本發(fā)明涉及遺傳工程領域，尤其涉及一種高產乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法。
背景技術：
乙酰氨基葡萄糖是生物體內的一種單糖，廣泛存在于細菌、酵母、霉菌、植物以及動物體內。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復和維持軟骨及關節(jié)組織功能具有重要作用。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學品的生產宿主，其產品被FDA認證為“generally regarded as safe”(GRAS)安全級別。因此，運用代謝工程手段構建重組枯草芽孢桿菌是生產食品安全級乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。現(xiàn)有公開技術中(Metab.Eng.2014，23:42-52)，構建的重組枯草芽孢桿菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)在基本培養(yǎng)基中生長緩慢，并且乙酰氨基葡萄糖產量相比于在復合培養(yǎng)基中顯著降低。
已有研究表明，6-磷酸果糖在GlmS的催化作用下生成6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)的過程受到由glmS核酶開關介導的嚴格反饋控制，該步是GlcNAc合成途徑中的重要限速反應，具體調控過程如下：當胞內GlcN6P積累時，其能夠與glmS核酶開關結合，激活核酶開關對glmS基因轉錄產物進行自切割；3’端mRNA切割部分因切割形成的5’-OH端被RNA酶J1特異性識別，在RNA酶J1作用下mRNA被進一步降解，造成glmS基因的mRNA無法翻譯，降低glmS基因的表達；而當GlcN6P濃度較低時，glmS基因轉錄產物可正常翻譯。因此，要想過量合成GlcNAc，必須解除glmS核酶對GlcNAc合成關鍵酶glmS在轉錄水平的抑制調控。
技術實現(xiàn)要素：
為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種高產乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法，通過同源重組敲除氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶，阻斷了宿主菌胞內6-磷酸氨基葡萄糖反饋抑制氨基葡萄糖合成酶基因glmS的表達，促進乙酰氨基葡萄糖積累。
為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：
在一方面，本發(fā)明提供了一種高產乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌，通過敲除枯草芽孢桿菌中調控氨基葡萄糖合成酶表達的glmS核酶，并插入終止子和組成型啟動子序列而得到。
進一步地，枯草芽孢桿菌為BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，是通過以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達得到。其構建方法可參閱文獻“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作進一步描述。
進一步地，glmS核酶的編碼基因如NCBI-Gene ID:8302932所示。
進一步地，終止子為trp終止子、ybc終止子或T7終止子。
進一步地，組成型啟動子為P43啟動子、PsrfA啟動子或PaprE啟動子。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一種高產乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌的構建方法，包括以下步驟：
(1)構建glmS核酶編碼基因敲除框，所述敲除框依次包括glmS核酶編碼基因上游同源臂、終止子、抗性基因、組成型啟動子和glmS核酶編碼基因下游同源臂序列；
(2)將步驟(1)得到的glmS核酶編碼基因敲除框轉化枯草芽孢桿菌，通過篩選、PCR驗證并篩選出抗性消除菌株后得到重組枯草芽孢桿菌。
進一步地，在步驟(1)中，glmS核酶編碼基因敲除框中還包括glmS核酶的編碼基因的上、下游同源臂引物序列。
進一步地，在步驟(1)中，抗性基因為壯觀霉素抗性基因spc、博來霉素抗性基因zeo、卡那霉素抗性基因kan或氨芐青霉素抗性基因amp。
進一步地，在步驟(1)中，終止子為trp終止子、ybc終止子或T7終止子。
進一步地，在步驟(1)中，glmS核酶的編碼基因如NCBI-Gene ID:8302932所示。
進一步地，在步驟(1)中，組成型啟動子為P43啟動子、PsrfA啟動子或PaprE啟動子。
進一步地，在步驟(2)中，枯草芽孢桿菌為BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1(以下實施例中簡稱為BSGN)，是通過以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達得到。其構建方法可參閱文獻“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作進一步描述。
進一步地，本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌在發(fā)酵生產乙酰氨基葡萄糖中的應用。
進一步地，發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下成分：葡萄糖、Na2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胸腺嘧啶以及色氨酸。
在一具體實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基以其重量為基準，包括以下成分：葡萄糖2.0g/L、Na2HPO4 7.1g/L、KH2PO4 1.35g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.25g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、胸腺嘧啶0.01g/L以及色氨酸0.01g/L。
借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：
本發(fā)明是以枯草芽孢桿菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)作為出發(fā)菌株，通過同源重組敲除氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶，阻斷了宿主菌胞內6-磷酸氨基葡萄糖反饋抑制氨基葡萄糖合成酶基因glmS的表達，促進乙酰氨基葡萄糖積累；本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可提高使用基本培養(yǎng)基時乙酰氨基葡萄糖的產量，其比生長速率和乙酰氨基葡萄糖的產量能夠分別達到0.84h-1和321.3mg/L，分別是敲除前菌株的2.09倍和2.57倍，為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產氨基葡萄糖奠定了基礎；本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構建方法簡單，便于使用，具有很好地應用前景。
說明書附圖
圖1圖示了本發(fā)明敲除了glmS核酶對細胞生長和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)產生的影響結果。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
根據NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因上下游序列，設計敲除框擴增引物：
擴增上游同源臂引物為GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.2所示。
擴增篩選標記表達盒引物為GlmS-2F GGAAAAAGGCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTGAGTATTCCAAACTGGACACATGG，如SEQ ID No.3所示；GlmS-2R ATCAAACTAAGCGCCCGGAAAAAGGCAGCCCGCCAGTGTTTCCACCATTTTTTCAATTT，如SEQ ID No.4所示。
擴增P43啟動子引物為GlmS-3F GAAACACTGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTTTGATAGGTGGTATGTTTTCGC，如SEQ ID No.5所示；GlmS-3RCGTCCCCTCCTACATGTTTTTATAATGGTACCGCTATCAC，如SEQ ID No.6所示。
擴增下游同源臂引物為GlmS-4F GTGATAGCGGTACCATTATAAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.7所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
運用上述引物從枯草芽孢桿菌基因組中擴增上游同源臂、P43啟動子和下游同源臂，并從載體PDGREF中擴增含有壯觀霉素抗性基因的篩選標記表達盒。其中，引物GlmS-2F中插入trp終止子序列(AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTT)，如SEQ ID No.27所示。再利用融合PCR技術將上游同源臂、篩選標記、P43啟動子、下游同源臂序列進行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R擴增敲除框，將得到的敲除框轉化枯草芽孢桿菌BSGN，該枯草芽孢桿菌是通過以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72為宿主，分別以啟動子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達得到。利用PCR驗證篩選并確定正確轉化子，再進行誘導表達mazF，篩選出抗性消除菌株，確認氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNR。
本實施例中，擴增條件如下：
98℃，預變性3min；(98℃，變性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34個循環(huán)；68℃，延伸5min。
實施例2
根據NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因上下游序列，設計敲除框擴增引物：
擴增上游同源臂引物為GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.9所示。
擴增篩選標記表達盒引物為GlmS-2F GGAAAAAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGAGTATTCCAAACTGGACACATGG，如SEQ ID No.10所示；GlmS-2R ATCAAACTAAGCGCCCGGAAAAAGGCAGCCCGCCAGTGTTTCCACCATTTTTTCAATTT，如SEQ ID No.11所示。
擴增P43片段引物為GlmS-3F GAAACACTGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTTTGATAGGTGGTATGTTTTCGC，如SEQ ID No.12所示；GlmS-3R CGTCCCCTCCTACATGTTTTTATAATGGTACCGCTATCAC，如SEQ ID No.13所示。
擴增下游同源臂引物GlmS-4F GTGATAGCGGTACCATTATAAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.14所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
運用上述引物從枯草芽孢桿菌基因組中擴增上游同源臂、P43啟動子和下游同源臂，并從載體PDGREF中擴增含有壯觀霉素抗性基因的篩選標記表達盒。其中，引物GlmS-2F(SEQ ID No.10)中插入T7終止子序列(TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTT)，如SEQ ID No.28所示。再利用融合PCR技術將上游同源臂、篩選標記、P43啟動子、下游同源臂序列進行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R擴增敲除框，將得到的敲除框轉化枯草芽孢桿菌BSGN，利用PCR驗證篩選并確定正確轉化子，再進行誘導表達mazF，篩選出抗性消除菌株，即得glmS核酶敲除菌株。
本實施例中，擴增條件如下：
98℃，預變性3min；(98℃，變性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34個循環(huán)；68℃，延伸5min。
實施例3
根據NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因上下游序列，設計敲除框擴增引物：
擴增上游同源臂引物為GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAAAACACCCGCTTGTATAACGAGCGGATGGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.15所示。
擴增篩選標記表達盒引物為GlmS-2F GGAAAAAGGCCATCCGCTCGTTATACAAGCGGGTGTTTTTTTTGAGTATTCCAAACTGGACACATGG，如SEQ ID No.16所示；GlmS-2RTGACTATGTGTACCGCGCAAAAACCAGTGTTTCCACCATTTTTTCAATTT，如SEQ ID No.17所示。
擴增PsrfA啟動子片段引物為Psrf-F AAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTGGTTTTTGCGCGGTACACATAGTCA，如SEQ ID No.18所示；Psrf-R CGTCCCCTCCTACATGTTTTCCCCTAATCTTTATAAGCAGTGAAC，如SEQ ID No.19所示。
擴增下游同源臂引物GlmS-4F GTTCACTGCTTATAAAGATTAGGGGAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.20所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
運用上述引物從枯草芽孢桿菌基因組中擴增上游同源臂、PsrfA啟動子和下游同源臂，并從載體PDGREF中擴增含有壯觀霉素抗性基因的篩選標記表達盒。其中，引物GlmS-2F(SEQ ID No.16)中插入ybc終止子序列(CATCCGCTCGTTATACAAGCGGGTGTTTTTTTT)，如SEQ ID No.29所示。再利用融合PCR技術將上游同源臂、篩選標記、PsrfA啟動子、下游同源臂序列進行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R擴增敲除框，將得到的敲除框轉化枯草芽孢桿菌BSGN，利用PCR驗證篩選并確定正確轉化子，再進行誘導表達mazF，篩選出抗性消除菌株，即得glmS核酶敲除菌株。
本實施例中，擴增條件如下：
98℃，預變性3min；(98℃，變性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34個循環(huán)；68℃，延伸5min。
實施例4
根據NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因上下游序列，設計敲除框擴增引物：
擴增上游同源臂引物為GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.21所示。
擴增篩選標記表達盒引物為GlmS-2F GGAAAAAGGCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTGAGATTCTACCGTTCGTATAGC，如SEQ ID No.22所示；GlmS-2R GCGAAAACATACCACCTATCACTACCGTTCGTATAATGTATGC，如SEQ ID No.23所示。
擴增P43啟動子引物為GlmS-3F GCATACATTATACGAACGGTAGTGATAGGTGGTATGTTTTCGC，如SEQ ID No.24所示；GlmS-3R CGTCCCCTCCTACATGTTTTTATAATGGTACCGCTATCAC，如SEQ ID No.25所示。
擴增下游同源臂引物為GlmS-4F GTGATAGCGGTACCATTATAAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.26所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
運用上述引物從枯草芽孢桿菌基因組中擴增上游同源臂、P43啟動子和下游同源臂，并從載體P7Z6中擴增含博來霉素抗性基因的篩選標記表達盒。其中，引物GlmS-2F(SEQ ID No.22)中插入trp終止子序列(AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTT)，如SEQ ID No.27所示。再利用融合PCR技術將上游同源臂、篩選標記、P43啟動子、下游同源臂序列進行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R擴增敲除框，將得到的敲除框轉化枯草芽孢桿菌BSGN，利用PCR驗證篩選并確定正確轉化子，再進行誘導表達mazF，篩選出抗性消除菌株，即得glmS核酶敲除菌株。
本實施例中，擴增條件如下：
98℃，預變性3min；(98℃，變性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34個循環(huán)；68℃，延伸5min。
以上實施例使用的出發(fā)菌株BSGN，其構建方法可參閱文獻“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作進一步描述。
實施例5
在37℃、200rpm下，培養(yǎng)實施例1構建的重組枯草芽孢桿菌BSGNR 12h，所使用的種子培養(yǎng)基包括以下重量的各組分：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。然后以5％的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下發(fā)酵30h。發(fā)酵培養(yǎng)基以其重量為基準，包括以下成分：葡萄糖2.0g/L、Na2HPO4 7.1g/L、KH2PO4 1.35g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.25g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、胸腺嘧啶0.01g/L以及色氨酸0.01g/L。測定發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量，乙酰氨基葡萄糖的測定方法如下：
高效液相色譜(HPLC)檢測法：Agilent 1200，RID檢測器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流動相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱溫30℃，進樣體積為10μL。
圖1圖示了本發(fā)明敲除了glmS核酶對細胞生長和GlcNAc產生的影響結果。其中圖1a為以葡萄糖作為單一碳源的基本培養(yǎng)基中，對比菌株BSGN和本發(fā)明的glmS核酶敲除菌株BSGNR的細胞生長的比較結果，圖1b為以葡萄糖作為單一碳源的基本培養(yǎng)基中，在搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)中對比菌株BSGN和本發(fā)明的glmS核酶敲除菌株BSGNR的GlcNAc滴度的比較結果，圖1c為以葡萄糖作為單一碳源的基本培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)中BSGN和BSGNR的特異性細胞生長速率和GlcNAc生產力的比較。從圖中可以看出，本發(fā)明重組枯草芽孢桿菌BSGNR的比生長速率達到0.84h-1，其發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達到321.3mg/L，分別是敲除前菌株的2.09倍和2.57倍。BSGNR的乙酰氨基葡萄糖產率為10.04mg/L/h，說明本發(fā)明通過敲除氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶編碼基因，實現(xiàn)了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外產量的提高。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。
序列表
<110> 江南大學
<120> 高產乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法
<160> 29
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物 GlmS-F
<400> 1
TCTGCTATTA TGCTGATGAA CAC 23
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物 GlmS-1R
<400> 2
GGAATACTCA AAAAAGCCCG CTCATTAGGC GGGCTGCCTT TTTCCGGGCG CTTAGTT 57
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2F
<400> 3
GGAATACTCA AAAAAGCCCG CTCATTAGGC GGGCTGCCTT TTTCCGGGCG CTTAGTT 57
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2R
<400> 4
ATCAAACTAA GCGCCCGGAA AAAGGCAGCC CGCCAGTGTT TCCACCATTT TTTCAATTT 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> P43啟動子引物GlmS-3F
<400> 5
GAAACACTGG CGGGCTGCCT TTTTCCGGGC GCTTAGTTTG ATAGGTGGTA TGTTTTCGC 59
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> P43啟動子引物GlmS-3R
<400> 6
CGTCCCCTCC TACATGTTTT TATAATGGTA CCGCTATCAC 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 7
GTGATAGCGG TACCATTATA AAAACATGTA GGAGGGGACG 40
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-R
<400> 8
TTCTGTCTCA AGTCCTCCAT TGACG 25
<210> 9
<211> 77
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物GlmS-1R
<400> 9
GGAATACTCA AAAAACCCCT CAAGACCCGT TTAGAGGCCC CAAGGGGTTA TGCTAGCCTT 60
TTTCCGGGCG CTTAGTT 77
<210> 10
<211> 80
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2F
<400> 10
GGAAAAAGGC TAGCATAACC CCTTGGGGCC TCTAAACGGG TCTTGAGGGG TTTTTTGAGT 60
ATTCCAAACT GGACACATGG 80
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2R
<400> 11
ATCAAACTAA GCGCCCGGAA AAAGGCAGCC CGCCAGTGTT TCCACCATTT TTTCAATTT 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> P43片段引物GlmS-3F
<400> 12
GAAACACTGG CGGGCTGCCT TTTTCCGGGC GCTTAGTTTG ATAGGTGGTA TGTTTTCGC 59
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> P43片段引物為GlmS-3R
<400> 13
CGTCCCCTCC TACATGTTTT TATAATGGTA CCGCTATCAC 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 14
GTGATAGCGG TACCATTATA AAAACATGTA GGAGGGGACG 40
<210> 15
<211> 64
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物GlmS-1R
<400> 15
GGAATACTCA AAAAAAACAC CCGCTTGTAT AACGAGCGGA TGGCCTTTTT CCGGGCGCTT 60
AGTT 64
<210> 16
<211> 67
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2F
<400> 16
GGAAAAAGGC CATCCGCTCG TTATACAAGC GGGTGTTTTT TTTGAGTATT CCAAACTGGA 60
CACATGG 67
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2R
<400> 17
TGACTATGTG TACCGCGCAA AAACCAGTGT TTCCACCATT TTTTCAATTT 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> PsrfA啟動子片段引物Psrf-F
<400> 18
AAATTGAAAA AATGGTGGAA ACACTGGTTT TTGCGCGGTA CACATAGTCA 50
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> PsrfA啟動子片段引物Psrf-R
<400> 19
CGTCCCCTCC TACATGTTTT CCCCTAATCT TTATAAGCAG TGAAC 45
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 20
GTTCACTGCT TATAAAGATT AGGGGAAAAC ATGTAGGAGG GGACG 45
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物GlmS-1R
<400> 21
GGAATACTCA AAAAAGCCCG CTCATTAGGC GGGCTGCCTT TTTCCGGGCG CTTAGTT 57
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2F
<400> 22
GGAAAAAGGC AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTGAGA TTCTACCGTT CGTATAGC 58
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 篩選標記表達盒引物GlmS-2R
<400> 23
GCGAAAACAT ACCACCTATC ACTACCGTTC GTATAATGTA TGC 43
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> P43啟動子引物GlmS-3F
<400> 24
GCATACATTA TACGAACGGT AGTGATAGGT GGTATGTTTT CGC 43
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> P43啟動子引物GlmS-3R
<400> 25
CGTCCCCTCC TACATGTTTT TATAATGGTA CCGCTATCAC 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 26
GTGATAGCGG TACCATTATA AAAACATGTA GGAGGGGACG 40
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> trp終止子
<400> 27
AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTT 26
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> T7終止子
<400> 28
TAGCATAACC CCTTGGGGCC TCTAAACGGG TCTTGAGGGG TTTTTT 46
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> ybc終止子
<400> 29
CATCCGCTCG TTATACAAGC GGGTGTTTTT TTT 33