專利名稱：氨基末端腦鈉肽的b細(xì)胞表位肽段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及心力衰竭的診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure, HF)作為嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病中的一種病理綜合癥，已不再被簡單地看作是獨立臨床疾病，而是作為心血管疾病發(fā)展到后期的一個階段，即從始發(fā)危險因子(高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病)到左心室肥大、心肌細(xì)胞功能紊亂、冠心病、最后發(fā)展成為心力衰竭。有學(xué)者統(tǒng)計，心力衰竭患者一旦出現(xiàn)典型癥狀，5年存活率男性為25%，女性為38%，與惡性腫瘤病人相仿。2003年，中國心血管健康多中心合作研究組應(yīng)用四階段整群隨機抽樣方法，在中國10省市抽樣調(diào)查，結(jié)果顯示心衰患病率為O. 9%，隨著年齡增高，心衰患病率顯著上升。由于我國冠心病和高血壓發(fā)病仍呈上升趨勢，人口老齡化趨勢明顯， HF正成為我國心血管領(lǐng)域的重要公共衛(wèi)生問題。在發(fā)達(dá)國家，約有7%的人群患有此病，目前也僅有2%的人被及時確診。心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿和最主要的死亡原因之一，呼吸困難是充血性心力衰竭(CHF)的主要癥狀，又是某些肺部疾病的主要臨床表現(xiàn)，相互間鑒別比較困難，而在急診工作中須在短時間內(nèi)對呼吸困難做出正確診斷，因此，尋找一種敏感、快捷、準(zhǔn)確的鑒別診斷方法對于急診科醫(yī)生來說是非常重要的，可以在很大程度上方便急診科醫(yī)生提高診斷的敏感性和特異性，并幫助判斷病情的嚴(yán)重程度?；蛘咴谏形闯霈F(xiàn)明顯“充血性”癥狀之前就著手干預(yù)治療，從根本上防治HF，延緩HF發(fā)展進程，提高患者的遠(yuǎn)期存活率。從這個意義上來看，心力衰竭的早期診斷和治療監(jiān)測非常重要。然而，無論是在住院病人還是門診病人，臨床上用常規(guī)方法不但對HF的診斷方面存在困難，而且在分析治療的結(jié)果時也不確定。如傳統(tǒng)的心電圖、超聲心動圖等檢查方式，特異性和及時性都不夠，而且傳統(tǒng)的檢查方式均不能對心肌損傷的長期影響進行評估，難以及時方便地指導(dǎo)患者的治療。1988年日本學(xué)者Sudoh T等從豬腦內(nèi)首次分離出一種與心房鈉尿肽(Atrialnatriuretic peptide, ANP)功能相似的物質(zhì)，即具有擴張血管、拮抗腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)、抑制交感神經(jīng)活性和促進尿鈉排泄作用，雖然這一物質(zhì)與ANP的分子結(jié)構(gòu)相似，但其氨基酸組成和組織學(xué)分布存在差異，故將其命名為腦鈉尿肽(Brain natriureticpeptide, BNP) 0目前，大量的研究已明確BNP是從其氨基酸前體蛋白(ρι·0-ΒΝΡ)中的羧基端裂解而來，是由心室細(xì)胞合成并分泌進入血液的32個氨基酸多肽，裂解同時產(chǎn)生76個氨基酸的無生物學(xué)活性的氨基末端腦鈉肽(ΝΤ-ρι·οΒΝΡ)，二者來源相同并且等摩爾分泌。通過組織生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，牽拉刺激、激素(如兒茶酚胺、血管緊張素、內(nèi)皮素)分泌以及缺氧均能導(dǎo)致心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞分泌proBNP。從理論上講，無論是檢測BNP還是NT-proBNP,都可以反映體內(nèi)心肌細(xì)胞受到的容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷的大小，均能夠單獨地預(yù)示左心室(LV)舒張末期壓力增高的狀況，能應(yīng)用于充血性心力衰竭等相關(guān)疾病的鑒別診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估。ΒΝΡ、ΝΤ-ρι·οΒΝΡ檢測與肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白不同，后三者是由于心臟損傷而釋放的標(biāo)志物，而血漿ΝΤ-ρι·οΒΝΡ水平在心臟功能代償階段即可明顯升高，有利于更早發(fā)現(xiàn)心功能的異常。研究發(fā)現(xiàn)，BNP具有分子內(nèi)的二硫鍵并且作為一種分析物不很穩(wěn)定，其原因是由于BNP作為激素發(fā)揮生理功能，因而必須被迅速分解滅活。因此，它作為一種診斷標(biāo)記的應(yīng)用僅僅是有限的。而且BNP在血漿中含量較低，僅為7ng/L，而NT-pix)BNP的血漿含量平均值為41ng/L，后者對于區(qū)分健康個體和患有心力衰竭的患者，以及根據(jù)心力衰竭的嚴(yán)重程度對患者樣本進行分級所需要的檢測低限是足夠的，可保證自動化實驗室的樣品常規(guī)測試得以實施。另外，NT-proBNP在血漿中的半衰期為120分鐘，BNP的半衰期為22分鐘，提示NT-proBNP更易進行免疫定量分析。目前認(rèn)為，NT-proBNP成為檢測HF的標(biāo)準(zhǔn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面①診斷癥狀性心力衰竭，用于急性呼吸困難的鑒別診斷；②診斷無癥狀性左室功能障礙，早期發(fā)現(xiàn)心衰病人判斷心衰病人的危險分層，以判斷是該入院還是出院檢驗心力衰竭的治療·評估心力衰竭病人的預(yù)后評估急性冠脈綜合征(ACS);⑦篩選慢性心衰高危人群；⑧作為猝死的標(biāo)志物診斷舒張功能不全。羅氏診斷試劑公司(Roche Diagnostics, Inc)在美國和歐洲16個醫(yī)學(xué)中心對2000多位健康和病患男女進行的臨床研究，此項研究顯示充血性心力衰竭癥狀的嚴(yán)重性與NT-proBNP的水平有關(guān)。2002年，國際上已經(jīng)公認(rèn)NT-proBNP是測定心衰的一個劃時代的具有特異性的標(biāo)志物。早期實驗的研究對象多是急診室呼吸困難、肺心病、心臟病患者，顯示ΝΤ-ρι·οΒΝΡ與心衰具有很好的相關(guān)性，陽性預(yù)測值達(dá)到90% -95%，其陰性預(yù)測能力更具有價值。當(dāng)急性心力衰竭出現(xiàn)左室充盈壓增加的臨床綜合征以及如缺血、肺栓塞等任何導(dǎo)致肌細(xì)胞伸展的情形，檢測ΝΤ-ρι·οΒΝΡ非常有益，同時對于鑒別呼吸困難是否為心源性原因具有重要意義，優(yōu)于臨床判斷。另外，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ還能輔助判斷進展期心衰患者的預(yù)后，以及對左心室功能不全的治療進行監(jiān)測和指導(dǎo)。目前，基于NT-proBNP的心力衰竭試劑盒，僅有羅氏公司持有。靈敏度更高或成本更低的相關(guān)試劑盒急需開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供氨基末端腦鈉肽B細(xì)胞表位肽段，其能作為氨基末端腦鈉肽單克隆抗體的抗原。為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為氨基末端腦鈉肽B細(xì)胞表位肽段，所述氨基末端腦鈉肽B細(xì)胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示。上述氨基酸序列是通過如下手段獲取的從NCBI Protein數(shù)據(jù)庫中獲取如SEQ ID NO :5所示的氨基末端腦鈉肽蛋白序列；分別對氨基末端腦鈉肽的蛋白的二級結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、可及性、柔韌性以及可能的糖基化位點，對各區(qū)段進行分析評分，選取得分高的區(qū)域作為B細(xì)胞表位區(qū)域，其序列如SEQ ID NO4 或 SEQ ID N0:5 所示。所述的B細(xì)胞表位肽段化學(xué)合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其與BSA的交聯(lián)能力，接著與BSA或KLH交聯(lián)。將所述的B細(xì)胞表位肽段與載體蛋白BSA或KLH交聯(lián)之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強免疫性。本發(fā)明的目的之二在于提供一種雜交瘤細(xì)胞，其能特異性的分泌氨基末端腦鈉肽的單克隆抗體。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞的制備是通過所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段與BSA或KLH交聯(lián)后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾細(xì)胞懸液并制備SP2/0細(xì)胞懸液(脾臟B淋巴細(xì)胞)，并與骨髓瘤細(xì)胞和融合，將融合細(xì)胞選擇性培養(yǎng)，通過ELISA篩選后得到的雜交瘤細(xì)胞。將篩選出的最強陽性細(xì)胞進行克隆化培養(yǎng)，同時在克隆化培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞中篩選出最強陽性化的雜交瘤細(xì)胞送于并送中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏號為CCTCC NO C201288,其可穩(wěn)定分泌所述單克隆抗體。本發(fā)明的目的之三在于提供所述一種特異性抗體，其可作為檢測氨基末端腦鈉肽抗原的試劑。同時，還提供含有上述抗體的試劑盒，該試劑盒可用于心力衰竭的診斷。所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段制備的特異性抗體。所述特異性抗體為所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。作為優(yōu)選的，所述雜交瘤細(xì)胞的生物保藏編號為CCTCC N0:C201288?；谠\斷心力衰竭的雙抗夾心ELISA試劑盒，由緩沖液、單克隆抗體、洗滌液、酶標(biāo)抗體、TMB底物、終止液組成，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCC NO C201288的雜交瘤分泌，所述酶標(biāo)抗體為被辣根過氧化物酶標(biāo)記的心力衰竭重組蛋白。本發(fā)明的目的之四在于提供三種新應(yīng)用，該應(yīng)用為心力衰竭的診斷提供了新的思路。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段在制備心力衰竭的診斷試劑中的應(yīng)用。所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽為免疫原性多肽，其可被B細(xì)胞抗原受體(BCR)識別并結(jié)合，或與氨基末端腦鈉肽抗原的抗體特異性識別并相互結(jié)合；所以，所述B細(xì)胞表位肽段可以制備成診斷試劑，用于檢測標(biāo)本中的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ抗原的特異性抗體含量，進一步判斷是否為心力衰竭患者提供指標(biāo)參數(shù)，同時對于鑒別呼吸困難是否為心源性原因具有重要意義，優(yōu)于臨床判斷。另外，為輔助判斷進展期心衰患者的預(yù)后，以及對左心室功能不全的治療進行監(jiān)測和指導(dǎo)提供檢測基礎(chǔ)。人氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體在制備心力衰竭的診斷試劑中的應(yīng)用?；蛉甩?ρι·οΒΝΡ的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體的免疫復(fù)合物在制備心力衰竭的診斷試劑中的應(yīng)用。所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體或氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體的免疫復(fù)合物，可用于免疫原及篩選原的檢測，或建立氨基末端腦鈉肽定量檢測。當(dāng)氨基末端腦鈉肽的含量超過正常人的標(biāo)準(zhǔn)，氨基末端腦鈉肽的含量可作為判定心力衰竭的判定輔助參數(shù)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明制備的氨基末端腦鈉肽是高純度的氨基末端腦鈉肽單體重組蛋白，該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時可以作為建立氨基末端腦鈉肽定量檢測時的校準(zhǔn)品。通過氨基末端腦鈉肽蛋白序列的B細(xì)胞表位肽段免疫小鼠制備的單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測純度> 96% )、效價高(ELISA效價達(dá)I 512000)、特異性好、可大批量制備等優(yōu)點。氨基末端腦鈉肽蛋白中B細(xì)胞表位肽段化學(xué)合成時在其N端引入半胱氨酸，提高了其與KLH或BSA交聯(lián)率(> 50% )，可獲得優(yōu)質(zhì)免疫原。通過本發(fā)明制備的單克隆抗體、多克隆抗體可用于患者血漿氨基末端腦鈉肽含量的檢測，如可采用“雙抗體夾心”ELISA反應(yīng)模式，即酶標(biāo)記人抗氨基末端腦鈉肽單抗、酶標(biāo)板包被抗氨基末端腦鈉肽多抗和被測樣品氨基末端腦鈉肽抗原形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)進行測定。


圖I為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，箭頭顯示為目的片段。圖2為Western Blot鑒定NT-proBNP單克隆抗體的有效性，其中Control指對照蛋白；NT-proBNP (左)指上樣量2. 5 μ g ；NT-proBNP (右)指上樣量5 μ g。圖3為Western Blot鑒定NT-proBNP多克隆抗體的有效性，其中NT-proBNP (左)為上樣量10 μ g，NT-proBNP (右)為上樣量5 μ g。
本發(fā)明中雜交瘤細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞株24-NT-proBNP送中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201288，地址位于中國武漢武漢大學(xué)，收到日期為2012年6月20日，存活檢測日期為2012年6月27日，保藏的培養(yǎng)物名稱為小鼠雜交瘤細(xì)胞。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆實驗手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)(沈關(guān)心周汝麟主編)中所述的條件或制造商建議的條件進行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。實施例I重組NT-proBNP基因克隆從GenBank (登錄號 NCBI Reference Sequence NM_002521. 2)獲取人 NT-proBNP編碼基因序列，將其提交于生物在線分析軟件GCUA (Graphical codon usage analyzer,http://guca.schoedl.del)分析評價，并進行密碼子偏嗜性改造優(yōu)化。優(yōu)化方式為把NT-proBNP蛋白在大腸桿菌中表達(dá)活性低于20 %的密碼子同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子(在不進行密碼子置換的情況下，也能實現(xiàn)相同功能)。SEQ ID No :I為從GenBank獲取人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ編碼基因核苷酸序列，下劃線部分為GCUA分析結(jié)果顯示在大腸桿菌中表達(dá)活性低于20%的密碼子。cacccgctgggcagccccggttcagcctcggacttggaaacgtccgggttacaggagcagcgcaaccatttgcagggcaaactgtcggagctRcaRRtRRaRcaRacatccctRRaRcccctccaRRaRaRcccccRtcccacaRRtRtctRRaaRtcccgggag^tagccaccgagggcatccRtRRRcaccRcaaaatRRtcctctacaccctRCRRRcaccacRa經(jīng)過密碼子偏嗜性改造優(yōu)化后的ΝΤ-ρι ΒΝΡ編碼基因核苷酸序列，下劃線部分為經(jīng)過同義置換的密碼子，SEQ ID No 2cacccgctgggcagcccgggtagcgccagcgacctggaaacgagcggcctgcaggagcagcgcaaccatctgcagggcaaactgagcgag
ctgcaggtggagcagaccagcctggagccgctgcaggagagcccgcgtccgaccggtgtctggaagagccgcgaggtggccaccgagggcatccgtggccaccgcaaaatggtcctgtacaccctgcgcgcaccgcgcNT-proBNP蛋白相應(yīng)的氨基酸序列，SEQ ID No 3“His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly LeuGln Glu Gln ArgAsn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr SerLeu Glu Pro Leu Gln Glu SerPro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly lie Arg Gly His Arg Lys MetVal Leu Tyr Thr LeuArgAla Pro Arg，，(谷氨酰胺ginQ ;甘氨酸gly G ;絲氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hr T -M氨酸val V;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L;酪氨酸t(yī)yr Y;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H；脯氨酸pro P ;天冬酰胺asn N ；甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸IysK;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R ;天冬氨酸Asp D)為進行有效表達(dá)及純化，將序列SEQ ID NQ :2的5'-及3'-端分別添加限制性酶切位點Sal I>BamH I,其中BamH I酶切位點后加入-gatgatgatgataag-核苷酸序列，其編碼的-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-氨基酸序列為腸激酶(EK酶)的識別位點。全序列委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行全基因合成。 實施例2重組pET42a-NT_proBNP質(zhì)粒構(gòu)建將pET42a載體與全基因合成序列亞克隆載體(詳見實施例I)經(jīng)Sal I、BamH
I酶切4小時，瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4DNA連接酶4°C過夜連接。將制備好的感受態(tài)DH5a菌200 μ L，冰浴，吸取I μ L連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5a菌，輕拍混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘，加入800 μ L室溫的2 X YT培養(yǎng)液混勻，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)I小時，分別將50 μ L、200 μ L及剩下的全部轉(zhuǎn)化菌涂于3個含卡那霉素抗性的2ΧΥΤ培養(yǎng)板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑去白素菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒，取質(zhì)粒用Sal I、BamH I雙酶切4小時，酶切體系為pET42a-NT-proBNP 質(zhì)粒 DNA 10 μ 1，Sal I I μ I, BamH I I μ L, 10X 緩沖液 K 2 μ L，ddH206 μ L，并取酶切產(chǎn)物10 μ L行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見與設(shè)計值255bp —致的片段(圖 I)。實施例3重組NT-proBNP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化BL21 codon plus (DE3)工程菌，取重組pET42a_NT-proBNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 codon plus(DE3)菌，涂布于含氯霉素抗性與卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，測細(xì)菌OD值達(dá)0. 6 0. 8時加入終濃度為0. 6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時。培養(yǎng)后每克濕菌以10倍體積的PBS緩沖液(pH 7. 3)重懸，混勻后超聲破菌，破菌完全后于4°C 10，OOOrpm離心15min，上清以0. 45 μ m微孔濾膜過濾。分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白可溶性，未誘導(dǎo)的菌液和誘導(dǎo)3. 5小時的菌液分別做陰性和陽性對照，結(jié)果在上清中與陽性對照重組蛋白條帶相對應(yīng)的位置發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，目的蛋白分子量約為9kD，與預(yù)期pET42a-NT-proBNP的表達(dá)產(chǎn)物的分子量值相符,而沉淀無此蛋白條帶,證實重組融合蛋白為可溶性表達(dá)，NT-proBNP表達(dá)產(chǎn)物約占細(xì)菌總蛋白質(zhì)量的22%。實施例4重組NT-proBNP蛋白的純化
轉(zhuǎn)化pET42a-NT-proBNP重組質(zhì)粒的工程細(xì)菌經(jīng)O. 6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后使用 GSTrap F. F.初純化，使用 GSTrap F. F.的結(jié)合緩沖液(20mmol/L sodium phosphate,O. 15M NaCl，pH7. 3)重懸后冰上超聲破菌，4°C高速離心，留上清經(jīng)過濾后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脫液(50mmol/L，Tris-HCl，10mmol/L還原型谷胱甘肽，pH8. O)洗脫，收集洗脫蛋白。將含目的蛋白的洗脫峰用His-結(jié)合緩沖液(20mmol/l, sodiumphosphate, O. 5M NaCl, pH7. 4)按I : 9的體積比稀釋后上HisTrap HP再次純化，His-結(jié)合緩沖液平衡后用His-洗脫緩沖液(20mmol/L sodium phosphate, O. 5M NaCl,0.5M咪唑，pH7. 4)，先體積分?jǐn)?shù)為10%緩沖液洗脫去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，平衡后用100%緩沖液將目的蛋白洗下。再用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50Mm Tris-HCl，pH8.0。將獲得的純化重組蛋白用HiTrap Desalting置換緩沖體系為EK切割緩沖液(50mmol/LTris-HCl，pH8. 0)，按EK酶與蛋白I 1000的質(zhì)量比加入帶有His標(biāo)簽的EK酶，4°C低速搖床(60r/分鐘)切割12小時左右。切割后用His-結(jié)合緩沖液稀釋后HisTrap HP純化，分別收集穿透峰、體積分?jǐn)?shù)為10%緩沖液洗脫和100%緩沖液洗脫的蛋白，17. 5% SDS-PAGE電泳進行鑒定。pET42a-NT-proBNP表達(dá)的融合蛋白是以GST_NT-proBNP形式存在，經(jīng)EK酶 切后得到ΝΤ-ρι·οΒΝΡ目的蛋白。實施例5重組NT-proBNP蛋白的濃度、純度鑒定( 一 ) Lowry法(Folin-酹試劑法)測定NT-proBNP蛋白質(zhì)含量Lowry法測定的試劑盒購于上海美季生物技術(shù)有限公司，試劑A : I) 10克Na2CO3, 2克NaOH和O. 25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6 · 4H20)。溶解于500毫升蒸餾水中；2)0. 5克硫酸銅(CuSO4 · 5H20)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份㈧與I份⑶混合，即為試劑甲。試劑B :在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO4 · 2H20)，25克鑰酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫酸鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至I升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水I倍，使最終的酸濃度為IN左右。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/mL左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0. 9% NaCl溶液。詳見下表
權(quán)利要求
1.氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段，其特征在于所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段，其特征在于所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段偶聯(lián)有載體蛋白BSA或KLH。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段，其特征在于所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段N末端引入半胱氨酸。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的交瘤細(xì)胞，其特征在于所述雜交瘤細(xì)胞的生物保藏編號為CCTCC NO C201288o
6.權(quán)利要求I所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段制備的特異性單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的特異性抗體，其特征在于所述特異性抗體為所述氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求I所述的氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段在制備心力衰竭的診斷試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的特異性抗體及特異性抗體的免疫復(fù)合物在制備心力衰竭的診斷試劑中的應(yīng)用。
10.基于診斷心力衰竭的雙抗夾心ELISA試劑盒，由緩沖液、單克隆抗體、洗滌液、酶標(biāo)抗體、TMB底物、終止液組成，其特征在于所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCC NO C201288的雜交瘤分泌，所述酶標(biāo)抗體為被辣根過氧化物酶標(biāo)記的氨基末端腦鈉肽重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及心力衰竭的診斷技術(shù)，具體為氨基末端腦鈉肽的B細(xì)胞表位肽段，氨基酸序列如SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示，其制備的特異性抗體可用于作為心力衰竭的診斷試劑；本發(fā)明制備的氨基末端腦鈉肽是高純度的氨基末端腦鈉肽單體重組蛋白，該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時可以作為建立氨基末端腦鈉肽定量檢測時的校準(zhǔn)品。通過氨基末端腦鈉肽蛋白序列的B細(xì)胞表位肽段免疫小鼠制備的單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測純度＞96％)、效價高(ELISA效價達(dá)1∶512000)、特異性好、可大批量制備等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/577GK102887943SQ20121031512
公開日2013年1月23日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者黃洪濤, 石延賓, 姚靜, 張憲, 胡偉, 魏勇 申請人:重慶業(yè)為基生物科技有限公司