一種氨基末端b型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型提供了一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，包括硝酸纖維素NC膜，膠體金墊、樣品墊和吸水紙，所述膠體金墊上含有NT-proBNP標(biāo)記抗體以及兔IgG標(biāo)記抗體，所述硝酸纖維素NC膜在沿液體層析方向上依次包被有檢測(cè)線、參比線以及質(zhì)控線，本實(shí)用新型通過參比線的設(shè)置以及對(duì)劃線抗體含量的精確控制，實(shí)現(xiàn)對(duì)NT-proBNP濃度在300ng/L～900ng/L這一區(qū)域的血清樣品進(jìn)行半定量檢測(cè)。
【專利說明】一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明創(chuàng)造屬于人氨基末端B型利鈉肽前體檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種采用膠體金免疫層析法對(duì)人氨基末端B型利鈉肽前體進(jìn)行半定量檢測(cè)的試紙。

【背景技術(shù)】
[0002]氨基末端B型利鈉肽前體(ΝΤ-ρι.οΒΝΡ)是由心室分泌的一種激素類多肽。是由心肌細(xì)胞合成的具有生物學(xué)活性的天然激素，主要在心室表達(dá)，同時(shí)也存在于腦組織中。當(dāng)心室功能不全時(shí)，由于心肌擴(kuò)張而快速合成釋放入血，有助于調(diào)節(jié)心臟功能。心肌細(xì)胞所分泌的BNP先以108個(gè)氨基酸組成的前體形式存在，當(dāng)心肌細(xì)胞受到刺激時(shí)，在活化酶的作用下裂解為由76個(gè)氨基酸組成的無活性的直線多肽和32個(gè)氨基酸組成的活性環(huán)狀多肽，釋放入血循環(huán)，分別被稱為NT-proBNP和BNP。
[0003]BNP和NT-proBNP檢測(cè)在本世紀(jì)初先后進(jìn)入我國，十年來已經(jīng)為各級(jí)醫(yī)院和醫(yī)師廣泛用于臨床實(shí)踐，成為心血管病尤其是心力衰竭診斷十分有用的生物標(biāo)志物。我國2007年《慢性心力衰竭診斷治療指南》和2010年《急性性心力衰竭診斷治療指南》也推薦將NT-proBNP和BNP用于心衰的診斷和預(yù)后判斷。
[0004]目前臨床上用于NT-proBNP測(cè)定的方法有多種。其中，國內(nèi)電化學(xué)發(fā)光法采用Roche公司的Elecsys2010電化學(xué)全自動(dòng)免疫分析儀和相應(yīng)試劑盒。與其它測(cè)定方法相比，其檢測(cè)線性范圍更寬，精密度更好，測(cè)定結(jié)果在各種不同的溫度下都有良好的穩(wěn)定性，可以適合臨床不同的需求。缺點(diǎn)是試劑一般只能配合專門儀器來使用，費(fèi)用較高，不利于基層醫(yī)院開展此項(xiàng)檢測(cè)。
[0005]免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測(cè)方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診測(cè)方式的一個(gè)重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測(cè)技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(cè)(POCT)中的到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測(cè)。免疫膠體金技術(shù)與ELISA技術(shù)同屬于免疫學(xué)診斷方法，均是依賴于抗原與抗體的特異性反應(yīng)，但不需要專門的儀器設(shè)備，更適于現(xiàn)場(chǎng)及床旁快速檢測(cè)。
[0006]由于床旁檢測(cè)(Point of Care testing，P0CT)測(cè)定NT-proBNP可以方便快速地提供可靠的檢驗(yàn)結(jié)果，幫助預(yù)測(cè)心衰，進(jìn)而使醫(yī)生更早制訂治療策略并節(jié)省治療費(fèi)用；將其作為中心實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)展，也能夠增加檢測(cè)能力并減輕實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員的壓力，管理人員也能更合理地使用資源。研宄表明就診時(shí)測(cè)定NT-proBNP濃度低于300ng/L，則該患者急性心衰的可能性很小(“排除”截點(diǎn))；患者年齡介于50?75歲時(shí)，測(cè)定ΝΤ-ρι.οΒΝΡ濃度高于900ng/L，則該患者急性心衰的可能很大(“診斷”截點(diǎn))。如檢測(cè)值介于上述兩截點(diǎn)之間(“灰區(qū)”)，可能是程度較輕的急性心衰，或是非急性心衰原因所致的ΝΤ-ρι.οΒΝΡ輕增高，(如心肌缺血、房顫、肺部感染、肺癌、肺動(dòng)脈高壓或肺栓塞等)，此時(shí)應(yīng)結(jié)合其它檢查結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的鑒別診斷。
[0007]目前雖然有一些試劑廠商開發(fā)出了檢測(cè)下限為10pg/mL，但是都需要配合大型儀器才能進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且價(jià)格昂貴。且市場(chǎng)上專門針對(duì)300ng/L?900ng/L這一臨界范圍的快速檢測(cè)產(chǎn)品尚屬空白。因此急需一種能夠?qū)ρ逯笑?ρι.οΒΝΡ進(jìn)行半定量檢測(cè)的膠體金試紙，提供斷病依據(jù)，以幫助醫(yī)務(wù)工作人員及時(shí)準(zhǔn)確的掌握患者病情，降低醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)和成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明創(chuàng)造提供一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，能夠高效快速、并且準(zhǔn)確半定量地對(duì)NT-proBNP進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明創(chuàng)造采用的技術(shù)方案是，包括硝酸纖維素NC膜，在所述硝酸纖維素NC膜一端依次向上搭接有膠體金墊、樣品墊，在所述硝酸纖維素NC膜另一端向上搭接有吸水紙，所述膠體金墊上含有NT-proBNP標(biāo)記抗體以及兔IgG標(biāo)記抗體，所述硝酸纖維素NC膜在沿液體層析方向上依次包被有檢測(cè)線(T線)、參比線(R線)以及質(zhì)控線(C線)，所述檢測(cè)線為與所述NT-proBNP標(biāo)記抗體配對(duì)的NT-proBNP抗體，所述參比線為羊抗兔二抗，所述質(zhì)控線為羊抗鼠二抗。
[0010]其中，所述NT-proBNP標(biāo)記抗體為膠體金標(biāo)記的鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，檢測(cè)線上與其配對(duì)的NT-proBNP抗體也為鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，二者分別識(shí)別NT-proBNP不同的表位，所述兔IgG標(biāo)記抗體為膠體金標(biāo)記的兔IgG抗體。
[0011]其中，所述膠體金的顆粒大小為15-25nm，優(yōu)選為20_22nm。
[0012]其中，所述膠體金墊是將540nm處OD值為1.2-1.4的NT-proBNP標(biāo)記抗體溶液以及540nm處OD值為0.8-1.0的兔IgG標(biāo)記抗體溶液以體積比1: 1.2混合后，以2.5 μ I/mm的量點(diǎn)樣而成。
[0013]其中，所述硝酸纖維素NC膜中，檢測(cè)線由1.5mg/ml的NT-proBNP標(biāo)記抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成；參比線由0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成；所述質(zhì)控線由2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成。
[0014]進(jìn)一步，所述檢測(cè)線(T線)、參比線(R線)以及質(zhì)控線(C線)間的間隔為0.4cm;所述膠體金墊距T線間的間隔為0.2-1.0cm，優(yōu)選為0.4-0.6cm。
[0015]其中，所述硝酸纖維素NC膜為孔徑8-12 μ m的多孔樣結(jié)構(gòu)膜，所述樣品墊為玻璃纖維膜或無紡布，所述膠體金墊采用玻璃纖維膜，所述吸水紙為吸水濾紙，以上材料均為常用材料，可市購。
[0016]本發(fā)明創(chuàng)造具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:操作方便、反應(yīng)靈敏、敏感性高，便于攜帶和保存，適用于醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。并且，本發(fā)明通過參比線的獨(dú)立設(shè)置以及對(duì)各劃線抗體種類和含量等的精確控制，實(shí)現(xiàn)對(duì)NT-proBNP濃度在300ng/L?900ng/L這一區(qū)域的血清樣品進(jìn)行半定量檢測(cè)，為醫(yī)護(hù)人員對(duì)心衰等相關(guān)疾病進(jìn)行判斷提供有力的參考依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明創(chuàng)造結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖2是本發(fā)明創(chuàng)造使用結(jié)果判定示意圖。
[0019]其中:
[0020]1-樣品墊；2_膠體金墊；3_硝酸纖維素NC膜；4-T線；5_R線；6_C線-J-吸水紙。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造進(jìn)行進(jìn)一步說明，下述詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程僅為闡述本發(fā)明創(chuàng)造方案的目的，并非用于限定本發(fā)明創(chuàng)造。
[0022]下述實(shí)施例中，未特殊說明的材料或試劑，通常為商用可市購產(chǎn)品，或可經(jīng)由相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)從公開的途徑獲得。下述實(shí)施例中未注明具體條件和參數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和參數(shù)，或按照制造廠商所建議的條件和參數(shù)。
[0023]實(shí)施例1膠體金的制備
[0024]將0.02%氯金酸溶液加熱煮沸，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ;溶液顏色由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)，繼續(xù)加入出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸1min ;出現(xiàn)透明的酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫，獲得粒徑在20nm左右的膠體金溶液。電鏡鏡檢，確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。
[0025]實(shí)施例2含標(biāo)記抗體的膠體金墊的制備
[0026]取1.5mL試管，加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為7.4 ;加入15 μ g/mL NT-proBNP標(biāo)記抗體，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ;加入10 μ L的10% BSA，混勾，振蕩20min ;于離心機(jī)中8000rpm，離心20min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為1.2-1.4的膠體金免疫復(fù)合物；
[0027]另取1.5mL試管，加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為9.0 ;加入10 μ g/mL兔IgG標(biāo)記抗體，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勾，于振蕩儀上快速振蕩20min ;加入10 μ L的10% BSA,混勾，振蕩20min ;于離心機(jī)中8000rpm,離心20min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為0.8-1.0的膠體金免疫復(fù)合物；
[0028]將上述兩種膠體金免疫復(fù)合物按照體積比1: 1.2的比例混合，以2.5 μ 1/mm的量在玻璃纖維膜上點(diǎn)樣，形成膠體金墊，并在適宜的條件下干燥，一般為37°C干燥12小時(shí)。
[0029]實(shí)施例3硝酸纖維素NC膜的包被
[0030]采用噴膜儀，將1.5mg/ml的NT-proBNP標(biāo)記抗體以0.001ml/cm均勾劃在硝酸纖維素NC膜上形成T線；將0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃在硝酸纖維素NC膜上形成R線；將2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗體以0.001ml/cm均勻劃在硝酸纖維素NC膜上形成C線，且三條線之間的間隔為0.4cm。然后放入干燥間在適宜的溫度和濕度下干燥。
[0031]實(shí)施例4檢測(cè)試紙的組裝
[0032]在條件適宜的干燥室內(nèi)，將實(shí)施例2獲得的膠體金墊和實(shí)施例3獲得的包被完成的硝酸纖維素NC膜以及樣品墊和吸水紙裁剪成合適的大小，按照?qǐng)D1所示的結(jié)構(gòu)進(jìn)行粘接，控制膠體金墊距T線間的間隔為0.4-0.6cm，該間隔可以通過控制包被NC膜的劃線位置、調(diào)整裁剪尺寸以及粘接部分大小來實(shí)現(xiàn)，膠體金墊與NC膜的粘接部分不小于膠體金墊的1/7，膠體金墊與樣品墊的粘接部分為膠體金墊的1/7?1/2，吸水紙與NC膜的粘接部分不小于吸水紙的1/10。上述相互粘接的各部分可預(yù)先或粘接后固定于一個(gè)承載板上，所述承載板可以為塑料板。固定完成后將其裁剪至合適的大小即可。所述檢測(cè)試紙還可以進(jìn)而裝入一塑盒中，并在塑料盒上對(duì)應(yīng)樣品墊和硝酸纖維素NC膜劃線部分設(shè)置開口，方便攜帶和保存。
[0033]實(shí)施例5檢測(cè)原理和方法
[0034]本發(fā)明創(chuàng)造中利用了免疫層析檢測(cè)法中雙抗體夾心顯色的原理，當(dāng)待測(cè)血清中含有一定濃度的NT-proBNP時(shí)，將其加入樣品墊后，樣品中的液體溶解膠體金墊中鼠源NT-proBNP單克隆抗體，并且NT-proBNP與該膠體金標(biāo)記的鼠源NT-proBNP單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-膠體金復(fù)合物，并繼續(xù)靠毛細(xì)作用向檢測(cè)線移動(dòng)。當(dāng)樣品到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，上述抗原-抗體-膠體金復(fù)合物與包被在檢測(cè)線上的配對(duì)的NT-proBNP抗體進(jìn)一步結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體-膠體金雙抗體夾心復(fù)合物，并在檢測(cè)線上聚集顯色。隨著毛細(xì)作用的進(jìn)一步向前，到達(dá)質(zhì)控線時(shí)，由于膠體金墊中NT-proBNP單克隆抗體是鼠源性的，因此無論待測(cè)血清中是否含有ΝΤ-ρι.οΒΝΡ，均被固定于質(zhì)控線的羊抗鼠二抗所捕獲并顯色，這種顯色即保證了整個(gè)反應(yīng)體系是正確的。同時(shí)，本發(fā)明創(chuàng)造為了半定量的目的，在膠體金墊中還加入了膠體金標(biāo)記的兔源IgG抗體，并在檢測(cè)線與質(zhì)控線間設(shè)置能與其發(fā)生特異性反應(yīng)的羊抗兔二抗參比線，無論待測(cè)血清中有無NT-proBNP，都會(huì)在經(jīng)過膠體金墊時(shí)帶動(dòng)兔IgG標(biāo)記抗體向前涌動(dòng)，并在參比線位置發(fā)生顯色反應(yīng)，且其顯色水平被設(shè)置為相當(dāng)于NT-proBNP濃度在900ng/L時(shí)的顯色水平，這樣，就能很方便的通過直觀的觀察來獲得待測(cè)血清中ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的濃度信息。由于兔IgG抗體具有易獲得、穩(wěn)定期長、特異性好、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，在發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)能夠穩(wěn)定地發(fā)揮特定濃度下的顯色水平，且不會(huì)對(duì)其他特異性反應(yīng)產(chǎn)生干擾，因此成為本發(fā)明創(chuàng)造作為顯色參比物的最佳選擇。
[0035]檢測(cè)時(shí)，將提取的血清樣本平衡至室溫，在樣品墊上滴入被檢樣本，1min后觀察T線、R線、C線的顯色情況。C線顯色，T線與R線出線顏色相同，表明樣本中NT-proBNP等于900ng/L(見附圖2a) ；C線顯色，T線出線顏色弱于R線出線顏色，表明樣本中的NT-proBNP水平在300-900ng/L之間(見附圖2b) ;C線顯色，T線出線顏色強(qiáng)于R線出線顏色，表明樣本中的NT-proBNP大于900ng/L(見附圖2c) ;C線、R線顯色，T線不顯色，表明樣本中的NT-proBNP水平小于300ng/L(見附圖2d) ;C線或R線不顯色(見附圖2e、2f、2g)，表明實(shí)驗(yàn)失敗，需重新測(cè)試。
【權(quán)利要求】
1.一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，包括硝酸纖維素NC膜，在所述硝酸纖維素NC膜一端依次向上搭接有膠體金墊、樣品墊，在所述硝酸纖維素NC膜另一端向上搭接有吸水紙，所述膠體金墊上含有NT-proBNP標(biāo)記抗體以及兔IgG標(biāo)記抗體，所述硝酸纖維素NC膜在沿液體層析方向上依次包被有檢測(cè)線、參比線以及質(zhì)控線，所述檢測(cè)線為與所述NT-proBNP標(biāo)記抗體配對(duì)的NT-proBNP抗體，所述參比線為羊抗兔二抗，所述質(zhì)控線為羊抗鼠二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，其特征在于:所述NT-proBNP標(biāo)記抗體為膠體金標(biāo)記的鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，檢測(cè)線上與其配對(duì)的NT-proBNP抗體也為鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，二者分別識(shí)別NT-proBNP不同的表位，所述兔IgG標(biāo)記抗體為膠體金標(biāo)記的兔IgG抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，其特征在于:所述膠體金的顆粒大小為15-25nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，其特征在于:所述膠體金墊是將540nm處OD值為1.2-1.4的NT-proBNP標(biāo)記抗體溶液以及540nm處OD值為0.8-1.0的兔IgG標(biāo)記抗體溶液以體積比1: 1.2混合后，以2.5 μ 1/mm的量點(diǎn)樣而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，其特征在于:所述硝酸纖維素NC膜中，檢測(cè)線由1.5mg/ml的NT-pix)BNP標(biāo)記抗體以0.0Olml/cm均勾劃線而成；參比線由0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成；所述質(zhì)控線由2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測(cè)試紙，其特征在于:所述檢測(cè)線、參比線以及質(zhì)控線間的間隔為0.4cm ;所述膠體金墊距檢測(cè)線間的間隔為 0.2-1.0cm0
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK204188623SQ201420672841
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】岳曉燕, 魏金枝, 林濤 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司