本發(fā)明涉及微生物分子檢測
技術領域：
，尤其是涉及在藻類大規(guī)模培養(yǎng)中對臂尾輪蟲進行早期監(jiān)測的qPCR方法。
背景技術：
：臂尾輪蟲是在藻類大規(guī)模培養(yǎng)中存在的一種重要污染原生動物，它們是一類廣泛分布于內(nèi)陸和沿岸咸水生境的世界性種類輪蟲。目前已經(jīng)在小球藻、柵藻以及血球藻的大規(guī)模培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)并爆發(fā)，一經(jīng)感染，可使藻類大規(guī)模培養(yǎng)在2至4天內(nèi)完全潰敗，導致“泡湯”，從而給藻類的大規(guī)模培養(yǎng)帶來極大危害。因此對于藻類培養(yǎng)中存在的臂尾輪蟲的早期監(jiān)測和分子鑒定方法的確定至關重要。目前對臂尾輪蟲的研究尤其是褶皺臂尾輪蟲的研究較為透徹，研究領域涉及到其分布、種群動態(tài)、生理、有性生殖、休眠卵的誘導、生化組分、超微結構、組織學與組織化學等諸多方面。但是對于其對大規(guī)模藻類培養(yǎng)造成的危害研究比較局限，在環(huán)境條件不利于生產(chǎn)繁殖的時候便形成休眠孢囊存在，對于在大規(guī)模藻類培養(yǎng)很難在顯微鏡中觀察到它們的存在，并且傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察靈敏度低，在原生動物存在數(shù)量很大的前提下才可以完成。而DNA直接測序及聚合酶鏈反應(PCR)存在檢測效率低，當DNA含量很低的情況下不能被檢出，檢測結果出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，也經(jīng)常會影響對實際情況的判斷。并且采用以上方法對臂尾輪蟲進行檢測的時候，就說明存在數(shù)量已經(jīng)很大，而這種存在量已足以使藻類大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)生完全潰敗。因此，對臂尾輪蟲的早期監(jiān)測和分子鑒定的方法尤為重要。隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展，在原生動物的檢測手段方面已發(fā)展迅速，實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)以其檢測速度快，靈敏度高，特異性強的特點在原生動物的分子檢測中和貝類病原檢測中已得到廣泛的應用。在貝類上的原生動物檢測靈敏度以達到30拷貝。因此，對于臂尾輪蟲的檢測急需要熒光定量PCR這種靈敏度高、特異性強、檢測速度快的檢測手段。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了在藻類培養(yǎng)早期快速監(jiān)測到污染物的存在，提供一種臂尾輪蟲的熒光定量PCR檢測方法。該方法較傳統(tǒng)的PCR方法具有更高的靈敏度，且操作簡便，可進行大量的樣品檢測，并對臂尾輪蟲進行定量，從而為藻類培養(yǎng)早期臂尾輪蟲污染的檢測和監(jiān)控提供有效方法。本發(fā)明的第一個技術目的是提供臂尾輪蟲CoI基因在作為用于藻類培養(yǎng)中危害臂尾輪蟲的快速定量檢測qPCR方法的分子標記中的應用。由于原生動物基因序列相似度較大，如直接采用DNA直接測序及聚合酶鏈反應(PCR)，經(jīng)常出現(xiàn)檢測效率低，檢測結果出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。而本發(fā)明經(jīng)過反復研究后，發(fā)現(xiàn)采用臂尾輪蟲CoI基因的特異性區(qū)域片段作為分子標記進行qPCR，可以有效的將臂尾輪蟲在藻類培養(yǎng)過程中有其他污染原生動物存在的條件下鑒定出來。同時，本發(fā)明以CoI基因作為分子標記，還具有以下特點：(1)CoI基因作為分子標記可以使用很短的序列就可以進行區(qū)分，而其他的分子標記所涉序列比較長，比較復雜且容易誤判；(2)CoI基因能夠準確區(qū)分出物種差異，具有特異性；(3)CoI基因存在于線粒體，每個生物細胞內(nèi)有若干個線粒體，檢測時可以放大，具有很高靈敏度。本發(fā)明的第二個技術目的是提供一種DNA分子標記，包含臂尾輪蟲CoI基因的三段特異性區(qū)域序列，其序列分別如SEQIDNo.1-3所示。接著提供一組引物組，包含三對引物，分別用于特異性擴增序列SEQIDNo.1-3，各自的上下游引物序列如下(如SEQIDNo.4-9所示)：(1)上游引物CoI-1F：5’-CAGCAATTTTATTAATTACTAGG-3’；下游引物CoI-1R：5’-ATAATACAGGATTGCCTCCAC-3’；(2)上游引物CoI-2F：5’-CGGCTTAATTGGTCTTAGCATA-3’；下游引物CoI-2R：5’-CCTAACATAAGTGGAATAAGTCA-3’；(3)上游引物CoI-3F：5’-TCTTCCGCTATTGATGCTG-3’；下游引物CoI-3R：5’-ACGGTCTAACGAGATTCTTT-3’。上述分子標記或引物可應用在藻類培養(yǎng)中危害臂尾輪蟲的快速定量檢測qPCR方法中。進一步地，本發(fā)明提供一種藻類培養(yǎng)中危害臂尾輪蟲的快速定量檢測qPCR方法，采用上述的特異性引物組，對待測樣品的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測。該方法較傳統(tǒng)的PCR方法具有更高的靈敏度，且操作簡便，可進行大量的樣品檢測，并對臂尾輪蟲進行定量，從而為藻類培養(yǎng)早期臂尾輪蟲污染的檢測和監(jiān)控提供有效方法。所述的快速定量檢測qPCR方法，還包括步驟：采用所述的特異性引物組，將包含目的擴增片段的基因克隆到質(zhì)粒PGEM-T中，構建的重組質(zhì)粒PGEMT-CoI作為檢測臂尾輪蟲濃度的定量標準品。所述的快速定量檢測qPCR方法，其中特異性引物：上游引物和下游引物的濃度均為10μmol/L，反應終濃度為0.25μmol/L。熒光定量PCR采用的熒光染料優(yōu)選為SYBRGreen染料，熒光檢測波長為470-514nm。優(yōu)選的，所述熒光定量PCR的反應體系為：20μL反應體系中包含：2×的LightCycler480SYBRGreenⅠMaster10μL，10μmol/L的上游引物0.5μL，10μmol/L的下游引物0.5μL，DNA模板1μL，加水至總體積20μL。所述熒光定量PCR的反應程序為：95℃5min，1個循環(huán)；95℃10s、56℃20s、72℃30s，40個循環(huán)。所述熒光定量PCR，以結果的判斷方法如下：(1)陽性對照的Ct值應小于33.0，陰性對照的Ct值應大于36.0。陽性模板為質(zhì)粒定量標準品PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3，陰性模板為無菌雙蒸水；(2)若Ct值小于33.0，且呈現(xiàn)典型的擴增曲線，則判定為陽性結果，表明檢測樣品中含有臂尾輪蟲；(3)若Ct值大于36.0或無擴增信號，則判定為陰性結果，表明檢測樣品中無臂尾輪蟲；(4)若Ct值在33.0～36.0之間，則視為可疑結果，樣品需重復檢驗一次；若結果仍在此范圍內(nèi)，則判定為陰性結果；結果呈陽性的樣品，根據(jù)其Ct值以及建立的定量標準曲線計算樣品內(nèi)的臂尾輪蟲含量；計算公式如下：樣品含臂尾輪蟲的只數(shù)(cells/ml)＝conc/N，其中N代表每只褶皺臂尾輪蟲中CoI基因的拷貝數(shù)。本發(fā)明最主要的技術效果是找到一種分子標記并設計出特異性引物，可以有效的將臂尾輪蟲在藻類培養(yǎng)過程中有其他污染原生動物存在的條件下鑒定出來。所采用的熒光定量PCR技術巧妙的利用了PCR技術的DNA高效擴增、特異性引物的高特異性以及光譜技術的敏感性和實時定量的優(yōu)點，克服了常規(guī)PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，縮短了試驗時間，簡化了實驗操作，而且熒光檢測的結果由電腦軟件分析，避免了產(chǎn)物后處理過程所致的污染，較常規(guī)PCR更為客觀、靈敏、準確。本發(fā)明的方法也可設計為臂尾輪蟲早期快速鑒定試劑盒。其具有對樣本低要求，高效率，精確檢測，省時省力省費用，效果顯著等特點。所述試劑盒中包含所述的特異性引物組。具體的，所述試劑盒可以包括檢測試劑和基因組DNA提取試劑。所述檢測試劑包括熒光染料、特異性引物、陽性標準品。所述基因組DNA提取試劑優(yōu)選包括Roche的HighPureTemplatePreparationKit試劑盒。本發(fā)明提供的檢測方法對臂尾輪蟲的檢測具有特異性強、靈敏度高的特點，利用該方法確定了單只褶皺臂尾輪蟲線粒體CoI基因的拷貝數(shù)為6332±109copies/只。該方法可檢測出的最低濃度分別可達到95.49copies/μL、8.11copies/μL、27.71copies/μL臂尾輪蟲線粒體CoI基因的存在，對藻類培養(yǎng)污染物的早期監(jiān)測具有重要意義。對本發(fā)明方法的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性以及對環(huán)境樣品的有效性進行綜合評價如下：(1)靈敏度：用滅菌雙蒸水分別將質(zhì)粒定量標準品PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3稀釋1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL，采用經(jīng)優(yōu)化后的體系進行檢測，驗證所建立的方法的靈敏度。本檢測方法在分別在103～109copies/reaction、101～109copies/reaction、101～109copies/reaction數(shù)量級范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)分別為R1＝1.00、R2＝1.00、R3＝0.99，其檢測范圍分別可達到7、9、9個數(shù)量級，其靈敏度分別可到1000、10、10拷貝以下。(2)穩(wěn)定性：我們從批間重復和批內(nèi)重復兩個方面進行評價。批內(nèi)重復性：選取同一份標本，設5個平行反應管同時進行反應，檢驗其Ct值的變異系數(shù)約為1.32％。批間重復性：選取2個不同濃度的重組質(zhì)粒標準品，一周內(nèi)重復檢驗3次，檢驗其Ct值的變異系數(shù)為1.97％和1.65％。表明本發(fā)明的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。(3)特異性：本研究選取了22份樣品進行檢測：3份輪蟲樣品，8份纖毛蟲樣品，3份變形蟲樣品，3份鞭毛蟲樣品以及5份藻類樣品。采用PCR方法進行檢測，檢測結果顯示除了臂尾輪蟲外，其余樣品均為陰性結果。附圖說明圖1是臂尾輪蟲CoI基因絕對定量的標準曲線，y1＝-3.6664×log(conc)+43.26(注：conc表示反應體系中的標準質(zhì)?？截悢?shù))。圖2是臂尾輪蟲CoI基因絕對定量的標準曲線，y2＝-3.5027×log(conc)+39.21(注：conc表示反應體系中的標準質(zhì)?？截悢?shù))。圖3是臂尾輪蟲CoI基因絕對定量的標準曲線，y3＝-3.5421×log(conc)+41.11(注：conc表示反應體系中的標準質(zhì)粒拷貝數(shù))。圖4是第一對引物熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖，從左至右的標準品濃度分別為109～103copies/μL。圖5是第二對引物熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖，從左至右的標準品濃度分別為109～101copies/μL。圖6是第三對引物熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖，從左至右的標準品濃度分別為109～101copies/μL。圖7是第一對引物特異性驗證的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M：100bpDNALadder；1：Branchionusplicatilis；2：Lecanesp.；3：Philodinasp.；4：Tetrahymenasp.；5：Euplotessp.；6：Gastrostylasp.；7：Sterkiellasp.；8：Parameciumsp.；9：Vorticellasp.；10：Cyclidiummarinum；11：Colpodasp.；12：Nucleariasimplex；13：Hartmannellasp.；14：Mayorellasp.；15：Poterioochromonasmalhamensis；16：Eeuglenasp.；17：Bodonidaesp.；18:Haematoculcuspluvialis；19：Chlamydomonas；20：Chlorella；21：Scenedesmus；22：Paraphysodermasedebokerensis；23：Water。圖8是第二對引物特異性驗證的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M：100bpDNALadder；1：Branchionusplicatilis；2：Lecanesp.；3：Philodinasp.；4：Tetrahymenasp.；5：Euplotessp.；6：Gastrostylasp.；7：Sterkiellasp.；8：Parameciumsp.；9：Vorticellasp.；10：Cyclidiummarinum；11：Colpodasp.；12：Nucleariasimplex；13：Hartmannellasp.；14：Mayorellasp.；15：Poterioochromonasmalhamensis；16：Eeuglenasp.；17：Bodonidaesp.；18:Haematoculcuspluvialis；19：Chlamydomonas；20：Chlorella；21：Scenedesmus；22：Paraphysodermasedebokerensis；23：Water。圖9是第三對引物特異性驗證的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M：100bpDNALadder；1：Branchionusplicatilis；2：Lecanesp.；3：Philodinasp.；4：Tetrahymenasp.；5：Euplotessp.；6：Gastrostylasp.；7：Sterkiellasp.；8：Parameciumsp.；9：Vorticellasp.；10：Cyclidiummarinum；11：Colpodasp.；12：Nucleariasimplex；13：Hartmannellasp.；14：Mayorellasp.；15：Poterioochromonasmalhamensis；16：Eeuglenasp.；17：Bodonidaesp.；18:Haematoculcuspluvialis；19：Chlamydomonas；20：Chlorella；21：Scenedesmus；22：Paraphysodermasedebokerensis；23：Water。圖10是第一對引物1-7和10只褶皺臂尾輪蟲檢測的熒光信號圖，從左至右分別為10和7-1只褶皺臂尾輪蟲。圖11是第二對引物1-7和10只褶皺臂尾輪蟲檢測的熒光信號圖，從左至右分別為10和7-1只褶皺臂尾輪蟲。圖12是第三對引物1-7和10只褶皺臂尾輪蟲檢測的熒光信號圖，從左至右分別為10和7-1只褶皺臂尾輪蟲。具體實施方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1.設計引物，步驟：分子條形碼方法常被用于鑒定微生物污染，目前主要研究在所有真核生物當中都存在的一個基因：細胞色素氧化酶I(CoIcytochromecoxidaseI)基因的一部分。這部分DNA序列能夠準確區(qū)分出物種差異，具有每個物種的特異性，就像物種的“身份證”編號。在藻類培養(yǎng)過程中，會出現(xiàn)不同種微生物的污染，為了明確污染物的信息，我們首次將臂尾輪蟲CoI基因作為監(jiān)測的優(yōu)先選擇。利用積累獲得的褶皺臂尾輪蟲和在GenBank獲取的1059條萼花臂尾輪蟲以及413條褶皺臂尾輪蟲CoI基因序列，以及在GenBank獲取的43條原生動物的CoI基因序列，通過生物信息學比對分析，選取序列特異性區(qū)域，應用PrimerPrimer5.0軟件，設計三對PCR引物，目的擴增片段為分別為120bp、184bp和202bp，擴增序列分別如SEQIDNo.1-3所示：SEQIDNo.1：ATAATACAGGATTGCCTCCACCCGCAGGGTCGAAGAAGGAAGTGTTAAAATTACGATCAGTAAGAAGCATAGTAATAGCACCTGCTAGTACGGGTAGCCTAGTAATTAATAAAATTGCTG；SEQIDNo.2：GGCTTAATTGGTCTTAGCATAAGGTTTCTTATTCGTCTAGAGTTAGGGGTCGTAGGGTCCTACTTAGGTGATGAGCATCTTTACAATGTTCTAGTTACTGCCCACGCTTTCGTAATGATTTTCTTTATAGTAATGCCCGTCTCTATAGGAGGTTTTGGTAATTGACTTATTCCACTTATGTTAG；SEQIDNo.3：CGGTCTAACGAGATTCTTTTTGTAGTACGAGAGCAAATAATAGTAGTTAAGAAGTTGATTCTCCCTAAAATAGAAGAAATACCTGATAGATGTAAACTAAAAATAGCTAAGTCAACTGAAACACCTGCATGATAAGTTGAGTCGGATAAAGGAGGATAAACAGTTCAACCAGTACCAGCACCAGCATCAATAGCGGAAGAAA；引物序列分別如SEQIDNo.4-9所示：1.上游引物CoI-1F：5’-CAGCAATTTTATTAATTACTAGG-3’；下游引物CoI-1R：5’-ATAATACAGGATTGCCTCCAC-3’；2.上游引物CoI-2F：5’-CGGCTTAATTGGTCTTAGCATA-3’；下游引物CoI-2R：5’-CCTAACATAAGTGGAATAAGTCA-3’；3.上游引物CoI-3F：5’-TCTTCCGCTATTGATGCTG-3’；下游引物CoI-3R：5’-ACGGTCTAACGAGATTCTTT-3’；從GenBank獲取的原生動物CoI序列的物種信息見表1：表1：從GenBank獲取的原生動物CoI序列的物種信息實施例2.質(zhì)粒定量標準品的構建和制備實驗步驟：1.定量標準品的構建利用PCR方法克隆得到含有靶基因序列的CoI基因片段，重組到載體PGEM-T中，并進行DNA序列測定。構建的重組質(zhì)粒作為定量標準品，命名為PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3。2.定量標準品的制備質(zhì)粒PGEMT-CoI用Omega質(zhì)粒提取試劑盒進行提取純化，根據(jù)Nanodrop8000測定的質(zhì)粒的濃度及質(zhì)量以及阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。計算公式如下：一個堿基對的平均分子量為660g/mol；質(zhì)粒的總長度為載體的總長度加上插入片段的長度；N：代表阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×1023copies/mol)。實施例3.基因組DNA的提取實驗步驟：1.臂尾輪蟲的收集在藻類培養(yǎng)體系中獲得的臂尾輪蟲經(jīng)清洗、饑餓72小時后，在解剖鏡下分離單只個體及多只個體，分裝入1.5mlEP(eppendorf)管中，后在解剖鏡下確認分離的個體數(shù)。后經(jīng)液氮速凍5min后置于95℃溫浴5min，重復3次后備用。2.基因組DNA的提取比較不同的DNA提取試劑盒提取臂尾輪蟲DNA的提取效率，分別采用了DNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN)、DNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)以及HighPureTemplatePreparationKit(Roche)三種試劑盒、CTAB法、珠打法和發(fā)明名稱為“一種單只輪蟲基因組DNA的快速提取方法”的專利申請所描述的方法，結果顯示HighPureTemplatePreparationKit(Roche)的提取效率最高。對收集到的臂尾輪蟲采用HighPureTemplatePreparationKit(Roche)提取試劑盒提取DNA，利用Nanodrop8000對DNA的濃度及質(zhì)量進行測定。選取濃度和質(zhì)量最佳的DNA保存?zhèn)溆?。實施?.熒光定量PCR檢測方法的建立和優(yōu)化實驗步驟：1.絕對定量標準曲線的建立1)質(zhì)粒PGEMT-CoI用Omega質(zhì)粒提取試劑盒進行提取純化，根據(jù)Nanodrop8000測定的質(zhì)粒的濃度及質(zhì)量以及阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。2)定量PCR反應條件優(yōu)化通過對反應體系中不同濃度的定量PCR引物和不同公司的supermix以及反應程序中不同的退火溫度和退火時間等的實驗結果進行比較，選擇反應靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型S型擴增熒光信號曲線、反應效率接近于1的反應體系和反應條件。本發(fā)明使用的熒光定量PCR儀為Roche公司的LightCycle@96。熒光檢測的程序設置在每個循環(huán)第三步結束時采集熒光信號，檢測波長為470-514nm。定量PCR循環(huán)采用三步法，退火和延伸分開進行。反應體系的篩選：反應條件的篩選：條件篩選條件退火溫度52℃、54℃、56℃、58℃退火時間10s、20s、30s經(jīng)優(yōu)化的定量PCR程序為：經(jīng)優(yōu)化的定量PCR反應體系(20μL反應體系)為：3)絕對定量的擴增標準曲線建立用滅菌雙蒸水10倍梯度稀釋定量標準品PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3。稀釋后質(zhì)粒濃度分別為1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL，采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進行反應。檢測結束后利用熒光PCR自帶的軟件(LightCycler96SW1.1)繪制標準曲線(圖1、圖2、圖3)。本檢測方法的三對引物分別在103～109copies/reaction、101～109copies/reaction、101～109copies/reaction數(shù)量級范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系分別為R1＝1.00、R2＝1.00、R3＝0.99，其檢測范圍分別可達到7、9、9個數(shù)量級，其靈敏度分別可到1000、10、10拷貝以下(圖4、圖5、圖6)。檢測反應中單只臂尾輪蟲CoI基因的拷貝數(shù)的計算公式：(a、b取于標準曲線y＝ax+b)樣品中臂尾輪蟲濃度的計算公式：樣品含臂尾輪蟲的只數(shù)(cells/ml)＝conc/N(注：N代表每只褶皺臂尾輪蟲中CoI基因的拷貝數(shù))2.穩(wěn)定性分析從批間重復性和批內(nèi)重復性兩個方面進行評價建立的熒光定量PCR反應體系的穩(wěn)定性。1)批內(nèi)重復性檢驗:選取同一份標本，按照實施例2和3所述的方法對其提取核酸。采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件設置5個平行反應管同時進行反應，利用統(tǒng)計學方法檢驗其Ct值的變異系數(shù)。批內(nèi)重復性檢測的Ct值的變異系數(shù)(CV)分別為1.32％。2)批間重復性檢驗：選取2個不同濃度的重組質(zhì)粒標準品，采用實施例4所述的反應體系和條件，一周內(nèi)重復檢測3次，利用統(tǒng)計學方法檢驗其Ct值的變異系數(shù)。批間重復性檢測的Ct值的變異系數(shù)(CV)分別為1.97％和1.65％。表明本發(fā)明建立的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。3.特異性分析1)為檢驗建立的熒光定量PCR方法的適用性，本研究選取了22份樣品進行檢測：3份輪蟲樣品，8份纖毛蟲樣品，3份變形蟲樣品，3份鞭毛蟲樣品以及5份藻類樣品。采用PCR方法進行檢測，檢測結果顯示除了臂尾輪蟲外，其余樣品均為陰性結果(圖7、圖8、圖9)。4.檢測結果的判定及臂尾輪蟲的定量1)陽性對照的Ct值應小于33.0，陰性對照的Ct值應大于36.0。陽性模板為質(zhì)粒定量標準品PGEMT-CoI-1、PGEMT-CoI-2和PGEMT-CoI-3，陰性模板為無菌雙蒸水。2)若Ct值小于33.0，且呈現(xiàn)典型的擴增曲線，則判定為陽性結果，表明檢測樣品中含有臂尾輪蟲。3)若Ct值大于36.0或無擴增信號，則判定為陰性結果，表明檢測樣品中無臂尾輪蟲。4)若Ct值在33.0～36.0之間，則視為可疑結果，樣品需重復檢驗一次。若結果仍在此范圍內(nèi)，則判定為陰性結果。結果呈陽性的樣品，根據(jù)其Ct值以及建立的定量標準曲線計算樣品內(nèi)的臂尾輪蟲含量。計算公式如下：樣品含臂尾輪蟲的只數(shù)(cells/ml)＝conc/N(注：N代表每只褶皺臂尾輪蟲中CoI基因的拷貝數(shù))實施例5.線粒體CoI基因拷貝數(shù)的確定實驗步驟：分別取1-7以及10只褶皺臂尾輪蟲收集于1.5mlEP管內(nèi)。按照實施例2和3所述的方法對其提取核酸。采用經(jīng)優(yōu)化后的體系和條件進行反應。檢測結束后按照實施例4所述的方法結合標準曲線分別計算出數(shù)量不同的褶皺臂尾輪蟲的CoI基因拷貝數(shù)，再計算單只褶皺臂尾輪蟲的線粒體CoI基因拷貝數(shù)。檢測結果見表2，不同引物檢測的熒光信號見圖10、圖11、圖12。計算公式如下：單只褶皺臂尾輪蟲的線粒體CoI基因拷貝數(shù)(copies/cell)＝conc×V/M(注：V代表提取DNA時的溶解體積與實驗中所用DNA體積的比值，M代表褶皺臂尾輪蟲只數(shù))表2.數(shù)量不同的褶皺臂尾輪蟲的熒光定量PCR結果利用該方法確定了單只褶皺臂尾輪蟲線粒體CoI基因的拷貝數(shù)為6332±109copies/只。該方法對臂尾輪蟲的檢測具有特異性強、靈敏度高的特點，該方法可檢測出的最低濃度分別可達到95.49copies/μL、8.11copies/μL、27.71copies/μL臂尾輪蟲線粒體CoI基因的存在，對藻類培養(yǎng)污染物的早期監(jiān)測具有重要意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。序列表<110>國家開發(fā)投資公司中國科學院水生生物研究所<120>藻類培養(yǎng)中臂尾輪蟲的快速定量檢測qPCR方法<130>P1610236<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>120<212>DNA<213>臂尾輪蟲CoI基因序列片段<400>1ataatacaggattgcctccacccgcagggtcgaagaaggaagtgttaaaattacgatcag60taagaagcatagtaatagcacctgctagtacgggtagcctagtaattaataaaattgctg120<210>2<211>184<212>DNA<213>臂尾輪蟲CoI基因序列片段<400>2ggcttaattggtcttagcataaggtttcttattcgtctagagttaggggtcgtagggtcc60tacttaggtgatgagcatctttacaatgttctagttactgcccacgctttcgtaatgatt120ttctttatagtaatgcccgtctctataggaggttttggtaattgacttattccacttatg180ttag184<210>3<211>202<212>DNA<213>臂尾輪蟲CoI基因序列片段<400>3cggtctaacgagattctttttgtagtacgagagcaaataatagtagttaagaagttgatt60ctccctaaaatagaagaaatacctgatagatgtaaactaaaaatagctaagtcaactgaa120acacctgcatgataagttgagtcggataaaggaggataaacagttcaaccagtaccagca180ccagcatcaatagcggaagaaa202<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4cagcaattttattaattactagg23<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5ataatacaggattgcctccac21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6cggcttaattggtcttagcata22<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7cctaacataagtggaataagtca23<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8tcttccgctattgatgctg19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9acggtctaacgagattcttt20當前第1頁1 2 3