本發(fā)明涉及XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點及其應(yīng)用，具體為XI型成骨不全治病基因FKBP10的突變位點及利用該位點進行致病檢測的試劑盒，屬于突變基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：成骨不全(osteogenesisimperfecta,OI)是一類因I型膠原蛋白合成代謝障礙而引起的遺傳性結(jié)締組織疾病.臨床癥狀主要包括骨質(zhì)疏松、易骨折，部分患者還會有身材矮小、藍鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、早熟性耳硬化、關(guān)節(jié)及韌帶松弛以及肌肉薄弱等癥狀?；颊叩膫€體發(fā)病率約為1/10000。成骨不全具有表型與遺傳異質(zhì)性，其臨床表現(xiàn)從輕微、無癥狀到嚴重骨骼畸形甚至圍產(chǎn)期死亡等嚴重程度不等。1979年，Sillence根據(jù)病人臨床體征和影像學(xué)等特性將成骨不全分為Ⅰ-Ⅳ型。I-IV型均是由于I型膠原蛋白結(jié)構(gòu)基因COL1A1或COL1A2發(fā)生突變所致。其后，V-VII型成骨不全先后從異質(zhì)性較高的IV型成骨不全患者中分離開來，VIII-XVII型成骨不全根據(jù)致病基因的先后發(fā)現(xiàn)順序而命名。成骨不全具有遺傳異質(zhì)性，存在常染色體顯性遺傳與常染色體隱性遺傳兩種遺傳方式，其中常染色體顯性遺傳是由于I型膠原蛋白結(jié)構(gòu)基因COL1A1或COL1A2突變所致或是IFITM5的定點突變所致。常染色體隱性遺傳方式涉及到的患者數(shù)量少，但是致病基因種類眾多，包括SERPINF1、CRTAP、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、WNT1、CREB3L1、SPARC等。其中FKBP10為XI型成骨不全的致病基因。目前關(guān)于FKBP10基因突變的成骨不全患者報道數(shù)量非常少，主要以點突變?yōu)橹鳎壳吧袩o關(guān)于該基因拷貝數(shù)變異的報道。包括全基因組重測序、全外顯子組測序、靶向捕獲測序等高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，為遺傳性致病基因的發(fā)現(xiàn)提供了有利工具，目前通過高通量發(fā)現(xiàn)的遺傳性疾病的新致病基因以及致病基因的新發(fā)突變位點數(shù)量劇增，高通量測序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的Sanger測序以及其它單核苷酸多態(tài)性檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，極大的推動了遺傳性疾病的基因檢測的發(fā)展。成骨不全致病基因新突變位點的發(fā)現(xiàn)，對于開展該類疾病的分子診斷具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點及其應(yīng)用。發(fā)明概述本發(fā)明采用全基因組重測序技術(shù)結(jié)合數(shù)字化PCR、Sanger測序等綜合技術(shù)，針對臨床疑似成骨不全患者進行了全基因組重測序，結(jié)合生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)FKBP10基因外顯子2到外顯子4存在拷貝數(shù)變異，同時外顯子5存在雜合剪切位點突變c.918-3C>G。分別通過數(shù)字化PCR以及傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上的Sanger測序分析，進一步驗證了FKBP10外顯子2到4的拷貝數(shù)變異與雜合剪切突變?？截悢?shù)變異與雜合突變的發(fā)現(xiàn)，為探討XI型成骨不全的發(fā)病機制，豐富與發(fā)展其診斷方法，從而為臨床診斷與治療提供依據(jù)與參考，為開發(fā)早期致病基因篩查與治療等提供基礎(chǔ)依據(jù)。發(fā)明詳述本發(fā)明技術(shù)方案如下：XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點，該突變位點位于FKBP10基因外顯子5的-3bp處，該處核苷酸由C突變?yōu)镚，突變后該突變所在的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；測序引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。在一實施方案中，F(xiàn)KBP10外顯子5上游-3位c.918-3C>G雜合剪切突變擴增的上、下游引物序列分別為SEQIDNO.11與SEQIDNO.12。包括外顯子5FKBP10外顯子5及其相鄰內(nèi)含子擴增的PCR產(chǎn)物的Sanger測序反應(yīng)中，測序引物為SEQIDNO.11。XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子2的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；檢測探針核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，檢測探針5’端連接有FAM熒光標記，3’端連接有BHQ1淬滅基團。XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子3的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；檢測探針核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，檢測探針5’端連接有FAM熒光標記，3’端連接有BHQ1淬滅基團。XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子4的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，檢測探針核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，檢測探針5’端連接有FAM熒光標記，3’端連接有BHQ1淬滅基團。一種XI型成骨不全的檢測試劑盒，包括拷貝數(shù)變異檢測部分和雜合突變檢測部分，拷貝數(shù)變異檢測部分包括：上述XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子2的擴增引物和檢測探針，XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子3的擴增引物和檢測探針，XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子4的擴增引物和檢測探針；以及數(shù)字化PCR的常規(guī)溶液；雜合突變檢測部分包括：上述XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點的擴增引物和測序引物，以及PCR溶液、PCR產(chǎn)物純化試劑和Sanger測序試劑。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述數(shù)字化PCR的常規(guī)溶液包括2×ddPCRSupermix，去RNase與DNase水以及微滴發(fā)生油。數(shù)字化PCR體系中各組分的工作濃度為：ddPCRSupermix濃度為1×，微滴發(fā)生油與PCR反應(yīng)產(chǎn)物體積比為3.5:1，擴增引物900nM，檢測探針250nM，樣品濃度為2ng/μl。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，PCR溶液包括：2.5mMdNTP，含Mg2+的10×PCR緩沖液，5U/μlTaqDNA聚合酶，去RNase與DNase水；PCR體系中各組分的工作濃度為：200μMdNTP，含Mg2+的1×PCR緩沖液，0.025U/μlTaqDNA聚合酶，PCR擴增引物0.4μM，樣品濃度2.5～5ng/μl。PCR產(chǎn)物純化試劑包括：1U/μlSAP酶，10U/μlExoI酶，去RNase與DNase水。PCR產(chǎn)物純化體系中各組分的工作濃度為：0.05U/μlSAP酶，0.5U/μlExoI酶；PCR產(chǎn)物與PCR純化體系的體積比為2:5。所述Sanger測序試劑包括：BigDye3.1混合液、0.125MEDTA溶液、無水乙醇、體積百分比為75％的乙醇溶液，去RNase與DNase水、Hi-Di甲酰胺溶液。Sanger測序體系中各組分的工作濃度為：BigDye混合液1×，測序引物濃度為0.64pMol/L，樣品0.5～2ng/μl。有益效果1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了FKBP10c.918-3C>G雜合突變與FKBP10基因外顯子2到外顯子4的拷貝數(shù)與XI型成骨不全病癥之間的關(guān)系，構(gòu)建了相關(guān)的擴增引物和檢測探針并設(shè)計出相應(yīng)的檢測試劑盒，可用于XI型成骨不全的輔助檢測與分子診斷；2、本發(fā)明采用于數(shù)字化PCR以及傳統(tǒng)PCR擴增的引物和探針，均經(jīng)過前期優(yōu)化，保證了擴增的特異性與高效性，提高了對拷貝數(shù)變異進行識別，提高了檢測的可信度與靈敏度；3、本發(fā)明豐富了FKBP10基因的致病突變譜，為探討基因型與表型之間的相互關(guān)系、及其分子致病機制的研究具有重要意義，可以用于臨床診斷與基礎(chǔ)研究。附圖說明圖1、FKBP10外顯子2到外顯子4拷貝數(shù)變異分析圖；圖中，從左至右分別為空白對照、患者母親、患者父親與患者三人的FKBP10外顯子2，外顯子3與外顯子4的拷貝數(shù)。圖2、FKBP10c.918-3C>G雜合突變與正常對照Sanger測序峰圖；圖3、患者父親、母親以及患者FKBP10外顯子2，外顯子3與外顯子4的相對表達量柱狀圖；圖4、FKBP10外顯子2到外顯子4拷貝數(shù)變異分析圖；圖中，從左至右分別為空白對照以及患者母親羊水、正常對照的FKBP10外顯子2，外顯子3與外顯子4的拷貝數(shù)。圖5、患者母親胎兒樣本FKBP10外顯子5Sanger測序峰圖；具體實施方式為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實現(xiàn)的目的及效果，下面結(jié)合實施例做進一步的說明如下。試劑來源Msel(10U/μl，貨號R0525S)、Bstz17I(5U/μl，貨號R0549S)與CutSmartBuffer(10×conc，貨號B7204S)均購自NEB公司。QIAampDNABlood試劑盒(貨號51104)購于Qiagen公司。ddPCRTMSupermixforprobes(貨號186-3026)與微滴發(fā)生油Dropletgenerationoil(貨號186-4005)均購自伯樂公司。TaKaRaTaqTM(R001A)PCR溶液相關(guān)試劑購自Takara公司。SAP(1U/μl，貨號70092Y)、ExoI(10U/μl，貨號70073Z)均購自USB公司。BigDye3.1(貨號4337455，ThermoFisherScientific公司)、Na2EDTA﹒2H2O(貨號15576028，ThermoFisherScientific公司)、Hi-DiFormamide(貨號4404307，ABI公司)無水乙醇購自國藥集團；去RNase酶與DNase酶水(貨號10977015)，購自ThermoFisherScientific公司；實施例所需引物與探針均由華大基因合成。實施例1本實施采用全基因組重測序技術(shù)，包括外周血樣本采集、全基因組DNA提取、DNA片段化、文庫構(gòu)建與測序、測序結(jié)果分析等流程，針對一中國漢族成骨不全患者核心家庭進行了全基因組重測序，結(jié)合生物信息學(xué)分分析發(fā)現(xiàn)成骨不全患者FKBP10基因存在外顯子2到外顯子4的拷貝數(shù)變異以及c.918-3C>G雜合突變。其中，父母分別為攜帶者，其中，母親為FKBP10外顯子2到外顯子4拷貝數(shù)異常減半，父親為FKBP10c.918-3C>G雜合突變。根據(jù)該結(jié)果，通過實施例2與3進行該結(jié)果的驗證。實施例2采用數(shù)字化PCR，分別對FKBP10外顯子2到外顯子4拷貝數(shù)變化進行驗證，具體實施如下：(1)FKBP10外顯子2到外顯子4數(shù)字化PCR引物與探針的設(shè)計與優(yōu)化采用BeaconDesigner8.14軟件進行上、下游引物與探針的設(shè)計，其中，F(xiàn)KBP10外顯子2與3的上、下游引物均設(shè)計3對，外顯子4的上、下游引物設(shè)計2對。采用羅氏iCycler480定量PCR儀，通過SyBrGreenI基礎(chǔ)上的相對定量PCR方法，根據(jù)熒光定量PCR擴增的特異性、熔點曲線峰值的均一性以及Ct值得大小篩選出針對每一外顯子的最佳上、下游引物，根據(jù)引物序列得到相對應(yīng)的探針序列，其中，F(xiàn)KBP10外顯子2到4的探針的5’端均標記FAM熒光基團、3’端為BHQ1淬滅基團。內(nèi)參采用拷貝數(shù)為2的CEP17基因。CEP17探針5’端標記VIC熒光基團。所有引物與探針序列提交北京華大基因合成。(2)外周血全基因組DNA提取及其片段化采用Qiagen公司QIAampDNABlood試劑盒(貨號51104)，按照試劑說明書進行全血基因組DNA的提取，采用Nanodrop2000儀器進行DNA濃度與純度的測定?；蚪MDNA的片段化反應(yīng)體系為25μl，其中10×NEBCutSmart緩沖液2.5μl、10U/μlMseI0.5μl、5U/μlBstz1710.5μl、DNA300ng，剩余體積用去RNase與DNase水補足。片段化酶切條件為：37℃孵育15分鐘，然后65℃滅火20分鐘。(3)數(shù)字化PCR反應(yīng)及反應(yīng)程序數(shù)字PCR反應(yīng)體系為20μl，其中包括：2×ddPCRSupermix(Bio-Rad公司)10μl、FKBP10外顯子2到4的上、下游引物工作濃度均為900nM，探針濃度為250nM。內(nèi)參基因采用CEP17，內(nèi)參基因與各外顯子的擴增均分別在同一反應(yīng)管中進行，其中模板量總量為40ng。同時，以去RNase與DNase水替代模板，其它組分不變，作為空白對照。將上述20μl混合物加入其中70μl微滴生成油(Bio-Rad公司，貨號10040718)，將加樣孔放入微滴發(fā)生器QX200中，打開電源，2分鐘后完成微滴生成。同時，以去RNase與DNase水作為模板，將40μl微滴混合液移入96孔板中，采用定量PCR儀進行定量PCR反應(yīng)，定量PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性8分鐘；95℃30秒，60℃60秒，共計40輪循環(huán)；98℃10分鐘。(4)定量PCR微滴信號的檢測采用微滴閱讀器檢測發(fā)光信號，QuantaSoftsoreware軟件計算陽性、陰性擴增的微滴個數(shù)，再利用泊松分布計算目標片段的起始濃度，拷貝數(shù)計算采用CNV＝A/B*Na公式計算。其中，A為靶基因的濃度，B為內(nèi)參基因的濃度，Na為內(nèi)參基因在基因組上的拷貝數(shù)。人CEP17拷貝數(shù)為2。實施例3采用傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上的Sanger測序分析，對FKBP10外顯子5c.918-3C>G雜合突變進行驗證。具體實施如下(1)PCR引物的設(shè)計采用在線Primer3.0進行FKBP10外顯子引物的設(shè)計，交由北京華大基因合成。(2)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為20μl，其中包括：10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl、2.5mMdNTP1.8μl、TaqDNA聚合酶0.1μl、5μM上游引物1.6μl、5μM下游引物1.6μl，非酶切片段化DNA模板50ng～100ng，去RNase與DNase水補足至20μl。采用BIO-RAD公司PIC-200型PCR儀，進行降落PCR，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性20秒，62℃退火30秒，退火溫度每一循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸40秒，循環(huán)次數(shù)14；然后，94℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，循環(huán)次數(shù)21；72℃終延伸5分鐘。(3)PCR產(chǎn)物純化PCR純化體系為20μl，其中包括：PCR產(chǎn)物8μl，1U/μlSAP酶1μl，10U/μlExoI酶1μl，去RNase與DNase水10μl。(4)Sanger測序反應(yīng)DNA測序反應(yīng)的體系為10μl，包括4μlBigDye，3.2pMol/L測序引物2μl，5～20ng純化的PCR物，用去RNase與DNase水補足至10μl。反應(yīng)條件為：96℃10秒，50℃5秒，60℃4分鐘，共28個循環(huán)反應(yīng)。PCR循環(huán)完并冷卻到4℃，取下并馬上進行短時間離心。測序反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物中加入2.5μl0.125M的EDTA溶液，然后加入30μl無水乙醇，顛倒混勻后室溫放置15分鐘。在12000g離心10分鐘后，移除上清。加入60μl體積百分比濃度為70％的乙醇溶液，4℃12000g離心15分鐘后，移除上清，重復(fù)一次后，待乙醇揮發(fā)干凈后將沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺。95℃變性4分鐘后采用ABI3130XL測序儀進行測序分析。(5)測序結(jié)果分析測序結(jié)果采用MutationSurvey軟件進行突變位點的識別。實驗結(jié)果全基因組重測序與數(shù)字化PCR證明FKBP10基因外顯子2到外顯子4在正常人以及患者父親中的拷貝數(shù)為2，而在患者以及患者母親中為1，結(jié)果如圖1所示。FKBP10c.918-3C>G雜合突變存在于患者及其患者父親中，正常人與患者母親中不存在，結(jié)果如圖2所示。該突變后的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具體如下：gagGGACAGTGATCCCCCCACAGGCCTCGCTGGTCTTTCACGTCCTCCTGATTGACGTGCACAACCCGAAGGACGCTGTCCAGCTAGAGACGCTGGAGCTCCCCCCCGGCTGTGTCCGCAGAGCCGGGGCCGGGGACTTCATGCGCTACCACTACAATGGCTCCTTGATGGACGGCACCCTCTTCGATTCCAG實施例4一種XI型成骨不全的檢測試劑盒，包括拷貝數(shù)變異檢測部分和雜合突變檢測部分，拷貝數(shù)變異檢測部分包括：XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子2的擴增引物和檢測探針，XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子3的擴增引物和檢測探針，XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子4的擴增引物和檢測探針；以及數(shù)字化PCR的常規(guī)溶液；雜合突變檢測部分包括：XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點的擴增引物和測序引物，以及PCR溶液、PCR產(chǎn)物純化試劑和Sanger測序試劑。所述XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；測序引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子2的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；檢測探針核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，檢測探針5’端連接有FAM熒光標記，3’端連接有BHQ1淬滅基團。XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子3的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；檢測探針核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，檢測探針5’端連接有FAM熒光標記，3’端連接有BHQ1淬滅基團。XI型成骨不全致病基因FKBP10外顯子4的擴增引物，該擴增引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，檢測探針核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，檢測探針5’端連接有FAM熒光標記，3’端連接有BHQ1淬滅基團。上述序列如表1所示：表1名稱序列長度SEQID.2CTATGATCGCAACACCTT18SEQID.3GACACACATGCCCATGA17SEQID.4FAM-CCATCGTGGTGGGTGTGGG-BHQ119SEQID.5GTGTGGAACAAGGAAGAC18SEQID.6TGCCATTGTAGTGGTAGC18SEQID.7FAM-AAGTCGCCGTCCTGGACCAT-BHQ120SEQID.8CTCTGGTTGGCTGATCAA18SEQID.9CAGGAATGGAGGGATGATA19SEQID.10FAM-TCTCCAGGACACATGCCCAG-BHQ120SEQID.11GAGGAGCAAGAAGCAGGGC19SEQID.12GAATCAGATGGGGTGACCAG19所述數(shù)字化PCR的常規(guī)溶液包括2×ddPCRSupermix，去RNase與DNase水以及微滴發(fā)生油。2×SuperMix的貨號為186-3026，微滴發(fā)生油的貨號186-3005，均購自伯樂公司。數(shù)字化PCR體系中各組分的工作濃度為：ddPCRSupermix濃度為1×，微滴發(fā)生油體積與PCR產(chǎn)物體積比為3.5:1，擴增引物900nM，檢測探針250nM，樣品濃度2ng/μl。PCR溶液包括：2.5mMdNTP，含Mg2+的10×PCR緩沖液，5U/μlTaqDNA聚合酶，去RNase與DNase水；PCR體系中各組分的工作濃度為：200μMdNTP，含Mg2+的1×PCR緩沖液，0.025U/μlTaqDNA聚合酶，PCR擴增引物0.4μM，樣品濃度2.5～5ng/μl。PCR產(chǎn)物純化試劑包括：1U/μlSAP酶，10U/μlExoI酶，去RNase與DNase水；PCR產(chǎn)物純化體系中各組分的工作濃度為：0.05U/μlSAP酶，0.5U/μlExoI酶；PCR產(chǎn)物與PCR純化體系的體積比為2:5。所述Sanger測序試劑包括：BigDye3.1混合液、0.125MEDTA溶液、無水乙醇、體積百分比為75％的乙醇溶液，去RNase與DNase水、Hi-Di甲酰胺溶液。Sanger測序體系中各組分的工作濃度為：BigDye混合液1×，測序引物0.64pMol/L，樣品0.5～2ng/μl。實驗例按照表1中FKBP10外顯子2到外顯子4數(shù)字化PCR引物序列，對FKBP10外顯子2與外顯子4進行相對定量PCR分析，所用樣本包括正常人、患者、患者父母外周血樣本。采用Qiagen公司QIAampDNABlood試劑盒(貨號51104)，按照試劑說明書進行全血基因組DNA的提取，采用Nanodrop2000儀器進行DNA濃度與純度的測定。定量PCR反應(yīng)體系10μl，包括LC4802×SYBRGreenIMaster5μl、10μMFKBP10外顯子2或外顯子3或外顯子4以及內(nèi)參基因CEP17上、下游引物各0.5μl，全基因組DNA10ng，其余用水補足。定量PCR反應(yīng)程序為該實驗反應(yīng)程序：95℃5min；95℃10s，60℃10s，72℃10s為1個循環(huán)，共計45個循環(huán)；95℃5s，65℃1min，97℃Continuous為1個循環(huán)，熔解曲線分析；98℃10min，37℃5min冷卻。所得到的不同樣本不同外顯子的Cp值利用公式2^(-△△Cp)方法進行相對定量分析，以正常對照作為參考，則可以看出，相對于正常對照，患者父親FKBP10外顯子2，外顯子3與外顯子4相對表達量分別為0.68、0.82與0.65；患者母親FKBP10外顯子2，外顯子3與外顯子4的相對表達量分別為0.31、0.40與0.23；患者FKBP10外顯子2～4相對表達量分別為0.33、0.41與0.35；與正常對照相比，患者以及患者母親的相對表達量低于健康對照以及患者父親，患者父親的FKBP10外顯子2-4相對表達量也要低于健康對照(圖3)。比較相對定量PCR與數(shù)字化PCR結(jié)果可以看出，數(shù)字化PCR能夠直接計算出每一樣本的實際拷貝數(shù)，從檢測的準確度與靈敏度方面均高于定量PCR。采用數(shù)字化PCR對患者母親羊水DNA樣本進行患者已發(fā)現(xiàn)的兩位點的突變檢測，即FKBP10外顯子2，外顯子3以及外顯子4的拷貝數(shù)以及外顯子5上游-3位是否存在C到G的雜合突變。圖4與圖5表明患者母親羊水樣本中存在FKBP10外顯子2～4的拷貝數(shù)為正常人的一半，即拷貝數(shù)為1，不存在c.918-3C>G的雜合突變。該結(jié)果表明本發(fā)明的方法能夠準確識別FKBP10外顯子2到外顯子4拷貝數(shù)變異的檢測以及FKBP10外顯子5上游內(nèi)含子的基因突變檢測，該方法亦適用于其它拷貝數(shù)變異的檢測與基因突變檢測。SEQUENCELISTING<110>山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心<120>XI型成骨不全致病基因FKBP10的突變位點及其應(yīng)用<160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>193<212>DNA<213>Homosapiens<400>1gagggacagtgatccccccacaggcctcgctggtctttcacgtcctcctgattgacgtgc60acaacccgaaggacgctgtccagctagagacgctggagctcccccccggctgtgtccgca120gagccggggccggggacttcatgcgctaccactacaatggctccttgatggacggcaccc180tcttcgattccag193<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2ctatgatcgcaacacctt18<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>3gacacacatgcccatga17<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4ccatcgtggtgggtgtggg19<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5gtgtggaacaaggaagac18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>6tgccattgtagtggtagc18<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7aagtcgccgtcctggaccat20<210>8<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>8ctctggttggctgatcaa18<210>9<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>9caggaatggagggatgata19<210>10<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>10tctccaggacacatgcccag20<210>11<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>11gaggagcaagaagcagggc19<210>12<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>12gaatcagatggggtgaccag20當(dāng)前第1頁1 2 3