組秀麗線蟲，經(jīng)m9緩沖液洗滌3次，分別轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)板并置于37℃恒溫箱熱激培養(yǎng)。熱激1h后統(tǒng)計一次秀麗線蟲死亡數(shù)目，待20℃恢復(fù)1h后再次熱激處理，反復(fù)熱激統(tǒng)計直到所有秀麗線蟲死亡。結(jié)果以生存曲線表示，采用kaplan-meier法分析比較實施例1制備的文蛤多肽組和對照組的差異性。結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示，實施例1制備的文蛤多肽在濃度為0.25mg/ml～2mg/ml的范圍時，能夠延長秀麗線蟲在熱激脅迫條件下的生存時間，提高存活率。表明本發(fā)明所述文蛤多肽能夠緩解由熱激脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有抗熱激脅迫活性。

實施例4、秀麗線蟲壽命實驗

將實施例1制備的文蛤多肽按照濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml分別加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中，對照組加入等體積的smedium，置于20℃持續(xù)培養(yǎng)，并在顯微鏡下每隔1天統(tǒng)計一次各組秀麗線蟲的存活情況，直至所有秀麗線蟲死亡。分析計算存活率以生存曲線表示，采用kaplan-meier法分析比較實施例1制備的文蛤多肽組和對照組的差異性。結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示，實施例1制備的文蛤多肽在濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml時能夠延長秀麗線蟲在自然條件下的存活時間，且在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，表明本發(fā)明所述文蛤多肽具有延緩衰老進程的作用。