定量檢測(cè)全血中腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)BNP高靈敏定量檢測(cè)的方法，特別公開了一種定量檢測(cè)全血中腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，可實(shí)現(xiàn)全血中BNP的準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腦鈉肽是1988年日本學(xué)者TetsujiSudoh首次從豬腦內(nèi)分離得到一種具有強(qiáng)力的利鈉、利尿、擴(kuò)血管和降壓作用的多肽。大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，血液中BNP水平在心力衰竭時(shí)顯著升高，作為一種新的生物標(biāo)記物，對(duì)心力衰竭的診斷、病程進(jìn)展的監(jiān)測(cè)、對(duì)療效和預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值。
[0003]目前用于臨床檢測(cè)的BNP包括BNP和NT-proBNP兩種。兩者雖有相同生物學(xué)來(lái)源，但生物學(xué)效應(yīng)和臨床意義并不完全相同。心肌細(xì)胞受刺激后，產(chǎn)生初始基因產(chǎn)物前BNP前體，該肽的一個(gè)信號(hào)肽(26個(gè)氨基)被立即去除，形成BNP前體(proBNP，108個(gè)氨基酸)，然后在內(nèi)切酶作用下裂解為無(wú)生物活性的氮末端B型腦鈉肽(NT-proBNP，76個(gè)氨基酸)和有活性的B型腦鈉肽(BNP，32個(gè)氨基酸)ANP的清除主要通過(guò)與清除受體結(jié)合，而NT-proBNP主要由腎小球?yàn)V過(guò)，因此NT-proBNP血濃度受腎功能影響大于BNP。
[0004]BNP和NT-proBNP檢測(cè)已經(jīng)為各醫(yī)院和醫(yī)師廣泛用于臨床實(shí)踐，成為心血管病尤其是心力衰竭診斷十分有用的生物標(biāo)志物。
[0005]測(cè)定BNP的主要方法有化學(xué)發(fā)光法、免疫比濁法、免疫層析法(試紙條)和熒光芯片法等?；瘜W(xué)發(fā)光法和免疫比濁法敏感高、準(zhǔn)確，但需配套昂貴的大型儀器，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并不適合急性診斷和小樣本檢測(cè)。免疫層析法雖簡(jiǎn)便快速，但靈敏度低、重復(fù)性差，易出現(xiàn)誤判。熒光芯片法隨較免疫層析法準(zhǔn)確、靈敏度更高，但由于操作復(fù)雜，組分集成差，重復(fù)性并不尚O
[0006]中國(guó)專利201010139399.3描述了一種納米微球免疫比濁法檢測(cè)腦鈉肽試劑盒，采用納米微球增強(qiáng)常規(guī)比濁法信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦鈉肽進(jìn)行定量分析。
[0007]中國(guó)專利200720140931.7公布了一種腦鈉肽顏色顆粒診斷試紙，采用顏色顆粒對(duì)腦鈉肽進(jìn)行定性檢測(cè)。中國(guó)專利201310524436.6公開了一種同時(shí)檢測(cè)人腦鈉膚和N末端腦鈉膚前體的快速定量檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法，采用膠體金免疫層析法配套相應(yīng)儀器對(duì)試紙條進(jìn)行定量檢測(cè)。美國(guó)專利US60/576327和60/592202也對(duì)膠體金免疫層析檢測(cè)進(jìn)行了論述。但相比于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，吸光度檢測(cè)具有靈敏度低、線性范圍窄、重復(fù)性差等缺陷。
[0008]中國(guó)專利200910077950.3描述了一種檢測(cè)腦鈉膚的光學(xué)生物傳感器及試劑制備方法，采用毛細(xì)溝道，以磁顆粒和量子點(diǎn)分別標(biāo)記抗體，形成雙抗體夾心法檢測(cè)腦鈉肽。雖靈敏度提高了，但試劑組分集成差，操作復(fù)雜，重復(fù)性并不高。
[0009]針對(duì)現(xiàn)有腦鈉肽檢測(cè)方法的不足和缺陷，微流控磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光的優(yōu)勢(shì)，在微流控芯片上集成所有試劑組分，可提供一種腦鈉肽定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，對(duì)BNP進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題為針對(duì)現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光配套儀器昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，提供一種定量檢測(cè)全血中腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片(把除測(cè)試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)全血樣本中BNP的快速、準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。
[0011 ]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0012]—種定量檢測(cè)全血中腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由頂部膠帶(12)、芯片基板(I)和底部膠帶(15)構(gòu)成，其中芯片基板(11)上過(guò)濾區(qū)
(2)、磁顆粒標(biāo)記BNP抗體包被區(qū)(3)、反應(yīng)區(qū)(5)、清洗區(qū)(6)、檢測(cè)區(qū)(7)、液體釋放通道(8)依次連接;芯片基板(11)上標(biāo)記BNP抗體存儲(chǔ)池(4)與反應(yīng)區(qū)(5)連接，檢測(cè)區(qū)(7)分別與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)通過(guò)液體釋放通道(8)連接，頂部膠帶包含加樣口
(13)、發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(14);所述磁顆粒標(biāo)記BNP抗體包被區(qū)(3)預(yù)封裝包被磁顆粒標(biāo)記BNP抗體;標(biāo)記BNP抗體存儲(chǔ)池(4)存儲(chǔ)預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記BNP抗體;清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)分別存儲(chǔ)預(yù)封裝清洗液和發(fā)光基底液;所述微流控芯片測(cè)試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集。
[0013]發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)也可以由發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(17)替代，發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(17)通過(guò)發(fā)光液預(yù)混合通道(18)連接。
[0014]具體地，本發(fā)明所述磁顆粒標(biāo)記BNP抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，其中磁顆粒尺寸和磁鐵的磁感應(yīng)強(qiáng)度對(duì)檢測(cè)結(jié)果有明顯的影響，磁鐵顆粒尺寸為0.1?ΙΟμπι，磁感應(yīng)強(qiáng)度500?30000高斯。
[0015]優(yōu)選地，所述磁顆粒標(biāo)記BNP抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，顆粒尺寸為0.5?3μπι，磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000?8000高斯。
[0016]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的ρΗ7.4硼酸緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐溫-20和Proclin30(^^pH7.4硼酸緩沖液。
[0017]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Procl in300的pH7.4磷酸鹽緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐溫-20、曲拉通X-100和ProcIin300的pH7.4磷酸鹽緩沖液。
[0018]具體地，所述發(fā)光基底液包含與酶對(duì)應(yīng)的底物及發(fā)光增強(qiáng)液，可合并后注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)，或分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B( 17)。
[0019]具體地，所述發(fā)光基底液包含發(fā)光劑對(duì)應(yīng)的雙氧水溶液和堿性溶液，可合并后注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)，或分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B
(17)。
[0020]具體地，本發(fā)明的芯片配套儀器為小型便攜設(shè)備，包含擠壓存儲(chǔ)池，磁鐵移動(dòng)，發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)等功能;芯片檢測(cè)樣本的體積為10?500μ1，優(yōu)選20?ΙΟΟμΙ。更優(yōu)選加樣體積為50μ1ο
[0021]本發(fā)明提供的定量檢測(cè)全血中腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片是一種以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)腦鈉肽快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測(cè)的新方法。
[0022]這種方法是將抗BNP抗體修飾酶，抗BNP抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)樣本中是否含有BNP，并準(zhǔn)確分析其含量。
[0023]本發(fā)明腦鈉肽定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光方法及其微流控芯片能夠解決現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光技術(shù)中儀器昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的不足和缺陷，解決現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度不高、重復(fù)性差的不足和缺陷。由于化學(xué)發(fā)光靈敏度高，其靈敏度是熒光檢測(cè)方法的100倍以上。
[0024]本發(fā)明中所述酶，包含但不限于過(guò)氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，如圖4所示分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(17)，通過(guò)預(yù)混合通道(18)混合