專利名稱：腦鈉肽(bnp)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種心血管肽類激素——腦鈉肽(BNP)的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，心血管疾病已成為全球公共衛(wèi)生的一大威脅，全球每年死于心血管疾病的人數(shù)高達1700萬，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，處于工作年齡段的人群心臟病發(fā)病率已越來越高。心血管疾病目前比較常見的有心力衰竭、冠心病、風心病、高心病等，而對其中有些疾病的診斷仍缺乏特異性的量化指標。如對冠心病的診斷，長期以來一直缺乏有效的量化生化指標?；颊咴缙诔３霈F(xiàn)呼吸困難，但其癥狀、體征缺乏特異性，與肺部疾病引起的呼吸困難鑒別比較困難，而快速、準確地確定呼吸困難的病因?qū)膊〉挠行е委熡址浅Ｖ匾Ｓ秩鐚π牧λソ叩脑\斷通常亦較難，在早期，如呼吸困難、腿部腫脹及運動后易疲勞等也只是一些非特異的癥狀，常規(guī)的診斷依賴于超聲心動圖，但因費用昂貴而不能普及，應(yīng)用受到限制，且超聲心動圖上出現(xiàn)的異常往往遲于生化指標的改變。因而，尋找一種快速、準確、有效的診斷心血管疾病的特異性指標已成為輒待解決的一大重點。
腦鈉素(BNP)，又名腦利尿肽，最初是1988年由日本學者sodoh從豬腦內(nèi)分離出來的一種心血管肽類激素，屬利鈉多肽家族成員之一。主要在心室肌中合成并分泌，具有擴張血管、拮抗腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、抑制交感神經(jīng)活性、促進尿鈉排泄、減少水鈉潴留等作用。BNP還特異地調(diào)節(jié)心室的收縮功能和壓力負荷，對抗冠狀動脈痙攣及肺動脈高壓，防止心肌纖維化和血管平滑肌細胞增生以及內(nèi)皮細胞纖溶酶原激活物抑制物(PAI)表達。在臨床應(yīng)用中，可用于對心力衰竭(HF)、左心室收縮功能混亂及冠心病等的診斷，這些患者血漿BNP水平明顯上升(正常人外周血中BNP水平很低，僅為pg水平)，且其升高程度與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)。也可用于對眾多疾病預(yù)后的評估，諸如心力衰竭(HF)、急性心肌梗死(AMI)、原發(fā)性肺源性高血壓、肺栓塞，甚至是普通人群的預(yù)后評估，其BNP水平越高，其預(yù)后就越差，其病死率亦越高。也有助于某些疾病的鑒別診斷，如對肺源性和心源性急性呼吸困難的鑒別，前者BNP濃度正常，而后者則明顯升高。還可用于對心衰，尤急性心衰的治療，因為BNP可協(xié)調(diào)動靜脈的擴張，增加每搏輸出量，在不改變心率的情況下增加心輸出量；因左室收縮功能紊亂而導(dǎo)致的心衰患者，使用BNP治療，可降低肺毛細血管楔壓；并降低醛固酮和兒茶酚胺的水平，進而利尿利鈉。鑒于它的明顯療效，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)早在2001年就批準BNP為治療急性失代償性心衰患者的臨床用藥。
尿鈉肽由三種肽組成心鈉肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、腦鈉肽(brainnatriuretic peptide，BNP)和C-型尿鈉肽(c-type natriuretic peptide，CNP)，由獨立的基因分別編碼三種激素前體，三者具有其獨特的組織分布和調(diào)節(jié)機制。其中BNP主要在人腦和心室表達。人類BNP前體(Pro-BNP)由108個氨基酸組成，再裂解產(chǎn)生一個成熟的32個氨基酸的成份，即BNP，和一個N末端片段，二者均存在于血漿中。BNP分子量為3500，其氨基端第7位和第23位氨基酸殘基(半骯氨酸)通過二硫鍵形成一個環(huán)型結(jié)構(gòu)，此即為BNP的功能域。BNP通過此構(gòu)象與其相應(yīng)的受體結(jié)合，在諸多病理生理過程中發(fā)揮作用。同心鈉肽相比，腦鈉肽在體內(nèi)作用時間更長，藥效更好，在生物組織中含量更高，且易于提取，因而具有潛在的市場價值和廣泛的應(yīng)用前景。
為了克服傳統(tǒng)提取BNP方法成本高、收率低，目的蛋白容易變性，材料來源有限等諸多缺陷，本發(fā)明為BNP的大規(guī)模制備提供了切實可行的技術(shù)路線。按本法制成的BNP主要用于制備診斷試劑盒供臨床疾病診斷之用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明腦鈉肽(BNP)的制備方法包括以下步驟(1)采用PCR技術(shù)將表達BNP的目的基因擴增，并純化其產(chǎn)物；(2)將純化的PCR產(chǎn)物于BamH I與Hind III雙酶切后定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pet32a，獲得重組質(zhì)粒Pet32a+BNP；(3)將重組質(zhì)粒Pet32a+BNP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，經(jīng)培養(yǎng)擴增，抽提純化，測序分析，獲測序正確的重組質(zhì)粒；(4)將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21DE30菌，在30℃，0.1mM IPTG條件下表達重組蛋白；(5)將表達重組蛋白的活化菌株接種到2-YT培養(yǎng)基恒溫振蕩培養(yǎng)，進行搖瓶實驗，工程菌在發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，種子菌按5％比例接種，在低溶氧條件下誘導(dǎo)，放罐，離心得菌體；(6)將離心得到的菌體沉淀進行細胞裂解，洗滌出包涵體，溶解包涵體，His柱過柱純化。
使用上述本發(fā)明方法獲得的腦鈉肽(BNP)可作為抗原制成診斷試劑盒，應(yīng)用于心血管疾病的特異性診斷。
具體實施例方式
結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例技術(shù)路線如下1、BNP目的基因擴增，重組質(zhì)粒構(gòu)建及重組蛋白的表達BNP目的基因序列依據(jù)美國國立衛(wèi)生圖書館的基因庫。
用PCR技術(shù)將表達BNP的目的基因擴增，并純化其產(chǎn)物。再將純化的PCR產(chǎn)物予BamH I與Hind III雙酶切后定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pet32a，獲得重組質(zhì)粒。然后將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)培養(yǎng)擴增，抽提純化，并用全自動測序儀進行序列分析。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21DE3菌，在30℃，0.1mM IPTG的條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)后裂解菌液，用SDS-PAGE分離各蛋白條帶，并用Western Blot儀檢測。
2、表達菌株的發(fā)酵將活化的菌株按5％的接種量接入到2-YT培養(yǎng)基(含有ampicillin100μg/ml)中，37℃，300r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)，進行搖瓶實驗。工程菌高密度發(fā)酵在B.BROUN(德國)15L發(fā)酵罐中進行。種子菌按5％比例接種，37℃，300r/min，ampicillin100μg/ml。高溶氧培養(yǎng)4小時。在1mmol/L IPTG，低溶氧條件下誘導(dǎo)4小時，放罐，離心得到菌體。
3、BNP的蛋白純化3.1細胞的裂解將離心得到的大腸桿菌沉淀加裂解緩沖液進行細胞裂解，裂解緩沖液50mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、1mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl。
3.2包涵體的洗滌用微量離心機于4℃以12000g將細胞裂解液反復(fù)進行離心沉淀，并用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析沉淀重懸液以確定是否大多數(shù)目的蛋白均在沉淀中。
3.3包涵體的溶解將洗過的沉淀懸浮在含0.1mmol/L PMSF(現(xiàn)加現(xiàn)用)、8mol/L(去離子的)尿素的裂解緩沖液中，在室溫及一定PH值下，再加SDS凝膠加樣緩沖液對其進行溶解，并測其溶解度。
3.4過柱純化His柱收集目標峰，再過反相柱收集目標峰，真空冷凍干燥。SDS-PAGE鑒定蛋白純度。
在制備BNP過程中，用PCR技術(shù)擴增目的基因，以Pet32a作為載體質(zhì)粒，酶切定向插入BNP目的基因后形成重組質(zhì)粒，以大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)作為表達菌株，以His柱作為純化柱子分離純化目的蛋白。這種制備方法既可方便檢測，又可增強重組蛋白的穩(wěn)定性。
運用該發(fā)明技術(shù)獲得的BNP通過免疫學方法制成診斷試劑盒，可快速、準確、特異地診斷和鑒別診斷許多心血管疾病，具有較大的社會效益和經(jīng)濟效益。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.腦鈉肽(BNP)的制備方法，其特征在于以下步驟(1)采用PCR技術(shù)將表達BNP的目的基因擴增，并純化其產(chǎn)物；(2)將純化的PCR產(chǎn)物于BamH I與Hind III雙酶切后定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pet32a，獲得重組質(zhì)粒Pet32a+BNP；(3)將重組質(zhì)粒Pet32a+BNP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，經(jīng)培養(yǎng)擴增，抽提純化，測序分析，獲測序正確的重組質(zhì)粒；(4)將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21DE30菌，在30℃，0.1mM IPTG條件下表達重組蛋白；(5)將表達重組蛋白的活化菌株接種到2-YT培養(yǎng)基恒溫振蕩培養(yǎng)，進行搖瓶實驗，工程菌在發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，種子菌按5％比例接種，在低溶氧條件下誘導(dǎo)，放罐，離心得菌體；(6)將離心得到的菌體沉淀進行細胞裂解，洗滌出包涵體，溶解包涵體，His柱過柱純化。
2.按權(quán)利要求1所述腦鈉肽(BNP)的制備方法，其特征在于一種使用上述方法獲得的腦鈉肽(BNP)作為抗原制備應(yīng)用于心血管疾病的特異性診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦鈉肽(BNP)的制備方法，為克服傳統(tǒng)提取BNP方法成本高、收率低，目的蛋白容易變性，材料來源有限等諸多缺陷，本發(fā)明在制備BNP過程中，用PCR技術(shù)擴增目的基因，以Pet32a作為載體質(zhì)粒，酶切定向插入BNP目的基因后形成重組質(zhì)粒，以大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)作為表達菌株，以His柱作為純化柱子分離純化目的蛋白。這種制備方法既可方便檢測，又可增強重組蛋白的穩(wěn)定性。運用本發(fā)明技術(shù)獲得的BNP通過免疫學方法制成診斷試劑盒，可快速、準確、特異地診斷和鑒別診斷許多心血管疾病。
文檔編號C12N15/16GK1766106SQ20051006078
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者周林福, 陳 峰, 朱海紅, 陳智 申請人:浙江大學