本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及基因的甲基化檢測(cè)中使用的硫化劑。

背景技術(shù)：

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程。哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’上，其中，80％的CpG二核苷酸是被甲基修飾的，其余的20％非甲基化的CpG二核苷酸高度聚集，廣泛分布于啟動(dòng)子區(qū)域以及編碼基因的第一外顯子區(qū)，命名為CpG島。CpG島異常甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素，由于CpG島的局部高度甲基化要早于細(xì)胞惡性增生，故其甲基化的檢測(cè)可用于腫瘤的預(yù)測(cè)。甲基化可作為腫瘤等早期診斷的生物標(biāo)記物和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，對(duì)腫瘤的篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)都具有重要的意義。

DNA甲基化分析通常需要對(duì)DNA進(jìn)行硫化轉(zhuǎn)化修飾。提取的游離DNA經(jīng)過(guò)硫化試劑作用，DNA上未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，再通過(guò)特異性的引物和探針進(jìn)行PCR即可得到目的基因的甲基化情況及水平。

目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的甲基化硫化方法大部分都是使用高濃度的亞硫酸氫鈉作為硫化試劑。高濃度亞硫酸氫鈉極其難溶，配制不方便且浪費(fèi)時(shí)間，而且其硫化強(qiáng)度較弱，硫化所需時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要2-3個(gè)小時(shí)甚至是過(guò)夜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明其中一個(gè)明的目的在于提供一種高效省時(shí)硫化強(qiáng)度高的硫化劑及其配套試劑盒和硫化方法。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種基因甲基化檢測(cè)硫化劑，該硫化劑包括亞硫酸氫銨和無(wú)水亞硫酸鈉；

根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了一種基因甲基化檢測(cè)硫化劑，硫化劑為亞硫酸氫銨和無(wú)水亞硫酸鈉的混合液，使用水作為溶劑；

根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了一種基因甲基化檢測(cè)硫化劑，其中亞硫酸氫銨所占體積比為55～95％，無(wú)水亞硫酸鈉的濃度為0.1～0.2g/mL；

根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了一種基因甲基化檢測(cè)硫化劑，亞硫酸氫銨所占體積比為75％，所述無(wú)水亞硫酸鈉為0.1g/mL；

根據(jù)本發(fā)明的還有一些方面，提供了一種包含上述硫化劑的基因甲基化檢測(cè)硫化試劑盒，包括亞硫酸氫銨和無(wú)水亞硫酸鈉的混合液，還包括DNA保護(hù)液；

根據(jù)本發(fā)明的還有一些方面，提供了一種包含上述硫化劑的基因甲基化檢測(cè)硫化試劑盒，試劑盒包括亞硫酸氫銨所占體積比為75％、無(wú)水亞硫酸鈉濃度為0.1g/mL和DNA保護(hù)液，所述DNA保護(hù)液為VE(維生素E)和四氫呋喃的混合液，VE的濃度為0.125g/mL；

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種硫化基因的方法，該硫化方法使用上述的硫化試劑盒，方法如下：將100ul待檢DNA溶液和190ul硫化試劑與30ul DNA保護(hù)液混合，在80°C反應(yīng)1小時(shí)，所述待檢DNA溶液中DNA含量0.1～2ng。

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是傳統(tǒng)硫化劑硫化效率低操作不便的問(wèn)題，本發(fā)明的硫化劑硫化效率高、硫化完全、操作簡(jiǎn)單省時(shí)。

本發(fā)明采用的其中一個(gè)技術(shù)方案是：一種對(duì)基因甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾的方法，包括步驟為：將待測(cè)DNA樣品以硫化試劑進(jìn)行高溫硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)對(duì)所述的不同濃度的待測(cè)DNA樣品的參數(shù)范圍的判讀，判斷所述待測(cè)DNA樣品的硫化程度，進(jìn)而檢測(cè)基因的甲基化情況。

本發(fā)明能夠檢測(cè)的DNA樣品來(lái)源可為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì)胞DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。

本發(fā)明其中一種硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系為：100ul DNA+190ul硫化試劑+30ul DNA保護(hù)液。其中，硫化試劑為亞硫酸氫銨和無(wú)水亞硫酸鈉的混合液，所述DNA保護(hù)液為四氫呋喃和VE的混合液。

本發(fā)明其中一種的硫化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件為：80℃反應(yīng)1小時(shí)。本發(fā)明首次使用亞硫酸氫銨和無(wú)水亞硫酸鈉的混合液作為DNA甲基化的硫化轉(zhuǎn)化試劑，與市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的DNA甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾用的硫化劑和方法相比，本發(fā)明的具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)無(wú)水亞硫酸鈉在亞硫酸氫銨中極易溶解，硫化試劑配制簡(jiǎn)單省時(shí)。(2)該方法全過(guò)程只需1個(gè)小時(shí)，且不需要98℃高溫解鏈，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快捷。(3)硫化完全，在(90％)非甲基化DNA存在的背景下仍能檢測(cè)到目的基因的甲基化(結(jié)果見(jiàn)圖2)；(4)硫化效率高，0.1ng陽(yáng)性DNA經(jīng)過(guò)本發(fā)明提供的硫化轉(zhuǎn)化修飾方法仍能全部檢出(結(jié)果見(jiàn)圖2)，傳統(tǒng)的硫化轉(zhuǎn)化修飾方法檢測(cè)的最低限為0.5ng。(5)安全，整個(gè)體系不包含有毒有害物質(zhì)，對(duì)試驗(yàn)人員以及環(huán)境都無(wú)危害。

綜上所述，本發(fā)明的一種對(duì)基因甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾具有硫化效率高、硫化完全、試劑配制省時(shí)便宜、操作簡(jiǎn)單快速、安全性等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，對(duì)基因甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾提供了一種更好的方法。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1是本發(fā)明的對(duì)基因甲基化檢測(cè)中硫化轉(zhuǎn)化修飾后甲基化模板和非甲基化模板的示意圖.

圖2是利用本發(fā)明的對(duì)基因甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾方法中目的基因甲基化檢測(cè)擴(kuò)增曲線圖.

圖3是利用本發(fā)明的對(duì)基因甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾方法和市場(chǎng)上常用的硫化轉(zhuǎn)化修飾方法對(duì)比檢測(cè)目的基因甲基化擴(kuò)增的結(jié)果。

圖4是本發(fā)明中不同濃度組成的硫化試劑對(duì)甲基化陽(yáng)性DNA的檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

基因甲基化檢測(cè)中，如圖1所示，經(jīng)過(guò)硫化轉(zhuǎn)化修飾后，DNA上未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，再通過(guò)特異性的引物和探針進(jìn)行PCR即可得到目的基因的甲基化情況及水平。

實(shí)施例1

材料：待檢血漿樣本、0.1ng/ul甲基化陽(yáng)性DNA樣品、1ng/ul甲基化陰性DNA樣品,甲基化陽(yáng)性DNA樣品和甲基化陰性DNA樣品均來(lái)源于細(xì)胞。

儀器：Lightcycler 480、水浴鍋、滅菌鍋。

試劑：亞硫酸氫銨(日本W(wǎng)AKO公司)、無(wú)水亞硫酸鈉(Aladdin)、四氫呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)

DNA來(lái)源于血漿DNA和細(xì)胞DNA，其中血漿DNA采用蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥有限公司的血漿游離DNA提取試劑進(jìn)行提??；細(xì)胞DNA采用血液組織細(xì)胞DNA提取試劑(天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP304)進(jìn)行提取，反應(yīng)用的總量一般為0.1ng～2ng。

硫化反應(yīng)的體系和反應(yīng)條件：硫化反應(yīng)體系的組成為：100ul總量為0.5ng的DNA+190ul硫化試劑+30ul DNA保護(hù)液。硫化試劑為75％(v/v)的亞硫酸氫銨和0.1g/mL的無(wú)水亞硫酸鈉的水混合液。DNA保護(hù)液為0.125g/mL的VE和四氫呋喃的混合液。

硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的具體條件為：80℃反應(yīng)1小時(shí)。如果不立即進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)，可放置20℃保存至20小時(shí)。市場(chǎng)上常見(jiàn)的硫化轉(zhuǎn)化修飾方法如若反應(yīng)后不立即進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)一般需放置在4℃冰箱中保存，本發(fā)明可放置于室溫20小時(shí)，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4中的曲線1表示75％(v/v)的亞硫酸氫銨和0.1g/mL的無(wú)水亞硫酸鈉組成的硫化試劑對(duì)甲基化陽(yáng)性DNA的檢測(cè)結(jié)果。若有擴(kuò)增信號(hào)，且呈S型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明有甲基化存在；若無(wú)擴(kuò)增曲線升起，說(shuō)明未發(fā)生甲基化，擴(kuò)增的Cp值越小，證明效果越好。圖4曲線1的結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線呈S型，Cp為30左右，證明本發(fā)明的硫化方法硫化效果較好。

進(jìn)行上述硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，對(duì)修飾后DNA進(jìn)行純化回收，最后進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增曲線如圖2所示：其中曲線1表示利用本發(fā)明的硫化方法，在90％非甲基化DNA存在的背景下目的基因的甲基化檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線呈S型，擴(kuò)增結(jié)果較好，證明在90％非甲基化DNA存在的背景下也可檢測(cè)到目的基因的甲基化表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明的硫化方法硫化較完全，硫化效果好；曲線2表示血漿樣本DNA經(jīng)本發(fā)明的硫化方法硫化后的擴(kuò)增曲線圖，結(jié)果證明了本發(fā)明的硫化方法可用于檢測(cè)血漿DNA甲基化；曲線3表示0.1ng的完全甲基化的陽(yáng)性DNA即低濃度的甲基化DNA經(jīng)過(guò)本發(fā)明提供的硫化方法仍能準(zhǔn)確檢出。說(shuō)明本發(fā)明的硫化方法硫化效率高。

本技術(shù)發(fā)明人用市場(chǎng)上常用的zymo硫化方法和本發(fā)明提供的硫化方法做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)20ng全甲基化陽(yáng)性DNA，驗(yàn)證了本發(fā)明提供的DNA甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾反應(yīng)對(duì)后續(xù)反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，如圖3所示：其中曲線1為利用市場(chǎng)上常用的zymo硫化方法檢測(cè)目的基因甲基化擴(kuò)增的結(jié)果；曲線2為利用本發(fā)明的對(duì)基因甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾方法檢測(cè)目的基因甲基化擴(kuò)增的結(jié)果。兩種方法的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S型，且Cp值無(wú)明顯差別，證明兩種方法效果一致，說(shuō)明本發(fā)明提供的DNA甲基化硫化轉(zhuǎn)化修飾反應(yīng)對(duì)后續(xù)反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，硫化較完全。并且發(fā)明人驗(yàn)證未加無(wú)水亞硫酸鈉，直接用亞硫酸氫銨水溶液硫化后反應(yīng)液會(huì)有白色絮狀沉淀出現(xiàn)，加入無(wú)水亞硫酸鈉后，無(wú)沉淀產(chǎn)生。

實(shí)施例2

材料：1ng/ul甲基化陽(yáng)性DNA樣品，甲基化陽(yáng)性DNA樣品來(lái)源于細(xì)胞。

儀器：Lightcycler 480、水浴鍋、滅菌鍋。

試劑：亞硫酸氫銨(日本W(wǎng)AKO公司)、無(wú)水亞硫酸鈉(Aladdin)、四氫呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)

細(xì)胞DNA采用血液組織細(xì)胞DNA提取試劑(天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP304)進(jìn)行提取，反應(yīng)用的總量一般為0.1ng～2ng。

硫化反應(yīng)體系的組成為：100ul總量為1.0ng的DNA+190ul硫化試劑+30ul DNA保護(hù)液。

硫化試劑為55％(v/v)的亞硫酸氫銨和0.15g/mL的無(wú)水亞硫酸鈉的混合液。DNA保護(hù)液為0.125g/mL的VE和四氫呋喃的混合液。

硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的具體條件為：80℃反應(yīng)1小時(shí)。進(jìn)行上述硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，對(duì)修飾后DNA進(jìn)行純化回收，最后進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4中的曲線2，結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線呈S型，Cp為32左右，說(shuō)明本發(fā)明的硫化方法硫化效果較好。

實(shí)施例3：

材料：1ng/ul甲基化陽(yáng)性DNA樣品，甲基化陽(yáng)性DNA樣品來(lái)源于細(xì)胞。

儀器：Lightcycler 480、水浴鍋、滅菌鍋。

試劑：亞硫酸氫銨(日本W(wǎng)AKO公司)、無(wú)水亞硫酸鈉(Aladdin)、四氫呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)

細(xì)胞DNA采用血液組織細(xì)胞DNA提取試劑(天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP304)進(jìn)行提取，反應(yīng)用的總量一般為0.1ng～2ng。

硫化反應(yīng)體系的組成為：100ul總量為1.0ng的DNA+190ul硫化試劑+30ul DNA保護(hù)液。

硫化試劑為95％(v/v)的亞硫酸氫銨和0.2g/mL的無(wú)水亞硫酸鈉的混合液。DNA保護(hù)液為0.125g/mL的VE和四氫呋喃的混合液。

硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的具體條件為：80℃反應(yīng)1小時(shí)。進(jìn)行上述硫化轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，對(duì)修飾后DNA進(jìn)行純化回收，最后進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4中的曲線3，結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線呈S型，Cp為32左右，說(shuō)明本發(fā)明的硫化方法硫化效果較好。