一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法。該方法的步驟為：制備濃度為2×103～2×106PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，再將蛭弧菌稀釋液與谷氨酸鈉和蔗糖的混合溶液按體積比1∶1混合，得到蛭弧菌制劑；將蛭弧菌制劑與預(yù)處理過的含輪蟲類的水樣進行混合。本發(fā)明提供的方法簡單易行，適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，其中所含有的谷氨酸鈉和蔗糖，對水體及輪蟲本身無毒副作用，同時不會引起水體的污染和輪蟲等有益水生浮游生物的死亡。通過本發(fā)明的方法可有效控制輪蟲攜帶的總菌，在24h內(nèi)即可控制總菌數(shù)在103cfu/mL以內(nèi)，并在較長時間內(nèi)減緩其再生。
【專利說明】一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛭弧菌【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]輪蟲(英文名rotifer)常見于世界各處的淡水中，同時在咸水、咸淡水或海水中也多有發(fā)現(xiàn)。多數(shù)自由游泳，有些寄生。常見的有旋輪屬、豬吻輪屬、腔輪屬和水輪屬等，為目前大規(guī)模工業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖中，許多海洋魚類和蝦類不可缺少的活食用生物。其營養(yǎng)方式單一，成活率高、來源廣泛，同時又具備營養(yǎng)豐富、方便水產(chǎn)動物攝食等特點，從而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，重點用于飼喂水產(chǎn)生物幼體。與有機傳統(tǒng)餌料相比，使用輪蟲投喂水產(chǎn)生物幼體具有成本低、幼體成活比高等優(yōu)勢。但是，如果輪蟲自身攜帶過多細菌，那么將對輪蟲的生存及養(yǎng)殖應(yīng)用造成巨大影響及危害?？偧毦鷶?shù)目過多，潛在的致病菌存在的可能性也就更大，其中可能存在的致病菌的種類和數(shù)目也會增加，會給對其進行慮食的水產(chǎn)生物幼體造成病害。養(yǎng)殖戶在水產(chǎn)生物育苗的過程中，會對引入的輪蟲等餌料進行簡單的過濾，或?qū)ζ涫┯孟緞┮赃_到消毒的目的，這不但影響了輪蟲的活性、可能還會引入新的細菌，更有可能在一定程度上殺死輪蟲等浮游生物，同時破壞了養(yǎng)殖的水生生態(tài)環(huán)境，對水產(chǎn)生物的育苗產(chǎn)生不利影響。
[0003]因此，在使用輪蟲作為優(yōu)質(zhì)餌料對水產(chǎn)生物育苗時，都應(yīng)當對于其中攜帶的全部細菌引起重視。國內(nèi)的許多研究都致力于將蛭弧菌制劑應(yīng)用于控制病原菌，利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，將蛭弧菌制劑施用于水體當中，可有效控制水體中的總細菌數(shù)目，從而降低其對于水產(chǎn)生物造成侵害的可能，從源頭上控制水產(chǎn)生物病害的發(fā)生。目前將蛭弧菌制劑應(yīng)用于控制水生浮游生物輪蟲所攜帶的的總菌尚無報道。為了有效保障養(yǎng)殖水體及活生物餌料輪蟲等的安全性，簡單的消毒處理方式已無法滿足需求。
[0004]應(yīng)用蛭弧菌制劑控制輪蟲所攜帶的的總菌，從源頭上對水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在的可能致病細菌進行防控，以形成具有疾病防預(yù)功能的養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)，具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法。該方法創(chuàng)新性提出了一種蛭弧菌制劑在控制有益浮游生物輪蟲所攜帶的總菌的方式；并可以適當?shù)难娱L其制劑中的菌體活性。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，包括以下步驟:
[0007](I)制備蛭弧菌稀釋液；
[0008](2)將步驟⑴制備的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合，即得到蛭弧菌制劑；
[0009](3)含輪蟲的水樣的預(yù)處理；
[0010](4)將步驟⑵獲得的蛭弧菌制劑與步驟(3)的含輪蟲的水樣進行混合。
[0011]所述的蛭弧菌優(yōu)選為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ;對所述的蛭弧菌進行進行負染后于電子顯微鏡下觀察形態(tài)可知:BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65 X 0.2 μ m,端生鞭毛，鞭毛長度為1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)四天可形成直徑I?2mm的透明圓形卩遼菌斑；
[0012]所述的蛭弧菌稀釋液優(yōu)選通過以下步驟獲得:
[0013]①宿主菌濃縮液的制備:挑取大腸桿菌單菌落(大腸桿菌E.coli，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GIM1.355),接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每10mL培養(yǎng)液收集的沉淀用2?3mL DNB(dilutednutrient broth)液體培養(yǎng)基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0014]②蛭弧菌稀釋液的制備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1: 1:50的比例進行混合，恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液過濾，濾液使用質(zhì)量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，制備得到2 X 13?2 X 16PFU (plaque-forming unit) /mL的蛭弧菌稀釋液；
[0015]所述的蛭弧菌優(yōu)選為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02,為2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170 ；
[0016]步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基優(yōu)選為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆茫?br> [0017]步驟①中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為200rpm、28°C培養(yǎng)18h ；
[0018]步驟①中所述的離心的條件優(yōu)選為4°C、6000rpm離心20min ；
[0019]步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件優(yōu)選為230rpm、28°C培養(yǎng)；
[0020]步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件優(yōu)選為6000rpm、4°C離心20min ；
[0021]步驟②中所述的過濾優(yōu)選為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾；
[0022]步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，優(yōu)選通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶,用蒸懼水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2?7.6，121 °C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆茫?br> [0023]步驟②中所述的質(zhì)量體積比(g/mL) 1.5%鹽度的滅菌蒸餾水優(yōu)選用海水晶制備得到；
[0024]步驟(2)中所述的保護劑優(yōu)選為質(zhì)量體積比(g/mL) 5?25%谷氨酸鈉和質(zhì)量體積比(g/mL) 5?25%鹿糖的混合溶液；
[0025]步驟(2)中所述的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合優(yōu)選按照蛭弧菌稀釋液與保護劑進行體積比1:1混合；
[0026]步驟(3)中所述的含輪蟲的水樣的預(yù)處理方法，包括如下步驟:采集自天然的海口養(yǎng)殖水體的水樣，將從養(yǎng)殖水體取得的水樣靜置30?35min，用40目的篩網(wǎng)過濾，濾去肉眼可見的雜質(zhì)等，再用80目的篩網(wǎng)濾去較小的泥砂，即為含輪蟲的水樣；經(jīng)觀察計數(shù)，其輪蟲數(shù)目在20?25個/mL之間；
[0027]步驟(4)中所述的混合優(yōu)選將蛭弧菌制劑與含輪蟲的水樣按照體積比1: (10?100)混合；
[0028]本發(fā)明的機理是:通過向培養(yǎng)好的蛭弧菌中添加谷氨酸鈉及蔗糖，制備成為一種蛭弧菌制劑，分別探討不同濃度的蛭弧菌制劑對于輪蟲所攜帶的總菌的控制效果。
[0029]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果:
[0030](I)本發(fā)明獲得了一種蛭弧菌制劑的制備方法，通過該方法制備得到的蛭弧菌制劑可以在較長的時間內(nèi)維持其制劑中蛭弧菌裂解活性。
[0031](2)本發(fā)明制備的蛭弧菌制劑中含有保護劑(谷氨酸鈉和蔗糖的混合液)，而谷氨酸鈉和蔗糖的混合液對水體及輪蟲本身無毒副作用，同時不會引起水體的污染和輪蟲等有益水生浮游生物的死亡。
[0032](3)本發(fā)明提供的蛭弧菌制劑的制備方法簡單易行，適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，其中所含有的谷氨酸鈉和蔗糖，選材廣泛價格低廉，適用于推廣使用。
[0033](4)本發(fā)明提供的該種蛭弧菌制劑可以有效的控制輪蟲所攜帶的的總菌，在24h內(nèi)即可控制總菌數(shù)目在103cfu/mL以內(nèi)，并在較長的時間內(nèi)減緩其再生。
[0034](5)本發(fā)明中所述的蛭弧菌制劑的濃度可以根據(jù)實際應(yīng)用的需要進行適當?shù)恼{(diào)整，以達到最佳的控制輪蟲所攜帶的總菌目的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是實驗組A、實驗組B、實驗組C和實驗組Cl的實驗效果比對圖。
[0036]圖2是實驗組A、實驗組B、實驗組D和實驗組Dl的實驗效果比對圖。
[0037]圖3是實驗組A、實驗組B、實驗組E和實驗組El的實驗效果比對圖。
[0038]圖4是實驗組A、實驗組B、實驗組F和實驗組Fl的實驗效果比對圖。
[0039]圖5是實驗組A、實驗組B、實驗組C、實驗組D、實驗組E和實驗組F的實驗效果比對圖。

【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0041]下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件。
[0042]蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02為2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M209170。對所述的蛭弧菌進行進行負染后于電子顯微鏡下觀察形態(tài)可知:BDS02呈單細胞，弧形，大小為
0.65X0.2 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)四天可形成直徑I?2mm的透明圓形卩遼菌斑。蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02在中國專利申請文件“申請?zhí)?200910042275.0，名稱為:一種消除水產(chǎn)品革蘭氏陽性致病菌的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”中公開。
[0043]實施例1
[0044]具體實驗方法如下:
[0045]一、材料、培養(yǎng)基和溶液
[0046](I)材料
[0047]蛭弧菌:BDS02。
[0048]宿主菌:大腸桿菌GMl.355，購于廣東省微生物所菌種保藏中心。
[0049]含輪蟲的水樣:采集自海南省文昌市鋪前鎮(zhèn)的海水養(yǎng)殖場的含有褶皺臂尾輪蟲(Brach1nus plicatilis)的海洋水體的水樣,經(jīng)觀察計數(shù),其輪蟲數(shù)目大約在20個/mL。
[0050](2)培養(yǎng)基
[0051]2216E佐貝爾海洋細菌培養(yǎng)基:海水晶15g，蛋白胨5g，酵母浸膏l(xiāng)g，磷酸高鐵
0.0lg，蒸餾水100mL, ρΗ7.6?7.8，瓊脂15g。121。。0.1MPa下滅菌20min后傾注平板保存?zhèn)溆谩?br> [0052]TCBS瓊脂培養(yǎng)基(弧菌選擇性培養(yǎng)基):TCBS瓊脂89g，加入蒸餾水lOOOmL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，傾注滅菌平板保存?zhèn)溆谩?br> [0053]營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆谩?br> [0054]DNB液體培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯0.8g/L，酪蛋白酸水解物0.5g/L，酵母提取物0.lg/L,15g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2?7.6，121 °C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆谩?br> [0055](3)溶液
[0056]PBS (磷酸緩沖液)緩沖液(0.1M):量取0.2mol/L磷酸二氫鈉(27.8g磷酸二氫鈉定容至100mL) 28mL和0.2mol/L磷酸氫二鈉(53.65g七水磷酸氫二鈉定容至100mL) 72mL混合均勻，用蒸餾水定容至200mL，即為0.1moI/LPBS溶液，pH約為7.2。
[0057]二、實驗方法
[0058](I)宿主菌濃縮液的制備
[0059]挑取大腸桿菌單菌落(大腸桿菌E.coli，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GMl.355)，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，200rpm、28 °C培養(yǎng)18h，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液4°C、6000rpm離心20min，棄上清，每10mL培養(yǎng)液收集的沉淀用2?3mLDNB(diluted nutrient broth)液體培養(yǎng)基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4?保存?zhèn)溆茫?br> [0060](2)蛭弧菌稀釋液的制備
[0061]按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1:1:50的比例進行混合，230rpm、28 V恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h,得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液6000rpm、4°C離心20min,取上清液用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾，濾液使用質(zhì)量體積比(g/mL) 1.5 %鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，分別得到I X 103PFU/mL、I X 104PFU/mL、I X 105PFU/mL 和 lX106PFU/mL 與 2 X 13PFU (plaque-forming unit)/mL、2 X 104PFU/mL、2X105PFU/mL和2X 106PFU/mL共8種濃度的蛭弧菌稀釋液。
[0062](3)蛭弧菌制劑樣品的制備
[0063]將步驟(2)中培養(yǎng)稀釋后的2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL、2X 105PFU/mL 和2X106PFU/mL4種濃度的蛭弧菌稀釋液，按照體積比1:1的比例添加含有質(zhì)量體積比(g/mL)6% (w/v)鹿糖和質(zhì)量體積比(g/mL)6% (w/v)谷氨酸鈉的混合溶液,從而得到制備出的均含有質(zhì)量體積比(g/mL)3% (w/v)鹿糖和質(zhì)量體積比(g/mL)3% (w/v)谷氨酸鈉的4種濃度的蛭弧菌制劑。
[0064]使用DNB雙層平板法檢測其蛭弧菌制劑中蛭弧菌的活菌濃度并記錄，即作為蛭弧菌制劑，并可將其應(yīng)用于控制輪蟲所攜帶的的總菌當中。
[0065](4)實驗用樣品的處理及實驗組設(shè)置
[0066]實驗用水樣的處理:由于輪蟲大小多為100?300 μ m，可通過80目篩網(wǎng)(孔徑約180 μ m)，但不可通過200篩網(wǎng)(孔徑75 μ m)，因此在處理實驗用水樣時，將從養(yǎng)殖水體取得的水樣若干靜置30min，用40目的篩網(wǎng)過濾，濾去肉眼可見的雜質(zhì)等，再用80目的篩網(wǎng)濾去較小的泥砂，即為實驗所使用的水體樣本。吸取ImL水樣進行觀察，記錄其中的輪蟲數(shù)目，即為實驗用所含輪蟲的水樣。
[0067]實驗組設(shè)置:對于所取養(yǎng)殖水體，通過設(shè)置對照組、不同濃度的蛭弧菌制劑進行實驗，每個實驗組別的具體設(shè)置如下，即實驗組A?Fl:
[0068]實驗組A:每50mL實驗水樣中添加ImL滅菌的質(zhì)量體積比(g/mL) 15%。鹽度蒸餾水，作為對照組。
[0069]實驗組B:每50mL實驗水樣中添加ImL含有質(zhì)量體積比(g/mL) 3% (w/v)谷氨酸鈉和質(zhì)量體積比(g/mL) 3% (w/v)鹿糖的混合溶液。
[0070]實驗組C:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為103PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0071]實驗組Cl:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為103PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌制劑。
[0072]實驗組D:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為104PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0073]實驗組Dl:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為104PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌制劑。
[0074]實驗組E:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為105PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0075]實驗組El:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌制劑。
[0076]實驗組F:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為106PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0077]實驗組Fl:每50mL實驗水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為106PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護劑的蛭弧菌制劑。
[0078]實驗組A?Fl的10個實驗組別，每個做3個平行，每個平行樣品水樣為50mL，使用三角燒瓶盛裝，置于無菌恒溫箱內(nèi)，室溫25°C放置Id后開始進行實驗，容器上方覆蓋滅菌塑料膜密封，防止灰塵等雜物污染，以使水體中的細菌菌群達到穩(wěn)定。對于實驗組A?F1，每24h添加一次對應(yīng)的實驗樣品，按照后續(xù)的檢測要求進行檢測。
[0079](5)取樣檢測
[0080]對于所有實驗組別，在添加蛭弧菌制劑等后立即取樣檢測，即為Oh的檢測值，后續(xù)每隔24h取樣進行檢測，取樣時間點分別為0h、24h、48h、72h和96h，取樣的全過程都嚴格遵循無菌操作，具體操作方法如下:
[0081]對于輪蟲的取樣處理方式:吸取不同實驗組的水樣，透過200目篩網(wǎng)，將留于篩網(wǎng)上的輪蟲，使用接種針挑取相同個數(shù)的輪蟲(10個)放入滅菌培養(yǎng)皿，再通過研缽碾碎后，用IrnL的質(zhì)量體積比(g/mL) 15%。咸淡水沖洗，整個取樣過程都嚴格遵循無菌操作，在超凈臺內(nèi)進行，所得的液體即為待檢測輪蟲樣品。
[0082](6)總細菌數(shù)的檢測
[0083]在到達設(shè)定的檢測時間點時，將步驟(5)中的取樣處理后的輪蟲樣品使用PBS緩沖液按10倍梯度進行稀釋，取各梯度稀釋液0.lmL，均勻涂布于2216E佐貝爾海洋細菌培養(yǎng)基平板，將平板倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?5d，計算出樣品中的總細菌濃度，單位為cfu/mL0
[0084](7)數(shù)據(jù)分析
[0085]實驗中各實驗組3個平行樣品菌數(shù)檢測的數(shù)值取平均值，使用MS Excel進行顯著性分析，可信度高，菌數(shù)檢測結(jié)果均以平均數(shù)土標準差的形式表示。
[0086]三、實驗結(jié)論
[0087]蛭弧菌制劑對輪蟲所攜帶的總菌的控制
[0088](I)濃度為103PFU/mL的蛭弧菌制劑的實驗效果比對
[0089]圖1可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數(shù)量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目維持在107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達到3.51 X 107cfu/mLo添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組,其中的總細菌數(shù)的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目對數(shù)值變化在±0.13個數(shù)量級，并且在96h時其終總菌數(shù)達到穩(wěn)定，為3.83X 107cfu/mL。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內(nèi)總細菌數(shù)變化無顯著差異，并且組內(nèi)不同時間點時的總細菌數(shù)，在O?96h內(nèi)無明顯差異。添加濃度為103PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組Cl)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于的總菌有一定程度的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.72X 107cfu/mL降至8.77X 105cfu/mL,并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以在一定程度上減緩總細菌數(shù)的增長；添加濃度為103PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組C)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.72X 107cfu/mL降至3.47X 104cfu/mL,并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌制劑組均存在顯著差異。
[0090](2)濃度為104PFU/mL的蛭弧菌制劑的實驗效果比對
[0091]圖2可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數(shù)量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目維持在107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達到3.51 X 107cfu/mLo添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組,其中的總細菌數(shù)的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目對數(shù)值變化在±0.13個數(shù)量級，并且在96h時其終總菌數(shù)達到穩(wěn)定，為3.83X 107cfu/mL。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內(nèi)總細菌數(shù)變化無顯著差異，并且組內(nèi)不同時間點時的總細菌數(shù)，在O?96h內(nèi)無明顯差異。添加濃度為104PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組Dl)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.72X10Tcfu/mL降至1.28 X 105cfu/mL，并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為104PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組D)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.47X 107cfu/mL降至1.64X 13Cfu/mL，并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌制劑組均存在顯著差異。
[0092](3)濃度為105PFU/mL的蛭弧菌制劑的實驗效果比對
[0093]圖3可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數(shù)量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目維持在107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達到3.51 X 107cfu/mLo添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組,其中的總細菌數(shù)的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目對數(shù)值變化在±0.13個數(shù)量級，并且在96h時其終總菌數(shù)達到穩(wěn)定，為3.83X 107cfu/mL。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內(nèi)總細菌數(shù)變化無顯著差異，并且組內(nèi)不同時間點時的總細菌數(shù)，在O?96h內(nèi)無明顯差異。添加濃度為105PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組El)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.72X 107cfu/mL降至5.44X 106cfu/mL，并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為105PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組E)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.63X 107cfu/mL降至2.77 X 14Cfu/mL，并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌制劑組均存在顯著差異。
[0094](4)濃度為106PFU/mL的蛭弧菌制劑的實驗效果比對
[0095]圖4可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數(shù)量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目維持在107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達到3.51 X 107cfu/mLo添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組,其中的總細菌數(shù)的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目對數(shù)值變化在±0.13個數(shù)量級，并且在96h時其終總菌數(shù)達到穩(wěn)定，為3.83X 107cfu/mL。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內(nèi)總細菌數(shù)變化無顯著差異，并且組內(nèi)不同時間點時的總細菌數(shù)，在O?96h內(nèi)無明顯差異。添加濃度為106PFU/mL的不含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組El)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.72X10Tcfu/mL降至2.19 X 106cfu/mL，并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以在一定程度上減緩細菌的增長；添加濃度為106PFU/mL的含有保護劑的蛭弧菌制劑組別(即實驗組E)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?24h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細菌數(shù)目快速下降，由初始的3.89 X 107cfu/mL降至5.19 X 14Cfu/mL，并且隨著每24h添加入蛭弧菌制劑，可以有效的減緩細菌的增長，其相同時間點總細菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護劑的蛭弧菌制劑組均存在顯著差異。
[0096]綜上所述，對比發(fā)現(xiàn)，所有不含有3%谷氨酸鈉+3%蔗糖的單純蛭弧菌制劑在控制輪蟲攜帶細菌中的效果均沒有含有3%谷氨酸鈉+3%蔗糖的混合蛭弧菌制劑的效果好，其2者存在顯著差異，因此說明，添加了保護劑的蛭弧菌制劑在控制輪蟲中總細菌數(shù)目的效果上，好于未添加的組別，因此后面的研究集中于對比不同濃度的含有保護劑蛭弧菌制劑對于輪蟲攜帶細菌的控制效果。
[0097](5)不同濃度蛭弧菌制劑效果比對
[0098]圖5可以清晰看出，實驗期間，對照組中的總細菌數(shù)量隨著時間的推移變化不顯著，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目維持在107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達到3.51 X 107cfu/mLo添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組,其中的總細菌數(shù)的變化趨勢與對照組相同，在O?96h內(nèi)其總細菌數(shù)目對數(shù)值變化在±0.13個數(shù)量級，并且在96h時其終總菌數(shù)達到穩(wěn)定，為3.83X 107cfu/mL。上述兩個實驗組，相同時間點差異不大，O?96h內(nèi)總細菌數(shù)變化無顯著差異，并且組內(nèi)不同時間點時的總細菌數(shù)，在O?96h內(nèi)無明顯差異。添加不同濃度的含有保護劑的蛭弧菌制劑的組別均對于輪蟲所攜帶的的總菌有較好的控制效果，觀察對比103PFU/mL、104PFU/mL、105PFU/mL和16PFU/mL4種濃度的含有保護劑的蛭弧菌制劑的控制效果發(fā)現(xiàn)，104PFU/mL濃度的蛭弧菌制劑可以對輪蟲所攜帶的的總菌有較好的控制效果，其在24h就可以使其中的總細菌數(shù)目下降3?4個數(shù)量級，而其他濃度的蛭弧菌制劑在24h時，對于輪蟲所攜帶的的總菌的控制效果沒有104PFU/mL濃度的蛭弧菌制劑好,但仍然具備一定的控制效果。
[0099]同時，對比對照組和質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL)3%蔗糖組發(fā)現(xiàn)，向含有輪蟲的水體中投放濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL)3%蔗糖的混合溶液并未使其中的總細菌數(shù)目有顯著變化，并且不含有保護劑的蛭弧菌制劑具有一定的控制效果，但是沒有與保護劑共同使用時的協(xié)同效果好，這表明在制備蛭弧菌制劑中添加的谷氨酸鈉和蔗糖對于含有輪蟲的水體及輪蟲本身無污染及毒副作用，還可以獲得更加優(yōu)異的控制效果。因此，其可以用于蛭弧菌制劑的制備當中。
[0100]總之，104PFU/mL的含有質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%蔗糖蛭弧菌制劑，即可在24h快速的降低輪蟲所攜帶的的總菌數(shù)目，并且隨著每24h添加一次蛭弧菌制劑，對于輪蟲所攜帶的總菌的控制效果可以在較長時間內(nèi)得到維持，是一種良好的防控水體及輪蟲所攜帶的總菌的有益菌制劑，將其投入大規(guī)模生產(chǎn)后，相信其可以對當前的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及食品加工行業(yè)都產(chǎn)生重大深遠的影響。
[0101]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備蛭弧菌稀釋液； (2)將步驟(I)制備的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合，即得到蛭弧菌制劑； (3)含輪蟲的水樣的預(yù)處理； (4)將步驟(2)獲得的蛭弧菌制劑與步驟(3)的含輪蟲的水樣進行混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209170。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌稀釋液的濃度為2 X 13?2X 106PFU/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的保護劑為質(zhì)量體積比5?25%谷氨酸鈉和質(zhì)量體積比5?25%蔗糖的混合溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合按照蛭弧菌稀釋液與保護劑進行體積比1:1混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的含輪蟲的水樣中的輪蟲數(shù)目在20?25個/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的混合是將蛭弧菌制劑與含輪蟲的水樣按照體積比1: (10?100)混八口 ο
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌稀釋液通過以下步驟獲得: ①宿主菌濃縮液的制備:挑取大腸桿菌單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每10mL培養(yǎng)液收集的沉淀用2?3mL DNB液體培養(yǎng)基懸浮，得到宿主菌濃縮液，4°C保存?zhèn)溆茫? ②蛭弧菌稀釋液的制備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1:1:50的比例進行混合，恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液,培養(yǎng)48h,得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液過濾，濾液使用質(zhì)量體積比1.5%鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，制備得到.2 X 13?2 X 106PFU/mL的蛭弧菌稀釋液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆茫? 步驟①中所述的培養(yǎng)的條件為200rpm、28°C培養(yǎng)18h ； 步驟①中所述的離心的條件為4°C、6000rpm離心20min ； 步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件為230rpm、28°C培養(yǎng)； 步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件為6000rpm、4°C離心20min ； 步驟②中所述的過濾為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進行過濾； 步驟②中所述的質(zhì)量體積比1.5%鹽度的滅菌蒸餾水用海水晶制備得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控制輪蟲攜帶的總細菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，.0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C02F3/34GK104126530SQ201410269825
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】蔡俊鵬, 孫秋平 申請人:華南理工大學