清洗分離、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，從而避免了現(xiàn)有微流控芯片中結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)操作復(fù)雜等不足和缺陷。還克服了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀只能進(jìn)行血清或血漿檢測(cè)，而不能對(duì)全血樣本進(jìn)行檢測(cè)的缺點(diǎn)。
[0053]由于磁顆粒易沉淀，傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀采用手工混合，并以持續(xù)振蕩維持磁顆粒的懸浮狀態(tài)，但微流控芯片內(nèi)磁顆?；炀僮麟y以在小型便攜儀器中實(shí)現(xiàn)。
[0054]本發(fā)明將磁顆粒包被、干燥于微流控芯片溝道中，并設(shè)計(jì)了磁鐵主動(dòng)驅(qū)動(dòng)磁顆粒(而傳統(tǒng)微流控芯片一般采用流體驅(qū)動(dòng)或電驅(qū)動(dòng))，從而使磁顆粒復(fù)溶，并在微流控芯片不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)免疫反應(yīng)、清洗、發(fā)光。此設(shè)計(jì)不僅解決了磁顆粒應(yīng)用于微流控芯片時(shí)易沉淀、重復(fù)性差等問題，還實(shí)現(xiàn)了更可控的免疫反應(yīng)和物理清洗，提高了靈敏度和重復(fù)性。其中磁鐵磁性和磁顆粒尺寸對(duì)檢測(cè)效果了明顯影響，本發(fā)明選擇磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500?30000高斯，優(yōu)選1000-8000高斯;磁顆粒尺寸為0.1?ΙΟμπι，優(yōu)選0.5?3μηι。
[0055]本發(fā)明中微流控芯片配套儀器與微流控芯片無液體接觸，無需要清洗的部件，避免了傳統(tǒng)大型化學(xué)發(fā)光儀需要攪拌或加樣、清洗等操作而產(chǎn)生的交叉干擾及污染。
[0056]所以本發(fā)明并非簡(jiǎn)單疊加磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，而是通過液體密封設(shè)計(jì)、溝道設(shè)計(jì)，把檢測(cè)所需所有化學(xué)組分集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并以磁鐵主動(dòng)驅(qū)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)一鍵式的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)，從而在便攜配套儀器中實(shí)現(xiàn)全血中BNP的快速、高靈敏度、準(zhǔn)確定量檢測(cè)。
[0057]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下:
[0058]I)本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光方法，具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。
[0059]2)本發(fā)明采用磁顆粒技術(shù)，具有磁富集功能，增強(qiáng)并放大信號(hào);并能利用磁鐵把磁顆粒轉(zhuǎn)移區(qū)域(如由包被區(qū)-清洗區(qū)-檢測(cè)區(qū))，減少樣本基質(zhì)的影響。
[0060]3)本發(fā)明采用微流控芯片技術(shù)，把樣本混合、反應(yīng)、分離和檢測(cè)集成在芯片上，并把反應(yīng)所需的所有試劑組分集成到芯片上。
[0061]4)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)，只需加入樣本，蓋上蓋子，把芯片放入小型便攜配套儀器中即可。
[0062]5)本發(fā)明配套儀器是小型便攜儀器，儀器只與芯片發(fā)生物理接觸，芯片內(nèi)液體不與儀器接觸，不會(huì)污染儀器而產(chǎn)生交叉干擾。
【附圖說明】
[0063]圖1為腦鈉肽定量檢測(cè)微流控芯片基板結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為芯片基板，2為過濾區(qū)，3為磁顆粒標(biāo)記BNP抗體包被區(qū)，4為標(biāo)記BNP抗體存儲(chǔ)池，5為反應(yīng)區(qū)，6為清洗區(qū)，7為檢測(cè)區(qū)，8為液體釋放區(qū)，9為清洗液存儲(chǔ)池，10為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池，11為廢液池。
[0064]圖2為腦鈉肽定量檢測(cè)微流控芯片的完整結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為芯片基板，12為頂部膠帶，13為加樣口，14為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔，15為底部膠帶。
[0065]圖3為微流控芯片基板示意圖，其中I為芯片基板，2為過濾區(qū)，3為包被區(qū)，4為標(biāo)記配體存儲(chǔ)池，5為反應(yīng)區(qū)，6為清洗區(qū)，7為檢測(cè)區(qū)，8為液體釋放通道，9為清洗液存儲(chǔ)池，10為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池，11為廢液池。
[0066]圖4為雙發(fā)光基底液存儲(chǔ)池的微流控芯片基板示意圖，其中16為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A，17為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B，18為預(yù)混合通道。
【具體實(shí)施方式】
[0067]本發(fā)明公開了一種定量檢測(cè)全血中腦鈉肽的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0068]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0069]實(shí)施例1:酶促化學(xué)發(fā)光測(cè)定BNP
[0070](— )抗體標(biāo)記
[0071]向磷酸緩沖液中加入適量HRP、1yg EDC和15yg NHS溶液和10?30yg抗BNP單抗溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到HRP標(biāo)記BNP抗體。
[0072]向磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(尺寸為2μπΟ、1yg EDC和15yg NHS溶液和10?30yg抗BNP單抗(與HRP標(biāo)記的抗體不同)溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。磁鐵吸附富集純化，去除未反應(yīng)的抗BNP抗體，得到磁顆粒標(biāo)記BNP抗體。
[0073](二)微流控芯片組裝
[0074]HRP標(biāo)記BNP抗體溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.1 %吐溫20和0.01 %Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液;磁顆粒標(biāo)記BNP抗體溶液為包含0.5 %牛血清白蛋白、0.1 %酪蛋白、
0.2%吐溫20和0.01 %Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液。
[0075]清洗液為包含0.4%BSA、0.3%曲拉通X-100和0.01%Proclin300的ρΗ7.4硼酸緩沖液。發(fā)光基底液分A液和B液，A液為含魯米諾的酸性溶液，B液為含苯衍生物的堿性溶液。
[0076]將HRP標(biāo)抗體溶液放入抗BNP抗體存儲(chǔ)池(4)中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入磁顆粒包被區(qū)(3)中，室溫干燥。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池(9)中，將發(fā)光基底液的A液和B液分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池Α(16)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池Β(17)，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板過濾區(qū)中，將存儲(chǔ)池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0077](三)樣本檢測(cè)
[0078]用正常人血楽作稀釋液，將1^^標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:(^8/1]11、5口8/1]11、5(^8/1]11、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、lOOOng/ml和5000ng/ml。
[0079]將50μ1標(biāo)準(zhǔn)品樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為6000高斯)中，儀器擠出HRP標(biāo)記單抗，并使標(biāo)準(zhǔn)品樣本和HRP標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成HRP標(biāo)記單抗-BNP抗原-磁顆粒標(biāo)記單抗的三明治結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。水泡釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光基底液釋放，儀器檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度?？倷z測(cè)時(shí)間15min。每個(gè)樣本分別用3個(gè)微流控芯片測(cè)定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0080]將50μ1全血樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中BNP濃度。
[0081 ] 檢測(cè)原理為:當(dāng)全血加入微流控芯片后，全血先與HRP標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)，紅細(xì)胞停留在過濾區(qū)上，混合了HRP標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有BNP，則形成HRP標(biāo)記抗體-BNP-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，再發(fā)光基底液作用下發(fā)光，儀器檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)試發(fā)光信號(hào)。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血樣中BNP濃度。樣本中BNP含量越高，則發(fā)光信號(hào)越強(qiáng)。
[0082]結(jié)果表明，其最低檢測(cè)限為2.0pg/ml，最低定量限為15pg/ml，定量檢測(cè)范圍為2.0?5000pg/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99 ；在檢測(cè)范圍內(nèi)，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng);且批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于10%。可為心梗心衰疾病診斷提供參考。
[0083]實(shí)施例2:直接化學(xué)發(fā)光測(cè)定BNP
[0084](— )抗體標(biāo)記
[0085]向磷酸緩沖液中加入適量活化的吖啶酯和10?30yg抗BNP單抗溶液，混合均勻并于室