一種提高單克隆抗體adcc活性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，更具體地說，涉及在 培養(yǎng)過程中添加尿巧和儘離子，控制單克隆抗體糖基化水平，進(jìn)而提高ADCC活性的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物技術(shù)藥物尤其是單抗藥物，因其治療的祀向性、耐受性，提高患者生存質(zhì)量同 時(shí)延長(zhǎng)生命，上市后獲得市場(chǎng)認(rèn)可度高，重磅炸彈頻出，如利妥昔單抗、曲妥珠單抗和英夫 利西單抗等。全球抗體藥物經(jīng)歷了快速的發(fā)展，目前已經(jīng)達(dá)到一定的規(guī)模，而國內(nèi)抗體藥物 進(jìn)口和國產(chǎn)數(shù)量均有限，加之國家"十二五"規(guī)劃中提出重點(diǎn)扶持生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，送也大大 助推了國內(nèi)開發(fā)單抗藥物的熱情。
[0003] 抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC)是單抗藥物的重要作用機(jī)制之一，單抗 革己向結(jié)合至腫瘤細(xì)胞表面分子后，效應(yīng)細(xì)胞通過其表面上的Fc受體（FcyR)與單抗Fc段 結(jié)合，激活一系列的信號(hào)通路，從而釋放一系列炎癥或細(xì)胞毒性的免疫調(diào)節(jié)因子，包括細(xì)胞 因子、趨化因子、蛋白酶和活性氧分子等，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，從而發(fā)揮單抗藥物的 抗腫瘤活性。利用該機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用的代表藥物有利妥昔單抗和曲妥珠單抗等。
[0004] 單抗Fc段的糖基化作為蛋白翻譯后修飾的重要指標(biāo)，在抗體藥效（如ADCC)和藥 代（半衰期）中具有非常重要的作用。糖基化修飾的影響因素較多，如培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞、培 養(yǎng)方式、培養(yǎng)參數(shù)（pH、溫度、D0、PcJ等。目前已報(bào)道或應(yīng)用一些方法改變糖基化水平或者 類型，提高抗體的ADCC活性，如添加甘露糖巧酶抑制劑化i化nensine)使單抗的糖型變?yōu)?高甘露糖型狂hou Q，et al.，Biotechnology and Bioengineering, 2008,99 (3) :652-665), 或者通過基因工程的手段減少巖藻糖修飾（Malphettes以et al.，Biotechnology and Bioengineering, 2010,106巧）：774-783)等方法。改變糖基化類型會(huì)相應(yīng)影響單抗的安全 性和有效性，如高甘露糖型會(huì)加快抗體在體內(nèi)的清除，從而影響藥代（縮短半衰期），并可 能產(chǎn)生免疫原性?；蚬こ痰姆椒▌t需要重新構(gòu)建細(xì)胞株，相當(dāng)于對(duì)單抗藥物進(jìn)行重新開 發(fā)，延長(zhǎng)藥物的開發(fā)周期和成本。
[0005] 在目前國內(nèi)外單抗藥物開發(fā)激烈競(jìng)爭(zhēng)時(shí)代的形勢(shì)下，迫切需要一種簡(jiǎn)單易行的工 藝，在不改變糖基化類型的基礎(chǔ)上，通過控制糖基化水平，改進(jìn)單抗的ADCC活性而不影響 其他生物學(xué)特征，提高產(chǎn)品的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中有效控制單抗的糖基化 水平，提高單抗體ADCC活性的生產(chǎn)工藝。
[0007] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝，其特征在于：
[0008] -種提高單克隆抗體ADCC活性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝，其特征在于在細(xì) 胞培養(yǎng)過程中連續(xù)流加核巧和金屬離子。
[0009] 上述的工藝方法，其特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中連續(xù)流加尿巧和儘離子。
[0010] 上述的工藝方法，其特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中流加0. SmM-IOmM總量的尿巧和 1 y M-20 y M總量的儘貿(mào)子。
[0011] 上述的工藝方法，優(yōu)選流加總量的尿巧和12 U M-16 U M總量的儘離子。
[0012] 上述的工藝方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)3-5天后，生長(zhǎng)至2-5X l〇6cells/mL密度 時(shí)，開始開始補(bǔ)加流加培養(yǎng)基，流加時(shí)間為8-10天。
[0013] 上述的流加培養(yǎng)基，其特征在于單獨(dú)流加，或與尿巧和儘離子混合流加。
[0014] 上述的流加方式，優(yōu)選混合流加。
[0015] 上述的儘離子，其特征在于儘離子由二價(jià)儘鹽提供。
[0016] 上述的二價(jià)儘鹽，優(yōu)選硫酸儘。
[0017] 上述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選NSO細(xì)胞系、SP2/0細(xì)胞系及CHO細(xì)胞系。
[001引上述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選Cffi)細(xì)胞系。
[0019] 上述的工藝方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體中的應(yīng)用。
[0020] 上述的單克隆抗體，其特征在于本身具有ADCC活性的單克隆抗體藥物。
[0021] W下實(shí)施方案按照工藝優(yōu)化遞進(jìn)開展：
[002引在一個(gè)實(shí)施方案中，6個(gè)250mL搖瓶（Corning)培養(yǎng)，工作體積60mU搖床 (科耐）控制；轉(zhuǎn)速為120-13化pm,溫度為36. 5。C02飽和度為7%，細(xì)胞接種密度為 0. 8-1. 2Xl06cells/mU培養(yǎng)第3至11天，分段補(bǔ)加流加培養(yǎng)基及不同濃度的硫酸儘和尿 巧，總培養(yǎng)周期為13天。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，放大至化反應(yīng)器（A卵Iikon)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為 0. 8-1. 2X 106cells/mU控制參數(shù)為；攬拌轉(zhuǎn)速為80-250巧m，溫度為36. 5°C，抑為7. 0,溶 氧為40% (空氣飽和度），培養(yǎng)第3天開始，每天流加含尿巧和硫酸儘的流加培養(yǎng)基，培養(yǎng) 周期為13天。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步放大至3批次25化反應(yīng)器燈hermo 250L SUB)細(xì)胞 培養(yǎng)，攬拌轉(zhuǎn)速為80-120巧m，抑為6. 9-7. 1，溶氧為30-50 % (空氣飽和度），培養(yǎng)第3天 開始，補(bǔ)加流加培養(yǎng)基（含硫酸儘和尿巧），培養(yǎng)周期為15-16天。
[00巧]尿巧和儘離子是影響抗體糖基化修飾的重要因素。尿巧參與細(xì)胞內(nèi)UTP及UDP-半 乳糖的生成，UDP-半乳糖復(fù)合物與蛋白在半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶的作用下完成半乳糖基化過 程，在半乳糖化過程中，儘離子是半乳糖基化轉(zhuǎn)移酶的重要輔助因子。因此通過添加尿巧和 儘離子可W達(dá)到控制糖基化水平的效果，進(jìn)而影響抗體的生物學(xué)活性，如ADCC活性。
[0026] 本發(fā)明的有益效果
[0027] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)；（1)本發(fā)明通過在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加適當(dāng)濃度尿巧和儘離 子，利用二者的協(xié)同作用，有效的提高了單抗半乳糖基化程度，提升了單抗的質(zhì)量；（2)本 發(fā)明在控制糖基化水平的同時(shí)，顯著提高了單抗的ADCC活性，使其具有更好的生物學(xué)功 能；（3)本發(fā)明的工藝成本低、易于放大、批間穩(wěn)定，順利通過了 3批次25化SUB放大培養(yǎng) 驗(yàn)證，非常適合于治療性單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[002引圖1: 3L反應(yīng)器細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
[002引圖2: 3L反應(yīng)器抗體表達(dá)曲線
[0030] 圖3: 3L反應(yīng)器抗體ADCC檢測(cè)曲線
[0031] 圖4:25化反應(yīng)器細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
[0032] 圖5:25化反應(yīng)器抗體表達(dá)曲線
[003引圖6:25化反應(yīng)器抗體ADCC檢測(cè)曲線
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作出的任何修改、等同的替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[00巧]實(shí)驗(yàn)材料：穩(wěn)定表達(dá)抗CD20單克隆抗體的CHO細(xì)胞株（美國Life Technologies 公司），商業(yè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基和商業(yè)流加培養(yǎng)基（美國Life Technologies公司），尿巧和硫酸 儘（美國Sigma公司）。
[0036] 實(shí)施例1添加不同濃度尿巧和硫酸儘的搖瓶培養(yǎng)
[0037] 搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞接種密度為0. 8-1. 2 X 106cells/mU工作體積50mU搖床（科耐）控 巧;轉(zhuǎn)速為120-130巧m，溫度為36. 5°C，C02飽和度為7%，培養(yǎng)第3、5、7、9和11天補(bǔ)加流 加培養(yǎng)基W及不同總量的硫酸儘、尿巧），培養(yǎng)周期為13天。培養(yǎng)結(jié)束后用Protein A純化 抗體進(jìn)行質(zhì)量分析。
[0038] 檢測(cè)方法：
[0039] 活細(xì)胞密度檢測(cè)：用Counterstar進(jìn)行活細(xì)胞密度檢測(cè)，結(jié)果見表1。
[0040] 抗體滴度檢測(cè)：用HPLC-Protein A法檢測(cè)抗體滴度，結(jié)果見表1。
[0041] ADCC活性檢測(cè)；采用工程化的M92-CD16a細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，Wil2-s細(xì)胞作為革己 細(xì)胞進(jìn)行ADCC活性檢測(cè)，效祀比為2 ; 1，用乳酸脫氨酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解效果，采用 實(shí)驗(yàn)組的EC50值與對(duì)照組的EC50值的比較值即比活（％ )來表示，結(jié)果見表1。
[004引數(shù)據(jù)處理：
[0043] 累計(jì)細(xì)胞量 IVCD 計(jì)算公式為 IVCDi = IVCDi i+(ViXi+Vi iXi 1) (ti-ti i)/2Vi，公式中 的i指培養(yǎng)當(dāng)天；i-1指培養(yǎng)前一天；IVCD指累積活細(xì)胞量（IO6Cells day/mL) ;X指細(xì)胞濃 度（cells/mL) ;V指培養(yǎng)體積（mL) ;t指培養(yǎng)時(shí)間（days);
[0044] 抗體產(chǎn)能化計(jì)算公式為化=抗體產(chǎn)量^VCD,化指細(xì)胞單產(chǎn)（pg/cell/day)。
[004引 結(jié)果比較：
[0046] 添加硫酸儘、尿巧與對(duì)照培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比見表1，隨著添加尿巧和儘離子濃度遞增， 細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在尿巧濃度為IOmM,儘離子濃度為20 U M時(shí)，抗體產(chǎn)量下降了 19% ;在尿巧濃度高于6mM，儘離子濃度高于12 U M時(shí)，ADCC比活性顯著提升2倍W上，且 隨著尿巧和儘離子濃度遞增呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。所W，通過搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，綜合考慮細(xì)胞生長(zhǎng)、 表達(dá)和ADCC活性，選擇添加總量為SmM的尿巧和16 U M的儘離子的工藝進(jìn)行反應(yīng)器工藝測(cè) 試。
[0047] 表1搖瓶培養(yǎng)結(jié)果匯總
[0048]

[0049] 實(shí)施例23L反應(yīng)器工藝測(cè)試
[0050] 將細(xì)胞經(jīng)過搖瓶擴(kuò)增后接種至化玻璃反應(yīng)器（荷蘭Appl化on公司）進(jìn)行工藝 測(cè)試，細(xì)胞接種密度為0. 8-1. 2X 106cells/mU控制參數(shù)為；攬拌轉(zhuǎn)速為80-250巧m，溫度 為36. 5°C，抑為7. 0,溶氧為40% (空氣飽和度），培養(yǎng)第3天至第12天補(bǔ)加流加培養(yǎng)基 含尿巧、硫酸儘的流加培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期為13天，尿巧流加總量為8mM，儘離子流加總量為 16 U M。對(duì)照組僅補(bǔ)加流加培養(yǎng)基。培養(yǎng)過程中每天取樣進(jìn)行生長(zhǎng)、代謝和滴度檢測(cè)。培養(yǎng) 結(jié)束后用親和層析、陽離子交換層析和陰離子交換層析純化抗體進(jìn)行質(zhì)量分析。
[00川檢測(cè)方法：
[0052] 活細(xì)胞密度檢測(cè)：用Counterstar進(jìn)行活細(xì)胞密度檢測(cè)，結(jié)果見圖1。
[0053] 抗體滴度檢測(cè)：用HPLC-Protein A法檢測(cè)抗體滴度，結(jié)果見圖2。
[0054] ADCC活性檢測(cè)；采用工程化的M92-CD16a細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，Wil2-s細(xì)胞作為革己 細(xì)胞進(jìn)行ADCC活性檢測(cè)，效祀比為2 ; 1，用乳酸脫氨酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解效果，采用 實(shí)驗(yàn)組的EC50值與對(duì)照組的EC50值的比較值即比活（％ )來表示，結(jié)果見圖3。
[0055] 糖型檢測(cè)：參考市售2-AB標(biāo)記檢測(cè)試劑盒（美國Glyko公司），用內(nèi)切糖巧酶 (N-Glycanase)將N-糖巧從單抗上分離，經(jīng)無孔石墨小柱富集。N-糖巧經(jīng)真空濃縮干燥， 將干燥后的N-糖巧用2-氨基-苯甲醜胺（2-AB)標(biāo)記，應(yīng)用于HPLC-FLD分離分析。通過 比較2-AB標(biāo)記的N-糖巧的與糖標(biāo)準(zhǔn)品在液相色譜上的保留時(shí)間，對(duì)單抗的N-糖巧類型進(jìn) 行歸屬；對(duì)不同類型的N-糖巧在HPLC-FLD譜圖的峰面積進(jìn)行歸一化，對(duì)單抗的各N-糖巧 類型進(jìn)行定量分析。結(jié)果見表2。
[005引 結(jié)果對(duì)比：
[0057] 生長(zhǎng)比較；如圖1，UM實(shí)驗(yàn)組（添加尿巧和儘離子的實(shí)驗(yàn)組）在培養(yǎng)前期生長(zhǎng)較 快，培養(yǎng)后期，細(xì)胞密度和活率比對(duì)照組低約10%，整體無明顯差異；
[0058] 滴度比較；如圖2, UM實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Titer隨時(shí)間的變化，同時(shí)培養(yǎng)13天條件 下，實(shí)驗(yàn)組滴度為1493. 4〇111旨/1，對(duì)照組為1550. 55mg/l，該工藝對(duì)細(xì)胞表達(dá)無明顯影響；
[0059] ADCC活性比較；如圖3, UM實(shí)驗(yàn)組EC50為1. 282ng/血，對(duì)照組為3. 024ng/血，實(shí) 驗(yàn)組ADCC活性是對(duì)照組的2. 36倍。
[0060] 糖型比較；如表2, UM實(shí)驗(yàn)組的GOF比例低于對(duì)照組，而GlF和G2F比例均高于對(duì) 照組，說明尿巧和儘離子促進(jìn)了抗體的半乳糖基化。半乳糖基化會(huì)影響抗體的其他生物學(xué) 活性，如補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC)，因而提高半乳糖基化程度有利于提高抗體的生物學(xué) 活性。UM實(shí)驗(yàn)組不含核必巖藻糖的GO、Gl和G2比例略高于對(duì)照組，核必巖藻糖會(huì)降低抗 體的ADCC活性，送可能是本發(fā)明ADCC活性提高的原因之一。
[0061] 表2糖型分析
[0062]

[0063] 實(shí)施例3250L SUB反應(yīng)器培養(yǎng)工藝驗(yàn)證
[0064] 在25化水平上，重復(fù)3批次中式規(guī)模放大培養(yǎng)。
[0065] Thermo 250L SUB反應(yīng)器培養(yǎng)；細(xì)胞接種密度為0.8-1. 2 X IO6CellsM^JS制參數(shù) 為；攬拌轉(zhuǎn)速為80-120巧m，溫度為36. 5°C，抑為6.9-7. 1，溶氧為30-50% (空氣飽和度）， 初始工作體積15化，培養(yǎng)第3-4天時(shí)，補(bǔ)加流加培養(yǎng)基（含尿巧和儘離子），維持葡萄糖濃 度至2g/l，培養(yǎng)周期為14-16天，最終培養(yǎng)液中含SmM尿巧和16 U M。
[0066] 如圖4和圖5, 3批25化SUB反應(yīng)器生長(zhǎng)和表達(dá)均保持一致，且表達(dá)產(chǎn)品的ADCC 的EC50分別為1. 189ng/mL，1. 449ng/mL和1. 36化g/mL，CV<10%，具有良好的重現(xiàn)性。
[0067] 本發(fā)明添加氨基酸和UMG的流加培養(yǎng)工藝在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞表達(dá)和抗體質(zhì)量均達(dá) 到產(chǎn)品開發(fā)目標(biāo)，且順利通過了 3批25化放大培養(yǎng)工藝驗(yàn)證，該工藝穩(wěn)定成熟可靠，重現(xiàn)性 好，本發(fā)明具有良好的產(chǎn)業(yè)化潛力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高單克隆抗體ADCC活性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝，其特征在于在細(xì)胞 培養(yǎng)過程中連續(xù)流加核苷和金屬離子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝方法，其特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中連續(xù)流加尿苷和錳 離子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝方法，其特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)過程中流加0. 5mM-10mM總 量的尿苷和1 μ Μ -20 μ Μ總量的錳離子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝方法，優(yōu)選流加總量的尿苷和12 μ Μ-16 μ Μ總 量的猛尚子。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的工藝方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)3-5天后，生長(zhǎng)至 2-5' 106cells/mL密度時(shí)，開始補(bǔ)加流加培養(yǎng)基，流加時(shí)間為8-10天。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的流加培養(yǎng)基，其特征在于單獨(dú)流加，或與尿苷和錳離子混合 流加。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的流加方式，優(yōu)選混合流加。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的錳離子，其特征在于錳離子由二價(jià)錳鹽提供。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的二價(jià)錳鹽，優(yōu)選硫酸錳。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選NS0細(xì)胞系、SP2/0細(xì)胞系及CHO細(xì)胞 系。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選CHO細(xì)胞系。12. 權(quán)利要求1-11任意一項(xiàng)所述的工藝方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體中的應(yīng) 用。13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的單克隆抗體，其特征在于本身具有ADCC活性的單克隆抗體 藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)并快速有效提高單克隆抗體ADCC活性的工藝途徑，該工藝特征在于通過在培養(yǎng)過程中添加核苷和金屬離子的方法，控制單抗的糖基化水平，提高單克隆抗體的ADCC活性。該工藝具有穩(wěn)定性好，可操作性強(qiáng)，易于放大，批次間結(jié)果差異小的特點(diǎn)，可以應(yīng)用于大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體，特別是工業(yè)化生產(chǎn)治療性單克隆抗體。
【IPC分類】C12R1/91, C12P21/08
【公開號(hào)】CN105713946
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410712306
【發(fā)明人】吳偉, 范林萍, 于鵬展
【申請(qǐng)人】西藏海思科藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司