本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一對(duì)高特異性高親和力抗人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人n末端b型腦鈉肽前體(n-terminalpro-brainnatriureticpeptide,nt-probnp)是心肌細(xì)胞在合成多肽類(lèi)激素b型腦鈉肽(bnp)過(guò)程中產(chǎn)生的無(wú)生物活性的，由76個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽片段。健康成年人血漿中nt-probnp含量較低，一般低于300pg/ml。隨著心室的體積和壓力增高可導(dǎo)致血漿內(nèi)nt-probnp值升高，升高的程度與心室擴(kuò)張和壓力超負(fù)荷成正比，心衰患者血漿中nt-probnp含量甚至高達(dá)幾十個(gè)ng/ml，nt-probnp含量能及時(shí)、特異地反應(yīng)心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。早在2002年，國(guó)際上已經(jīng)公認(rèn)nt-probnp是測(cè)定心衰的一個(gè)劃時(shí)代的具有特異性的標(biāo)志物。

2002年11月19日，fda批準(zhǔn)羅氏診斷試劑公司(rochediagnostics,inc)開(kāi)發(fā)的一種用于實(shí)驗(yàn)室?guī)椭\斷充血性心力衰竭新的elecsysprobnp酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒上市。目前，臨床上主要是采用以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)人n端腦鈉肽前體，相關(guān)檢測(cè)技術(shù)主要包括電化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫熒光法(elfi)、放射免疫法(ria)、高靈敏度的免疫放射法(irma)、微粒子酶免疫法(meia)，這些檢測(cè)方法大都均依賴(lài)于國(guó)外進(jìn)口大型貴重儀器試劑實(shí)現(xiàn)，患者使用成本高。因此，自主研發(fā)我國(guó)的nt-probnp檢測(cè)試劑盒，改變目前高端臨床診斷試劑幾乎完全依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品的狀況，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

雙抗體夾心elisa由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，并且操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)高親和力、高特異性的抗人n端腦鈉肽前體的單抗的制備，篩選能配對(duì)的抗體，結(jié)合elisa靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等特性，建立雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，為快速可靠的人n端腦鈉肽前體的免疫學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

用于雙抗體夾心elisa的抗體除了具備高特異性、高親和力之外，還要能識(shí)別同一抗原的不同表位。此外，兩株抗體不僅要求能識(shí)別免疫原，而且需要能與樣本中的天然抗原起反應(yīng)。因此，制備的單克隆抗體的質(zhì)量是成功研發(fā)雙抗體夾心elisa試劑盒的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中人n端腦鈉肽前體檢測(cè)技術(shù)存在的缺陷和不足，提供一對(duì)靶向人n端腦鈉肽前體(n-terminalpro-brainnatriureticpeptide,nt-probnp)不同表位的鼠源性單克隆抗體，該對(duì)抗體能高親和力、高特異性的結(jié)合人n端腦鈉肽前體的不同抗原表位，建立雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法對(duì)人血漿中n端腦鈉肽前體定量檢測(cè)。

本發(fā)明的目的在于提供一種高特異性高親和力結(jié)合人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體。

本發(fā)明另一目的在于提供分泌上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種高特異性高親和力結(jié)合人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體，該單克隆抗體為ab1或ab5，單克隆抗體ab1和ab5的可變區(qū)基因均包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

所述單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.5所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.6所示；

所述單克隆抗體ab5的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.8所示。

進(jìn)一步的，所述單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.1所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.2所示；

所述單克隆抗體ab5重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.3所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.4所示。

進(jìn)一步的，所述單克隆抗體ab1由雜交瘤細(xì)胞株3a2分泌產(chǎn)生，雜交瘤細(xì)胞株3a2于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201633；

所述單克隆抗體ab5由雜交瘤細(xì)胞株4g8分泌產(chǎn)生，雜交瘤細(xì)胞株4g8于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201634。

上述任一項(xiàng)所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的雙抗體夾心elisa，該試劑盒中含有上述任一項(xiàng)所述的單克隆抗體ab1和ab5。

一種雜交瘤細(xì)胞株3a2，于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201633。

雜交瘤細(xì)胞株3a2在生產(chǎn)抗人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體中的應(yīng)用。

一種雜交瘤細(xì)胞株4g8，于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201634。

雜交瘤細(xì)胞株4g8在生產(chǎn)抗人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的雙抗體夾心elisa方法，該方法以上述任一所述的單克隆抗體ab1作為檢測(cè)抗體，以上述任一所述的單克隆抗體ab5作為捕獲抗體，該方法用于非疾病的診斷的治療。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明公開(kāi)了能特異性結(jié)合人n端腦鈉肽前體的鼠源性單克隆抗體ab1和ab5，該對(duì)抗體能特異性結(jié)合人n端腦鈉肽前體的不同表位，形成雙抗體夾心模式，實(shí)現(xiàn)人血漿中的n端腦鈉肽前體的定量檢測(cè)，可在臨床上用于人血漿中n端腦鈉肽前體的檢測(cè)，對(duì)心衰的早期診斷具有重要的指導(dǎo)意義。

2)以ab1作為檢測(cè)抗體，ab5作為捕獲抗體建立的雙抗體夾心elisa方法具有很好的檢測(cè)特異性和靈敏度。檢測(cè)靈敏度與進(jìn)口試劑盒比較相近，而本發(fā)明建立的雙抗體夾心elisa方法具有更大的線性范圍，具有推廣應(yīng)用的商業(yè)價(jià)值。

3)本發(fā)明通過(guò)大量的研究和探索，得到了6株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，其中細(xì)胞株3a2和4g8分別分泌的ab1和ab5這兩株高特異性、高親和力的單抗能形成配對(duì)，且ab1/hrp-ab5這個(gè)配對(duì)組合有較高的靈敏度和較大的線性范圍；利用最佳配對(duì)組合ab1/hrp-ab5建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以ab1作為檢測(cè)抗體，ab5作為捕獲抗體建立了雙抗體夾心elisa方法，其線性范圍為300pg/ml～9600pg/ml，優(yōu)于進(jìn)口試劑盒的線性范圍31pg/ml～300pg/ml。

4)樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙抗體夾心elisa方法對(duì)人n端腦鈉肽前體的陽(yáng)性檢出率為97.5％，陰性檢出率為100％，因此可以明確，本發(fā)明得到了2株高特異性，高親和力的抗人n端腦鈉肽前體單克隆抗體，可用于夾心elisa試劑盒的研制。

附圖說(shuō)明

圖1為純化后單克隆抗體ab1～ab6的sds-page檢測(cè)；

圖2為腹水型單克隆抗體ab1～ab6的效價(jià)檢測(cè)；

圖3為單克隆抗體ab1～ab6的亞型檢測(cè)；

圖4為6株單克隆抗體ab1～ab6的交叉反應(yīng)檢測(cè)；

圖5為不同配對(duì)抗體組合對(duì)抗原檢測(cè)的效果；

圖6為抗hnt-probnp單克隆抗體ab1、ab5的親和力測(cè)定曲線；

圖7為單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)；

圖8為單克隆抗體ab1輕鏈可變區(qū)的3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)；

圖9為單克隆抗體ab5重鏈可變區(qū)的3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)；

圖10為單克隆抗體ab5輕鏈可變區(qū)的3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)；

圖11為本發(fā)明配對(duì)抗體ab1/hrp-ab5與abnova試劑盒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖12本發(fā)明ab1/hrp-ab5雙抗體夾心elisa法檢測(cè)結(jié)果與醫(yī)院檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析。

具體實(shí)施方式

一種高特異性高親和力結(jié)合人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體，該單克隆抗體為ab1或ab5，單克隆抗體ab1和ab5的可變區(qū)基因均包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

所述單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.5所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.6所示；

所述單克隆抗體ab5的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.8所示。

優(yōu)選的，所述單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.1所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.2所示；

所述單克隆抗體ab5重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.3所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.4所示。

優(yōu)選的，所述單克隆抗體ab1由雜交瘤細(xì)胞株3a2分泌產(chǎn)生，雜交瘤細(xì)胞株3a2于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201633。

優(yōu)選的，所述單克隆抗體ab5由雜交瘤細(xì)胞株4g8分泌產(chǎn)生，雜交瘤細(xì)胞株4g8于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201634。

一種檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的試劑盒，該試劑盒中含有上述任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。

一種檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的雙抗體夾心elisa，該試劑盒中含有上述任一項(xiàng)所述的單克隆抗體ab1和ab5。

上述任一所述單克隆抗體在制備檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

一種雜交瘤細(xì)胞株3a2，于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201633。

上述雜交瘤細(xì)胞株3a2在生產(chǎn)抗人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體中的應(yīng)用。

一種雜交瘤細(xì)胞株4g8，于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201634。

上述雜交瘤細(xì)胞株4g8在生產(chǎn)抗人n端腦鈉肽前體的單克隆抗體中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體的雙抗體夾心elisa方法，該方法以上述任一所述的單克隆抗體ab1作為檢測(cè)抗體，以上述任一所述的單克隆抗體ab5作為捕獲抗體，該方法用于非疾病的診斷的治療。

優(yōu)選的，上述方法具體包括以下步驟：

s1.包被：用含單克隆抗體ab1的溶液對(duì)包被板進(jìn)行過(guò)夜包被；

s2.封閉：將包被有ab1的包被板用pbst洗滌干凈，再用脫脂奶粉或bsa進(jìn)行封閉；

s3.加抗原：將封閉好的包被板用pbst洗滌干凈，加入待檢測(cè)血漿樣本，孵育50～70min；

s4.加二抗：將孵育樣本后的包被板用pbst洗滌干凈，加入二抗hrp-ab5，孵育30～50min；

s5.用pbst洗滌干凈，拍干后加入tmb顯色液，室溫避光孵育后終止顯色，酶標(biāo)儀讀取od450值。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株制備

一、本實(shí)施例所用材料

(1)試劑及動(dòng)物：

抗原人n端腦鈉肽前體(n-terminalpro-brainnatriureticpeptide,nt-probnp)從abcam公司購(gòu)買(mǎi)，貨號(hào)ab51403，其濃度為1.01mg/ml，為大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白，分子量為9.28kda，由76個(gè)氨基酸殘基組成。

抗人n端腦鈉肽前體商品化抗體購(gòu)自hytest公司；人n端腦鈉肽前體elisa檢測(cè)試劑盒購(gòu)自abnova公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)sigma公司，prmi1640培養(yǎng)基、胎牛血清、hat、ht、聚乙二醇(peg，mw4000)均為美國(guó)gibco公司產(chǎn)品；小鼠骨髓瘤細(xì)胞(sp2/0)為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；spf級(jí)balb/c純系雌性小鼠，鼠齡6～8周，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒(a型、b型)購(gòu)自泰天和生物技術(shù)有限公司；正常人血漿和病人血漿取自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科。

(2)儀器：multiskanmk3酶標(biāo)儀、bb15型co2培養(yǎng)箱均為美國(guó)thermofisher公司產(chǎn)品；milli-qadvantagea10超純水儀是美國(guó)millipore公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)為eppendorf為公司產(chǎn)品；proteing親和層析柱為ge公司產(chǎn)品。

二、雜交瘤細(xì)胞株的制備

(1)動(dòng)物免疫

1)初次免疫：免疫劑量為每只小鼠100μg/100μl，與等量弗氏完全佐劑充分乳化后皮下多點(diǎn)注射；

2)二次免疫：2周后，與初次免疫同樣的抗原量加等量弗氏不完全佐劑充分乳化后皮下多點(diǎn)注射；

3)三次免疫：2周后，與初次免疫同樣的抗原量加等量弗氏不完全佐劑充分乳化后皮下多點(diǎn)注射(10天后尾靜脈采血測(cè)其效價(jià))；

4)加強(qiáng)免疫：三次免疫效價(jià)達(dá)到細(xì)胞融合要求后，用初次免疫同樣的抗原量不加佐劑進(jìn)行腹腔注射；

5)72h后取脾臟融合。

(2)細(xì)胞融合

1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：取一只健康的balb/c小鼠，摘眼球采血，待血放干凈以后，頸脫臼處死，體表消毒和固定后，從大腿上剪開(kāi)皮膚，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用5ml注射器注射10mlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(rpmimedium1640basic，gibco購(gòu)買(mǎi)，貨號(hào)8114056，使用前加入青霉素與鏈霉素，加入量為每100ml培養(yǎng)基加入1ml含100u的青霉素與鏈霉素雙抗)到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內(nèi)液體，注入已準(zhǔn)備好的無(wú)菌10ml離心管中，1000rmp離心7分鐘，用10％胎牛血清rpmi1640(含hat)完全培養(yǎng)基重懸，稀釋約為2×105個(gè)/ml,隨后加入到96孔板中，每孔100μl,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)中備用。

2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0，用rpmi1640無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌，吹懸稀釋后計(jì)數(shù)；

3)取小鼠脾臟，rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌、碾磨制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；

4)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10的比例混合在一起，1000rpm離心7min；

5)棄上清，用滴管吸盡殘余液體，在37℃水浴條件下1min內(nèi)逐滴加入1ml的聚乙二醇(peg)，靜置90秒，2～4min內(nèi)逐滴加入15mlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止反應(yīng)；

6)1000rpm離心7min，棄上清，用100ml10％胎牛血清rpmi1640(含hat)輕輕混懸；滴加于預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，100μl/孔；37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

(3)融合細(xì)胞的篩選與克隆化

1)細(xì)胞融合后第7天左右取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用包被有400ng/ml人n端腦鈉肽前體的elisa板通過(guò)間接elisa法對(duì)原始孔初篩，篩選陽(yáng)性孔；用免疫小鼠融合前取的血漿作為陽(yáng)性對(duì)照，用sp2/0上清作為陰性對(duì)照。最終篩選出19株陽(yáng)性細(xì)胞株。

2)將讓所得19株原始陽(yáng)性孔細(xì)胞株再進(jìn)行3～4次的克隆化試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)其中10株細(xì)胞株穩(wěn)定，細(xì)胞上清效價(jià)較高；其中5細(xì)胞株不穩(wěn)定，在克隆化過(guò)程中細(xì)胞上清檢測(cè)值越來(lái)越低；剩下4株細(xì)胞株則逐漸喪失分泌抗體能力，發(fā)生陽(yáng)性細(xì)胞丟失現(xiàn)象。最終選擇穩(wěn)定分泌抗體、上清效價(jià)較高的6株雜交瘤細(xì)胞株ab1～ab6進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2單克隆抗體的制備及純度檢測(cè)

對(duì)細(xì)胞上清效價(jià)較高的6株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株(ab1～ab6)采取體內(nèi)誘生腹水型單克隆抗體，經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨粗純、proteing親和層析柱進(jìn)一步純化后，采用還原性sds-page蛋白凝膠電泳對(duì)6株雜交瘤細(xì)胞株(ab1～ab6)分泌的抗人n端腦鈉肽前體單克隆抗體(ab1～ab6)的純度進(jìn)行分析。

一、腹水型單克隆抗體的制備：

1)取10周齡雌性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐劑；

2)1周后于小鼠腹腔接種約5×10⁵個(gè)雜交瘤細(xì)胞，細(xì)胞接種7～12天后可誘生腹水；

3)待腹水盡可能多時(shí)抽取腹水；

4)間隔1～2天，待腹水再生積聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm/min離心10min，取上清置于-20℃保存。

二、單克隆抗體的純化

1)取腹水4℃12000rpm/min離心30min，取上清；

2)持續(xù)攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨溶液，4℃靜置過(guò)夜；

3)過(guò)夜后的液體于7500rpm/min，4℃離心30min，棄上清，沉淀用0.015mpbs復(fù)溶；

4)將復(fù)溶液用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理，具體操作步驟如下：

①平衡柱子：用0.015mpbs(5～10倍柱體積)，平衡柱子，沖出柱內(nèi)20％乙醇，將核酸蛋白儀調(diào)零；

②上樣：上樣前，先將恒流泵關(guān)閉，再緩慢上樣，上樣完畢后持續(xù)通入0.015mpbs，當(dāng)a值開(kāi)始上升時(shí)，收集液體(目的蛋白)，當(dāng)a值下降到10以下時(shí)停止收集。收集的樣本繼續(xù)進(jìn)行下一步的純化。

③平衡柱子：當(dāng)a值為“0”時(shí)，用0.015mpbs(5倍以上柱體積)過(guò)柱；

④保存：用20％乙醇(5倍柱體積)過(guò)柱子，保存柱子。

5)proteing親和層析柱純化脫鹽后的蛋白，純化步驟如下：

①裝柱平衡柱子：用0.015mpbs(5～10倍柱體積)，平衡柱子，沖出柱內(nèi)20％乙醇，將核酸蛋白儀調(diào)零；

②上樣：上樣前，先將恒流泵關(guān)閉，再緩慢上樣，當(dāng)a值開(kāi)始上升時(shí)，收集液體(雜蛋白)防止蛋白質(zhì)未結(jié)合上柱子，當(dāng)樣品即將上樣完畢時(shí)加入0.015mpbs稀釋?zhuān)沟鞍踪|(zhì)幾乎完全上柱；

③洗脫：當(dāng)a值降至“0”時(shí)，用洗脫液洗脫目的蛋白，當(dāng)a值開(kāi)始上升時(shí)收集液體(由于蛋白質(zhì)帶負(fù)電，呈弱堿性，收集管中預(yù)先加入一定量中和液，使收集液ph保持在7.0以上)；

④平衡柱子：當(dāng)a值為“0”時(shí)，用0.015mpbs(5倍以上柱體積)過(guò)柱；

⑤保存：用20％乙醇(5倍柱體積)過(guò)柱子，保存柱子。

⑥蛋白質(zhì)超濾濃縮后取少量進(jìn)行sds-page凝膠電泳鑒定純度。

6株雜交瘤細(xì)胞株(ab1～ab6)分泌的抗人n端腦鈉肽前體單克隆抗體(ab1～ab6)的純度分析結(jié)果如圖1所示，從中可以看出單抗ab1～ab6的重鏈與輕鏈條帶的相對(duì)分子質(zhì)量(mr)分別位于50kda和25kda附近，未見(jiàn)明顯雜帶，說(shuō)明純化效果良好，可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例3單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

將實(shí)施例2中經(jīng)飽和硫酸銨粗純、親和層析proteing柱純化后的6株腹水型單克隆抗體ab1～ab6分別經(jīng)bca蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示ab1～ab6抗體的蛋白濃度分別為8.9mg/ml、10.9mg/ml、8.9mg/ml、5.4mg/ml、5.3mg/ml、7.1mg/ml、4.1mg/ml。

用間接elisa法檢測(cè)抗體ab1～ab6的效價(jià)，將人n端腦鈉肽前體用包被液分別稀釋為400ng/ml，每孔加入100μl，4℃孵育過(guò)夜。用pbst(吐溫含量為0.05％)洗滌三次，每次3min，再用5％的脫脂奶粉37℃封閉1h,pbst洗滌三次，每次3min，拍干后放置-20℃?zhèn)溆?。效價(jià)測(cè)定時(shí)，將抗體進(jìn)行倍比稀釋。稀釋后，每孔加入100μl，37℃孵育1h。pbst洗滌3次，每次3min,再加入8000倍稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗100μl，37℃孵育40min。pbst洗滌5次，加入ab顯色液，室溫避光反應(yīng)10min后終止，酶標(biāo)儀讀取od450值，取od450值在1.0左右時(shí)抗體稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。

抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從中可以看出ab1～ab3和ab5的效價(jià)均超過(guò)1:1.0×10⁶，ab4和ab6效價(jià)介于1:1.0×10⁵～1.0×10⁶之間。

實(shí)施例4單克隆抗體亞型的鑒定

采用市購(gòu)的小鼠mab分型試劑盒對(duì)經(jīng)過(guò)親和純化的6株抗人n端腦鈉肽前體單克隆抗體進(jìn)行ig類(lèi)及亞類(lèi)鑒定，所有操作均嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

抗體亞型的鑒定對(duì)抗體純化及應(yīng)用具有指導(dǎo)作用，收集抗人nt-probnp陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株ab1～ab6的細(xì)胞上清，根據(jù)小鼠單抗亞型鑒定試劑盒，采用間接elisa測(cè)定6株單克隆抗體ab1～ab6的亞型。測(cè)定結(jié)果如圖3所示，根據(jù)抗體重鏈類(lèi)型分類(lèi)，ab1～ab5均為igg1型，ab6為igg2b型；根據(jù)抗體輕鏈分類(lèi)，ab1～ab6均屬于κ型。

實(shí)施例5單克隆抗體的特異性鑒定

單克隆抗體的特異性鑒定結(jié)果如圖4所示，6株單克隆抗體ab1～ab6除了與nt-probnp出現(xiàn)良好的抗原抗體反應(yīng)之外，與常見(jiàn)的心肌標(biāo)志物myo、ck-mb、ctni以及載體蛋白klh和功能蛋白has均無(wú)明顯交叉反應(yīng)，說(shuō)明6株單克隆抗體ab1～ab6特異性良好。

實(shí)施例6人血漿中n端腦鈉肽前體的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法

一、雙抗體夾心初步配對(duì)實(shí)驗(yàn)

選取親和純化后效價(jià)較高的單克隆抗體ab1～ab6分別進(jìn)行hrp標(biāo)記和包被，分別作為檢測(cè)抗體和捕獲抗體，采用棋盤(pán)法雙抗體夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行配對(duì)抗體的初步篩選(如表1所示的配對(duì)情況)。

雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，步驟如下：

s1.包被：將捕獲單克隆抗體用ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度1～2μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被過(guò)夜；

s2.封閉：pbst(含0.05％吐溫)洗滌3次，3min/次，用5％脫脂奶粉或2％bsa進(jìn)行封閉，每孔200μl，37℃孵育1h；

s3.加抗原：pbst洗滌3次，3min/次，拍干后依次加入人n端腦鈉肽前體抗原，每孔50μl，37℃孵育1h；

s4.加二抗：pbst洗滌3～5次，用5％脫脂奶粉8000倍稀釋二抗(hrp標(biāo)記的檢測(cè)抗體)，每孔50μl，37℃孵育45min；

s5.用pbst洗滌3～5次，每次3min，拍干后加入tmb顯色液，室溫避光孵育10～15min后終止，酶標(biāo)儀讀取od450值。

在雙抗體夾心配對(duì)過(guò)程中，抗體針對(duì)相同或者相近的表位無(wú)法形成夾心配對(duì)，只有針對(duì)的兩個(gè)表位不同并且相隔較遠(yuǎn)，才有可能形成配對(duì)。在加入抗原量相同的情況下，od450值越高，說(shuō)明配對(duì)效果越好。本實(shí)驗(yàn)中，只要od450值高于0.3即認(rèn)為可以進(jìn)行夾心配對(duì)。

不同抗體配對(duì)效果的檢測(cè)結(jié)果如表1所示，在36(6×6)種抗體配對(duì)組合中，有12種組合可形成雙抗體夾心配對(duì)，其中，具有較好配對(duì)效果的共有4種組合：ab1/hrp-ab5、ab2/hrp-ab5、ab3/hrp-ab5、ab4/hrp-ab5(捕獲抗體/檢測(cè)抗體)。

表1雙抗體夾心elisa法篩選配對(duì)抗體

注：“+”“—”數(shù)量表示od450nm值高低：其中“—”表示od450nm值≤0.3；“+”表示0.3＜o(jì)d450nm值≤1.0；“+++”表示od450nm值≥3.0。

二、雙抗體夾心法中最佳配對(duì)抗體的選擇

將上述四組抗體配對(duì)(ab1/hrp-ab5、ab2/hrp-ab5、ab3/hrp-ab5、ab4/hrp-ab5)作進(jìn)一步的效果檢測(cè)，比較四組配對(duì)的檢測(cè)曲線，發(fā)現(xiàn)ab1/hrp-ab5這組配對(duì)抗體的檢測(cè)范圍廣、靈敏度高，為最佳配對(duì)抗體(如圖5所示)。

三、ab1/hrp-ab5配對(duì)抗體的親和常數(shù)測(cè)定

對(duì)實(shí)驗(yàn)選出的配對(duì)效果最好的兩株抗體ab1和ab5采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定其親和常數(shù)ka值。按照公式ka＝(n-1)/2(n[ab']t-[ab]t)計(jì)算親和力常數(shù)ka值。用人n端腦鈉肽前體抗原包被elisa板，ab1的抗原包被梯度為400ng/ml、100ng/ml、25ng/ml，ab5的抗原包被梯度為800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml，再加入倍比稀釋的抗體，37℃孵育1h后，pbst洗滌3次，3min/次，拍干后加入1∶8000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育40min，pbst洗滌5次，3min/次，拍干后加入顯色液，室溫避光孵育10min后終止，酶標(biāo)儀讀取od450值。以抗體濃度作為橫坐標(biāo)，od450值為縱坐標(biāo)作圖，曲線上部平坦段的od450值最大od值，通過(guò)擬合算出最大od值一半所對(duì)應(yīng)的抗體濃度，然后按照上述公式計(jì)算出親和常數(shù)ka值。

實(shí)驗(yàn)得到的曲線如圖6所示，ab1的親和常數(shù)為1.0×10¹⁰l/mol，ab5的親和常數(shù)為5.9×10⁹l/mol，具有較高親和力。

實(shí)施例7單克隆抗體ab1和ab5對(duì)應(yīng)的抗原表位

綜合上述實(shí)施例1～5中的研究結(jié)果，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)單克隆抗體ab1和ab5在檢測(cè)人血漿中n端腦鈉肽前體中具有最佳的檢測(cè)效果，故對(duì)單克隆抗體ab1和ab5對(duì)應(yīng)的抗原表位作進(jìn)一步分析。

根據(jù)nt-probnp抗原表位預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)，76個(gè)氨基酸分子中，合成了兩段線性表位偶聯(lián)klh進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ab1為免疫第5-27氨基酸線性表位獲得的抗體，ab5為免疫第61-76氨基酸線性表位獲得的抗體。

同時(shí)，對(duì)分泌產(chǎn)生單克隆抗體ab1的雜交瘤細(xì)胞株ab1(以下稱(chēng)為雜交瘤細(xì)胞株3a2)進(jìn)保藏，雜交瘤細(xì)胞株3a2于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201633，并于2016年3月26日檢測(cè)為存活。

對(duì)分泌產(chǎn)生單克隆抗體ab5的雜交瘤細(xì)胞株ab5(以下稱(chēng)為雜交瘤細(xì)胞株4g8)進(jìn)保藏，雜交瘤細(xì)胞株4g8于2016年3月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201634，并于2016年3月26日檢測(cè)為存活。

實(shí)施例8單克隆抗體ab1和ab5的序列和結(jié)構(gòu)分析

(1)基因序列分析

對(duì)所得到的單克隆抗體ab1和ab5作進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)ab1和ab5的可變區(qū)基因均包括重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；單克隆抗體ab1的重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.1所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.2所示；單克隆抗體ab5的重鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.3所示，輕鏈可變區(qū)的基因序列如seqidno.4所示。

單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的基因序列(seqidno.1)：

gtcaagctgcaggagtctggacctgagctggtgaagcctggggcctcacagaagatttcctgtaagacttctggatacacgttcactgtttacaccctccactgggtgaaacagagtcatggaaagagccttgagtggattggtgctatcaatcctaagacaggtagtattaggaacaaccagaaattcagggacaaggccatattgactatagacaggtcctccaacacagcctacatggacctccgcagccttacatctgatgattctgcagtctatttttgtgcaagaaatggcggtcacgacgtttacttttttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca；

單克隆抗體ab1輕鏈可變區(qū)的基因序列(seqidno.2)：

gacattgtgctgacacaatctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaa；

單克隆抗體ab5重鏈可變區(qū)的基因序列(seqidno.3)：

gtgaaactgcaggagtcaggggctgagctggcaaaacctggggcctcagtgaggatgtcctgcaagacttctggctacatctttactgactactggatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattgatcctaacactggttatactgaatataatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgaacagcctgacatctgaagactctgcagtctattactgtgcaagagagggggataattacgacggctctccctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca；

單克隆抗體ab5輕鏈可變區(qū)的基因序列(seqidno.4)：

gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaa。

(2)氨基酸序列分析

單克隆抗體ab1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.5所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.6所示；所述單克隆抗體ab5的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.8所示。

單克隆抗體ab1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(seqidno.5)：

vklqesgpelvkpgasqkiscktsgytftvytlhwvkqshgkslewigainpktgsirnnqkfrdkailtidrssntaymdlrsltsddsavyfcarngghdvyffdywgqgttvtvss；

單克隆抗體ab1輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(seqidno.6)：

divltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk；

單克隆抗體ab5重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(seqidno.7)：

vklqesgaelakpgasvrmscktsgyiftdywmhwvkqrpgqglewigyidpntgyteynqkfkdkatltadkssstaymqlnsltsedsavyycaregdnydgspwgqgttvtvss；

單克隆抗體ab5輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(seqidno.8)：

divltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk。

(3)功能區(qū)域分析

所述單克隆抗體ab1的重鏈可變區(qū)由357個(gè)堿基組成，編碼119個(gè)氨基酸，可變區(qū)含有3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)。cdr1編碼8個(gè)氨基酸，cdr2編碼8個(gè)氨基酸，cdr3編碼13個(gè)氨基酸(如附圖7所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性為85.9％，其中cdr1與cdr2區(qū)則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。

所述單克隆抗體ab1的輕鏈可變區(qū)由324個(gè)堿基組成，編碼108個(gè)氨基酸，可變區(qū)含有3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)。cdr1編碼10個(gè)氨基酸，cdr2編碼3個(gè)氨基酸，cdr3編碼8個(gè)氨基酸(如附圖8所示)。可變區(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性為98％，其中cdr2與cdr3區(qū)則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。

所述單克隆抗體ab5的重鏈可變區(qū)由351個(gè)堿基組成，編碼117個(gè)氨基酸，可變區(qū)含有3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)。cdr1編碼8個(gè)氨基酸，cdr2編碼8個(gè)氨基酸，cdr3編碼11個(gè)氨基酸(如附圖9所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性為92.5％，其中cdr1與cdr2區(qū)則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。

所述單克隆抗體ab5的輕鏈可變區(qū)由324個(gè)堿基組成，編碼108個(gè)氨基酸，可變區(qū)含有3個(gè)cdr(互補(bǔ)決定簇)區(qū)。cdr1編碼10個(gè)氨基酸，cdr2編碼3個(gè)氨基酸，cdr3編碼8個(gè)氨基酸(如附圖10所示)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)與其他鼠源性抗體的同源性為98.3％，其中cdr2與cdr3區(qū)則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區(qū)cdr區(qū)有差異。

上述兩株抗人n端腦鈉肽前體單克隆抗體ab1和ab5的功能由抗體輕、重鏈可變區(qū)抗原互補(bǔ)決定族(complementaritydetermingregionscdrs)cdr1、cdr2、cdr3(功能活性區(qū))中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體特異性結(jié)合人n端腦鈉肽前體上的不同表位。

實(shí)施例9配對(duì)抗體ab1/hrp-ab5雙抗體夾心elisa檢測(cè)線性范圍的確定

一、配對(duì)抗體ab1/hrp-ab5雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，步驟如下：

s1.包被：將捕獲單克隆抗體ab1用ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度1～2μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被過(guò)夜；

s2.封閉：pbst(含0.05％吐溫)洗滌3次，3min/次，用5％脫脂奶粉或2％bsa進(jìn)行封閉，每孔200μl，37℃孵育1h；

s3.加抗原：pbst洗滌3次，3min/次，拍干后依次加入人n端腦鈉肽前體抗原(10～10000g/ml)，每孔50μl，37℃孵育1h；

s4.加二抗：pbst洗滌3～5次，用5％脫脂奶粉8000倍稀釋二抗(hrp標(biāo)記的檢測(cè)抗體hrp-ab5)，每孔50μl，37℃孵育45min；

s5.用pbst洗滌3～5次，每次3min，拍干后加入tmb顯色液，室溫避光孵育10～15min后終止，酶標(biāo)儀讀取od450值，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。并與進(jìn)口試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線作對(duì)比，進(jìn)口試劑盒(購(gòu)自abnova公司，貨號(hào)ka3099)的標(biāo)準(zhǔn)曲線則嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

檢測(cè)結(jié)果如圖11所示，本發(fā)明建立的ab1/hrp-ab5這組配對(duì)抗體的線性檢測(cè)范圍為300pg/ml～9600pg/ml，而目前現(xiàn)有abnova雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒的線性檢測(cè)范圍為31pg/ml～300pg/ml。由此可見(jiàn)，在線性檢測(cè)范圍方面，本發(fā)明配對(duì)抗體ab1/hrp-ab5遠(yuǎn)優(yōu)于abnova試劑盒。

實(shí)施例10配對(duì)抗體ab1/hrp-ab5在臨床樣本檢測(cè)中的應(yīng)用

用實(shí)施例8建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行血漿樣本的檢測(cè)，并與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行對(duì)照，驗(yàn)證本發(fā)明方法檢測(cè)臨床樣本的準(zhǔn)確度。

共從醫(yī)院收集了80份陽(yáng)性漿和40份陰性血漿，分別用本發(fā)明建立的方法和試劑盒(以抗人n端腦鈉肽前體單克隆抗體ab1和ab5為基礎(chǔ)建立的雙抗體夾心elisa方法)與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率和陰性率，比較結(jié)果的準(zhǔn)確性。

檢測(cè)結(jié)果如表2所示，兩種試劑盒均能有效檢測(cè)出血漿中nt-probnp濃度，abnova對(duì)陽(yáng)性樣本的檢出率為100％，陰性樣本檢出率為92.5％，其中三例陰性樣本檢測(cè)為陽(yáng)性。自制配對(duì)抗體陽(yáng)性樣本檢出率為97.5％，其中兩例陽(yáng)性樣本檢測(cè)為陰性，陰性樣本檢出率為100％，無(wú)假陽(yáng)性。證明基于ab1/hrp-ab5這對(duì)配對(duì)抗體初步建立的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法能有效為臨床診斷提供參考，為新型快速診斷技術(shù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

表2本發(fā)明ab1/hrp-ab5雙抗體夾心elisa法與進(jìn)口elisa試劑盒的檢測(cè)效果對(duì)比

將80份臨床陽(yáng)性血液樣本用本發(fā)明ab1/hrp-ab5配對(duì)抗體檢測(cè)，檢測(cè)值與醫(yī)院檢測(cè)值比較分析，繪制散點(diǎn)圖(如圖12)，得到回歸方程：y＝1.3007x-307.17，r²＝0.9338，p＞0.05說(shuō)明兩組檢測(cè)值具有良好的線性相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著差異。

綜上所述，本發(fā)明ab1/hrp-ab5配對(duì)抗體的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢測(cè)范圍為(300-9600pg/ml)，abnova雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線線性檢測(cè)范圍31pg/ml～300pg/ml。abnova試劑盒檢測(cè)下限(31pg/ml)低于本發(fā)明檢測(cè)試劑盒檢測(cè)下限(300pg/ml)，而本發(fā)明配對(duì)抗體具有較廣的線性檢測(cè)范圍。根據(jù)2011年第三屆全國(guó)心力衰竭會(huì)議發(fā)布《nt-probnp臨床應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》：nt-probnp作為心衰檢測(cè)特異性指標(biāo)物，nt-probnp含量低于300pg/ml時(shí)基本排除心衰可能性，如高于相應(yīng)年齡層次的截點(diǎn)(＜50歲，50歲～75歲，＞75歲者分別是450，900和1800pg/ml)，則該患者急性心衰的可能性很大。由此可知，nt-probnp的臨床診斷值隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生變化，分別是450pg/ml、900pg/ml、1800pg/ml。本發(fā)明配對(duì)抗體檢測(cè)范圍包含所有cutoff值，血液樣本無(wú)需稀釋或稍加稀釋即可準(zhǔn)確測(cè)定，而使用abnova試劑盒則需將血樣經(jīng)過(guò)多次稀釋倍數(shù)嘗試，使終濃度在檢測(cè)范圍內(nèi)，進(jìn)而換算出樣本原濃度。基于以上考慮，本發(fā)明配對(duì)抗體更加便捷、準(zhǔn)確，具有更好的科研價(jià)值和推廣應(yīng)用的商業(yè)價(jià)值。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>暨南大學(xué)

<120>一種檢測(cè)n端腦鈉肽前體的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株和應(yīng)用

<130>

<160>8

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