本發(fā)明為植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體及其在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大豆胞囊線蟲病(soybeancystnematode，scn)是由大豆胞囊線蟲(heteroderaglycinesichinohe)引起的一種世界性大豆病害，在世界各大豆主要生產(chǎn)國如美國、巴西、阿根延、中國等均廣泛分布。據(jù)統(tǒng)計(jì)，scn每年可造成大豆減產(chǎn)7％～10％，嚴(yán)重地塊可達(dá)15-50％，甚至絕產(chǎn)，每年造成約10-15億美元的經(jīng)濟(jì)損失。scn在我國東北和黃淮海大豆主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其中又尤以黑龍江省、吉林省中西部及內(nèi)蒙古的鹽堿地、白漿土和沙壤土地發(fā)生較為嚴(yán)重，每年危害面積達(dá)2.0×10⁶hm²以上。除危害大豆外，scn還危害小豆，赤小豆、飯豆、菜豆等170多種作物。

大豆胞囊線蟲是一種定居型內(nèi)寄生線蟲，主要通過2齡幼蟲侵染大豆根部維管束，危害大豆生長發(fā)育，造成植株發(fā)育不良，根系減少，根上附有白色的球狀物，莖和葉變淡黃色，豆莢和種子萎縮癟小，甚至不結(jié)莢。大豆胞囊線蟲是嚴(yán)格的專性寄生物，存在明顯的寄主分化現(xiàn)象，不同生理小種致病性存在明顯差異。按照riggs等提出的分類標(biāo)準(zhǔn)，scn存在16個(gè)生理小種。目前在我國已發(fā)現(xiàn)1、2、3、4、5、7、14號小種，其中東北大豆產(chǎn)區(qū)主要是3號小種，另外還有1號、4號和14號；黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)主要以1號和4號小種為主。

scn作為一類土傳病害，其分布與大豆種植區(qū)域高度重疊，是一種極難防治的土傳病害。由于目前尚無有效可使用的化學(xué)殺線蟲劑，生產(chǎn)上主要通過種植抗性品種和田間輪作控制scn的發(fā)生與危害。由于胞囊在土壤中存活時(shí)間較長(9年以上)，采用輪作等方式雖然可以減少大豆產(chǎn)量損失，但并不能完全控制scn的危害，實(shí)際應(yīng)用效果有限。目前生產(chǎn)上利用的抗線蟲大豆品種主要來源于peking、pi88788等少數(shù)幾個(gè)抗源品種，其中，具有peking或pi88788血緣的品種占所有抗線蟲大豆品種的97％以上，抗性遺傳基礎(chǔ)極為狹窄。同時(shí)，由于大豆胞囊線蟲生理小種較為復(fù)雜，易造成線蟲產(chǎn)生抗性，目前已報(bào)道多個(gè)胞囊線蟲生理小種對pi88788血緣的抗線蟲品種產(chǎn)生了抗性。因此，如何進(jìn)一步開發(fā)新型抗線蟲資源，拓寬抗性資源遺傳基礎(chǔ)，加快抗線蟲大豆品種的選育是我國抗病大豆育種中面臨的主要問題之一。

rna沉默(rnainterference，rnai)是植物抵抗外來核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子等)入侵以保持自身基因組完整性的一種防御機(jī)制。雙鏈rna(double-strandedrna，dsrna)導(dǎo)入細(xì)胞后被切割成21-23個(gè)核苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mrna結(jié)合并導(dǎo)致該同源mrna降解，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源基因發(fā)生沉默。rnai作為一種簡單有效的基因敲除的工具，已廣泛應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲(c.elegans)等多種線蟲基因功能研究及轉(zhuǎn)基因研究。目前，國際上已完成基因組測序工作的線蟲有10種(nematode.net)，其中2種為植物寄生線蟲，包括北方根結(jié)線蟲(meloidogynehapla)和南方根結(jié)線蟲(m.incognita)。截至2011年，nematode.net數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)有超過一千萬個(gè)ests序列和二十多萬個(gè)來自50多種線蟲的基因組序列。盡管目前h.glycines基因組測序工作尚未完成，但利用已有的ests數(shù)據(jù)庫信息，結(jié)合模式生物c.elegans生物學(xué)數(shù)據(jù)信息，篩選與大豆胞囊線蟲寄生、發(fā)育及繁殖等相關(guān)的關(guān)鍵基因，開展大豆胞囊線蟲基因功能驗(yàn)證和轉(zhuǎn)基因研究提供了極大的便利。

目前已發(fā)現(xiàn)h.glycines和c.elegans基因組中共有8334個(gè)基因存在保守性，其中1508個(gè)基因在c.elegans中為致死基因。通過dsrna溶液浸泡或毛狀根表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步研究這些致死基因在h.glycines中的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制這些基因的表達(dá)可以顯著降低胞囊線蟲的胞囊或雌蟲數(shù)量。urwin等(2002)利用半胱氨酸蛋白酶編碼基因(hgcp-i)dsrna溶液浸泡線蟲后，寄生胞囊線蟲雌蟲和胞囊數(shù)都顯著降低。klink等(2009)利用毛狀根表達(dá)系統(tǒng)研究了核糖體蛋白3a(hg-rps-3a)、核糖體蛋白4(hg-rps-4)、剪接體蛋白(hg-spk-1)及突觸小泡蛋白(hg-snb-1)的抑制表達(dá)對h.glycines的影響。結(jié)果表明，抑制上述4個(gè)基因的表達(dá)，均可以顯著降低毛狀根中胞囊線蟲的雌蟲數(shù)量。li等(2010)利用毛狀根表達(dá)系統(tǒng)對h.glycines的3個(gè)靶基因(y25、prp-17、cpn-1)進(jìn)行rnai研究表明，與對照相比，轉(zhuǎn)基因毛狀根中的胞囊數(shù)量降低79-95％。此外，huang等(2006年)將線蟲寄生必需的分泌肽-16d10基因反向重復(fù)序列導(dǎo)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因植物對4種根結(jié)線蟲均產(chǎn)生較高的抗性。steeves等(2006)將h.glycines精子蛋白基因msp的一段反向重復(fù)序列構(gòu)建到rnai表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化大豆。接種鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆植株根部胞囊數(shù)比對照降低68％?？梢?，rnai介導(dǎo)h.glycines基因沉默技術(shù)不僅可以為胞囊線蟲抗性育種研究提供了更為廣泛的抗源基因。同時(shí)，通過選擇高度保守的rnai靶序列，也為兼抗多個(gè)胞囊線蟲生理小種提供了一條更為有效的技術(shù)途徑。

目前，有關(guān)rnai介導(dǎo)h.glycines基因沉默的研究主要集中在基因功能驗(yàn)證方面，尚未見到利用胞囊線蟲hg-snb1基因片段培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)資料?；谏鲜隼斫?，本研究通過rnai介導(dǎo)胞囊線蟲hg-snb1基因沉默，獲得了對scn抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因大豆。在此研究基礎(chǔ)上，提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體及其在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，本發(fā)明對于培育抗大豆胞囊線蟲植物(特別是大豆)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體，包括dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合，所述根特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)下游基因或dna片段在植物根中的特異性表達(dá)。

其中，該載體還包括含有dna片段的質(zhì)粒，dna片段包括dna片段1，dna片段2，以及位于所述dna片段1和dna片段2之間的間隔序列；且所述dna片段1和dna片段2反向互補(bǔ)。

其中，該載體還包括含有dna片段的質(zhì)粒，所述dna片段從上游至下游依次包括如下元件：根特異性啟動(dòng)子、dna片段1、間隔序列、dna片段2和終止子。

其中，dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合或是權(quán)2中的質(zhì)粒或是權(quán)3中的質(zhì)粒在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供一種hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合或是上述權(quán)利中質(zhì)粒在制備大豆胞囊線蟲生防制劑中的應(yīng)用。

其中，培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物的方法為將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對大豆胞囊線蟲抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。

其中，在目標(biāo)植物中表達(dá)dna片段的實(shí)現(xiàn)方式有：將上述權(quán)利中的質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)植物。

其中，所述目標(biāo)植物和轉(zhuǎn)基因植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物為大豆。

本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體及其在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，本發(fā)明將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對大豆胞囊線蟲抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對于培育抗大豆胞囊線蟲植物(特別是大豆)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒pcambia3301-snb1rnai的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為t1代pat/bar試紙條陽性植株pcr鑒定結(jié)果；m：dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，1：質(zhì)粒pcambia3301-snb1rnai，2：對照非轉(zhuǎn)化植株，3：ddh20對照，4～9為pat/bar試紙條陽性植株b8010、b8171、b8194、b8212、b8234、b8294圖；

圖3為t1代轉(zhuǎn)基因大豆southern雜交鑒定結(jié)果.m：dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，1：空白，2：：質(zhì)粒pcambia3301-snb1rnai，3：對照非轉(zhuǎn)化植株，4～5：b8010(2個(gè)單株)，6-7：b8171(2個(gè)單株)，8-9：b8194(2個(gè)單株)。植物基因組dna(50μg)用ecori酶切后，用dig標(biāo)記bar基因探針進(jìn)行檢測圖；

圖4為t2和t3代轉(zhuǎn)基因大豆株系接種大豆胞囊線蟲3號生理小種鑒定圖；

圖5為dna片段的seq-1序列圖；

圖6為根特異性啟動(dòng)子的seq-2序列圖；

圖7為質(zhì)粒中dna片段的seq-3序列圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地表述本發(fā)明，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。

本發(fā)明的hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體，包括dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合，所述根特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)下游基因或dna片段在植物根中的特異性表達(dá)；所述dna片段如圖5中的seq-1所示，所述根特異性啟動(dòng)子序列如圖6中的seq-2所示。

在本實(shí)施例中，所述dna片段可以通過反轉(zhuǎn)錄獲得cdna片段，或是通過人工合成獲得；所述根特異性啟動(dòng)子可以通過pcr擴(kuò)增獲得，或是通過人工合成獲得。

在本實(shí)施例中，該載體還包括含有dna片段的質(zhì)粒，dna片段包括dna片段1，dna片段2，以及位于所述dna片段1和dna片段2之間的間隔序列；且所述dna片段1和dna片段2反向互補(bǔ)，dna片段如圖7中的seq-3所示。

在本實(shí)施例中，該載體還包括含有dna片段的質(zhì)粒，所述dna片段從上游至下游依次包括如下元件：根特異性啟動(dòng)子、dna片段1、間隔序列、dna片段2和終止子。

本發(fā)明還提供hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特征在于，dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合或是上述任一質(zhì)粒在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合或是上述任一質(zhì)粒在制備大豆胞囊線蟲生防制劑中的應(yīng)用。大豆胞囊線蟲具體可為大豆胞囊線蟲3號生理小種，盡管本發(fā)明僅利用大豆胞囊線蟲3生理號小種進(jìn)行了接種鑒定，但所述dna片段為保守序列，具有廣譜性，所以對其它大豆胞囊線蟲生理小種也具有相同的抑制效果。

在本實(shí)施例中，培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物的方法為將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對大豆胞囊線蟲抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。

在本實(shí)施例中，在目標(biāo)植物中表達(dá)dna片段的實(shí)現(xiàn)方式有：將上述任一一種所述質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)植物。

在本實(shí)施例中，在轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中含有所述dna片段，其主要在植物根細(xì)胞中特異表達(dá)，并直接或間接調(diào)控寄生大豆胞囊線蟲內(nèi)源基因的表達(dá)。在本實(shí)施例中，所述目標(biāo)植物和轉(zhuǎn)基因植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物為大豆。更具體可為栽培大豆，所述質(zhì)?？赏ㄟ^農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管介導(dǎo)法等導(dǎo)入目標(biāo)植物。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的hg-snb1基因片段介導(dǎo)的rnai載體及其在培育抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，具有如下優(yōu)勢：本發(fā)明將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對大豆胞囊線蟲抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對于培育抗大豆胞囊線蟲植物(特別是大豆)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。

質(zhì)粒phannibal-attb1：公眾可以從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所獲得。

質(zhì)粒pcambia3301：公眾可以從商業(yè)途徑獲得。

栽培大豆品種williams82：公眾可以從國家作物種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(http：//www.cgris.net/query/croplist.php)獲得。

大豆胞囊線蟲3號生理小種：為我國東北大豆產(chǎn)區(qū)scn主要生理小種，公眾可以從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得。參考文獻(xiàn)：段玉璽周博陳立杰吳海燕.抗大豆胞囊線蟲3號生理小種(scn3)核心種質(zhì)代表性分析.大豆科學(xué)，2008，3：366-372。

實(shí)施例中所用到的各種培養(yǎng)基配方見表1。ms合成鹽購自sigma公司，貨號為m5524。b5合成鹽購自sigma公司，貨號為g5768。

表1.培養(yǎng)基配方

實(shí)施例1.大豆胞囊線蟲hg-snb1基因片段及大豆根特異性啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)

利用線蟲基因組數(shù)據(jù)庫(nematode.net)及大豆胞囊線蟲ests數(shù)據(jù)庫信息，發(fā)現(xiàn)大豆胞囊線蟲基因hg-snb1存在保守序列。在該保守區(qū)內(nèi)最終確定了序列長度為302bp的片段，如seq-1所示。該序列與c.elegans小突觸泡蛋白(synaptobrevin-relatedprotein1)編碼基因序列相似。該基因突變導(dǎo)致c.elegan死亡。預(yù)期通過seq-1所示片段編碼的rna抑制大豆胞囊線蟲在根中發(fā)育或死亡。

利用phytozome數(shù)據(jù)庫(https：//phytozomejgi.doe.gov/pz/portal.html)、大豆公共數(shù)據(jù)庫(http：//soybase.org/)，根據(jù)大豆根特異表達(dá)基因gmglp7(glyma.20g220800.1，germin-likeproteinsubfamily1member7-like)上游序列設(shè)計(jì)特異性引物gmglp7-f1/gmglp7-r1。以大豆栽培品種williams82基因組dna為模板，利用kodfx高保真酶(日本toyobo公司)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件為：95℃5min；(94℃30s，59℃45s，72℃2min)，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并測序。擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1491bp，如seq-2所示。

gmglp7-f1：5’-tgaataagataagcttatatattatacgcaat-3’

gmglp7-r1：5’-aaaaaacctccatggttctccct-3’

實(shí)施例2.rnai重組質(zhì)粒的構(gòu)建

(1)以seq-2所示的雙鏈dna分子為模板，采用gmglp7-f2-attb5r和gmglp7-r2組成引物對，利用kodfx高保真酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

gmglp7-f2-attb5r：5’-cgagctcggggacaacttttgtatacaaagttgttgaataagataagcttatatattatacgcaat-3’

gmglp7-r2：5’-ccgctcgagaaaaaacctccatggttctccct-3’

gmglp7-f2-attb5r和gmglp7-r2引物對中，下劃線標(biāo)注酶切識別序列，其中，“gagctc”為限制性內(nèi)切酶saci的酶切識別序列?！癱tcgag”為限制性內(nèi)切酶xhoi的酶切識別序列，“ggggacaacttttgtatacaaagttgtt”為重組位點(diǎn)attb5r。

pgr反應(yīng)條件為：95℃2min；(94℃30s，56℃45s，72℃2min)，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化pgr擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約為1.5kb。

(2)用限制性內(nèi)切酶saci和xhoi雙酶切步驟(1)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物。

(3)用限制性內(nèi)切酶saci和xhoi雙酶切質(zhì)粒phannibal-attb1，回收載體骨架序列。

(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架序列連接，得到重組質(zhì)粒phannibal-attb5r-gmglp7-attb1。

(5)合成序列表的seq-1所示的雙鏈dna分子。

(6)以步驟(5)合成的雙鏈dna分子為模板，采用hg-snb1-f和hg-snb1-r組成的引物對

hg-snb1-f1：5’-ccggatccctcgaggaacccaaacgctcaacaacaag-3’

hg-snb1-r1：5’-ggatcgatggtaccttccagcccaaatgacgatgat-3’

hg-snb1-f1與hg-snb1-r1中，下劃線標(biāo)注酶切識別序列，其中“ggatcc”為限制性內(nèi)切酶bamhi的酶切識別序列，“ctcgag”為限制性內(nèi)切酶xhoi的酶切識別序列，“atcgat”為限制性內(nèi)切酶clai的酶切識別序列，“ggtacc”為限制性內(nèi)切酶kpni的酶切識別序列。

pcr反應(yīng)條件為：95℃2min；(94℃30s，56℃45s，72℃1min)，共30個(gè)循環(huán)；72℃5min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約為300bp。

(7)用限制性內(nèi)切酶xhoi和kpni雙酶切步驟(6)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物。

(8)用限制性內(nèi)切酶xhoi和kpni雙酶切質(zhì)粒phannibal-attb5r-gmglp7-attb1，回收載體骨架序列(約6.0kb)。

(9)將步驟(7)的酶切產(chǎn)物和步驟(8)的載體骨架序列連接，得到重組質(zhì)粒phannibal-gmglp7-revsnb1。

(10)用限制性內(nèi)切酶bamhi和clai雙酶切步驟(6)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物。

(11)用限制性內(nèi)切酶bamhi和clai雙酶切重組質(zhì)粒phannibal-gmglp7-revsnb1，回收載體骨架序列(約6.3kb)。

(12)將步驟(10)的酶切產(chǎn)物和步驟(11)的載體骨架序列連接，得到重組質(zhì)粒phannibal-gmglp7-snb1rnai。

(13)用限制性內(nèi)切酶saci和bamhi雙酶切質(zhì)粒phannibal-gmglp7-snb1rnai，回收約2.88kb酶切小片段(該片段自上游至下游依次包括大豆根特異啟動(dòng)子gmglp7，正義rna片段的編碼序列，間隔內(nèi)含子序列，反義rna片段的編碼序列。酶切dna片段兩端均為粘末端。

(14)用限制性內(nèi)切酶saci和bamhi雙酶切質(zhì)粒pcambia3301，回收載體骨架序列(約9.5kb)，dna酶切片段兩端均為粘末端。

(15)將步驟(13)的酶切小片段和步驟(14)的載體骨架序列連接，得到rnai重組質(zhì)粒pcambia3301-snb1rnai。載體質(zhì)粒示意圖見圖1。

實(shí)施例3.抗大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)基因植物的獲得與鑒定

1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化

(1)采用凍融法將重組質(zhì)粒pcambia3301-snb1rnai導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105，得到重組農(nóng)桿菌。

(2)用附表1中的ccm液體培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌，得到od600nm＝0.5-0.8的菌懸液備用。

(3)選取栽培大豆williams82種子，在含有氯氣的密閉容器中滅菌12-16個(gè)小時(shí)。

(4)取步驟(3)中滅菌后的種子，種臍朝下置于gm培養(yǎng)基平板上，23℃暗培養(yǎng)24小時(shí)。

(5)用無菌解剖刀沿種臍切開，并去掉腋芽，在腋芽上方子葉節(jié)位置輕微劃傷，然后置于步驟(2)得到的菌懸液中浸泡30-40分鐘。

(6)完成步驟(5)后，將種子移至鋪有無菌濾紙的ccm培養(yǎng)基平板上，23℃暗培養(yǎng)4-5天。

(7)完成步驟(6)后，將種子轉(zhuǎn)移至sim培養(yǎng)基上，25℃，16h(光)/8h(暗)條件下培養(yǎng)，每2-3周繼代1次。

(8)將誘導(dǎo)出叢生芽的外植體上的子葉切去，置于sem培養(yǎng)基平板上，25℃，16h(光)/8h(暗)條件下培養(yǎng)，每2-3周繼代1次，繼代時(shí)切去褐化的愈傷組織。

(9)當(dāng)再生芽生長至4-8cm時(shí)，將再生芽切下，然后轉(zhuǎn)移至rm培養(yǎng)基平板上，25℃，16h(光)/8h(暗)條件下培養(yǎng)。

(10)待抗性芽長至3-5cm，且長出健壯的根時(shí)，移至煉苗室馴化3-5天，然后轉(zhuǎn)移至溫室中生長，得到t0代植株。

(11)對移栽至溫室的t0代植株進(jìn)行pat/bar試紙條(libertylinkstrips，envirologix，usa)檢測。試紙條檢測陽性的植株即初步鑒定為轉(zhuǎn)基因植株。

2.轉(zhuǎn)基因大豆分子鑒定

(1)pat/bar試紙條檢測的陽性t0代植株自交后即獲得t1代株系。采用500mg/l除草劑-草丁膦進(jìn)行噴施，7天后非轉(zhuǎn)基因苗出現(xiàn)葉片黃化或枯死現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)正常。

(2)剪取t1代pat/bar試紙條陽性植株葉片進(jìn)行pcr檢測。提植株葉片的基因組dna，采用hg-snb1-f2和hg-snb1-r2組成的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為302bp。部分幼苗pcr鑒定結(jié)果見圖2。

hg-snb1-f2：5’-gaacccaaacgctcaacaacaagg-3’

hg-snb1-r2：5’-ttccagcccaaatgacgatgatgatg-3’

(3)剪取t1代轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行southern雜交檢測。采用高鹽ctab法提取高純度大豆基因組dna。ecori酶切總dna(～50μg)后，用0.8％瓊脂糖凝膠分離酶切片段。采用高鹽轉(zhuǎn)移法，將酶切片段轉(zhuǎn)移至帶正電荷的hyboodtm-n+尼龍膜(amersham，usa)上。以重組質(zhì)粒pcambia3301-snb1rnai為模板，采用bar-f和bar-r引物對擴(kuò)增bar基因片段，擴(kuò)增片段大小為441bp。利用dig隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(roche，usa)標(biāo)記探針。

bar-f：5’-gcaccatcgtcaaccactacatcgag-3’

bar-r：5’-tgaagtccagctgccagaaacccac-3’

采用roche公司的dighighprimednalabelinganddetectionstarterkitll試劑盒進(jìn)行分子雜交。雜交溫度為42℃，洗膜條件為2×ssc(含0.1％sds)，37℃條件下洗膜2次，每次5min；0.5×ssc(含0.1％sds)，66℃條件下洗膜2次，每次15min。然后利用bcip/nbt在雜交膜上化學(xué)顯色。部分轉(zhuǎn)基因大豆southern雜交檢測結(jié)果見圖3。

(4)收獲southern雜交陽性的t1代植株自交后得到的種子，播種后長出t2代幼苗，繼續(xù)采用500mg/l除草劑-草丁膦和pcr進(jìn)行跟蹤檢測，并去除非轉(zhuǎn)基因植株，直至獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系。

4.轉(zhuǎn)基因大豆抗胞囊線蟲鑒定

采用病土接種法(病土采自吉林省洮南地區(qū))，對t2代和t3代轉(zhuǎn)基因大豆株系b8010、b8171、b8194、b8212、b8234、b8294進(jìn)行抗性鑒定，受體對照品種為栽培大豆品種williams82。采用golden(1970)確立的一套鑒別寄主，riggs(1988)給定的鑒定模式，確定接種土樣中胞囊線蟲為3號小種。抗性分級參照shannon1992年提出鑒定大豆抗病性的ip標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，高抗0～9％(hr)，中抗10％～30％(mr)，中感31％～60％(ms)，高感大于60％(vs)。ip指數(shù)＝(供試品種的平均胞囊量/感病對照品種的平均胞囊量)×100?？剐澡b定試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)鑒定植株12株。

連續(xù)2代鑒定結(jié)果表明，與受體對照品種相比，轉(zhuǎn)基因大豆b8010、b8171、b8194、b8212、b8234、b8294平均胞囊數(shù)量和ip值均顯著降低。在鑒定的6個(gè)株系中，其中b8212、b8294和b8194平均胞囊數(shù)量和ip值最低，表現(xiàn)為高抗(hr)。另外3個(gè)株系b8234、b8171和b8010的平均胞囊數(shù)量和ip值也顯著低于對照非轉(zhuǎn)基因大豆williams82，在不同年份間表現(xiàn)為中抗或高抗。表明將重組rnai表達(dá)載體導(dǎo)入植物，可以顯著提高植物對大豆胞囊線蟲的抗性?？剐澡b定結(jié)果見表2和圖4。

表2.t2/t3代轉(zhuǎn)基因大豆抗scn鑒定結(jié)果

以上公開的僅為本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，但是本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。