本發(fā)明涉及分子標記領域，具體提供了一種利用分子標記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法。

背景技術：

黃瓜砧木合力二號是山東省華盛農(nóng)業(yè)股份有限公司最新培育的優(yōu)良黃瓜砧木品種，該品種嫁接親和力好，嫁接后黃瓜長勢壯旺，抗病性增強。嫁接后瓜條黑亮順直，提高了商品性。適宜保護地春秋及越冬種植。該品種在雜交制種過程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉來完成雜交過程，母本去雄不徹底或漏去雄，都將會極大地影響制種純度。因此鑒定雜交砧木種子純度至關重要。

傳統(tǒng)的砧木雜交種子純度鑒定工作仍然以田間種植鑒定為主，通過嫁接黃瓜外觀形狀比較鑒定，該方法鑒定一般需要2個月，時間長、費用高、難度大且準確性差，需要鑒定人員具有豐富的經(jīng)驗，且易受栽培措施和環(huán)境條件的影響，嚴重影響品種鑒定的效率及準確性，越來越不能滿足現(xiàn)代育種工作和生產(chǎn)經(jīng)營的需要。

室內純度檢測通常采用分子標記技術，該技術從DNA水平上揭示子代與親本間的遺傳差異，不受環(huán)境條件和栽培措施的影響，無組織、器官及發(fā)育特異性，能夠檢測微小的變異，不受植株生長季節(jié)的限制，多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高，可以大大縮短鑒定時間?，F(xiàn)有技術中出現(xiàn)過采用三對引物運用多重PCR的方法進行南瓜純度鑒定，但不能檢測相應砧木純度，且多重PCR體系復雜，所需時間較長，無法再短時間內獲得鑒定結果，同時成本較高，難以在本領域廣泛推廣應用；因此如何利用該技術更好更快的實現(xiàn)對黃瓜砧木合力二純度的鑒定成為亟待解決的問題之一

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術的情況，提供了一種利用分子標記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法，該方法采用專門設計的EST-SSR引物，以合力二的基因組DNA為模板進行擴增，通過對擴增結果的特異譜帶對待檢測黃瓜砧木合力二的F1代種子純度進行檢測，采用這種方法可以在黃瓜砧木合力二植株生長的任何時期進行鑒定，能夠將雜交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開來；準確性高，應用推廣前景廣闊，為開展砧木制種和良種的及時銷售提供科學依據(jù)。

本發(fā)明所針對的黃瓜砧木品種為合力二，合力二是山東省華盛農(nóng)業(yè)股份有限公司經(jīng)多年研究選育出的優(yōu)良黃瓜砧木品種，該品種嫁接親和力好，嫁接后黃瓜長勢壯旺，抗病性增強。嫁接后瓜條黑亮順直，提高了商品性。適宜保護地春秋及越冬種植。

為了對合力二進行品種純度的鑒定，獲得母本和父本的優(yōu)良雜交品種，本發(fā)明的發(fā)明人首先提供了一對EST-SSR引物，命名為HELI2，其正向序列為5’-GAATCAGAGGAAGGTTTGCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列為5’-CACTTCCTTCATGCTTCTCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

在獲得上述引物之后發(fā)明人利用其對待測品種黃瓜砧木合力二的雜交種及其親本的幼根基因組DNA進行了擴增，具體過程如下：

(1)提取黃瓜砧木合力二雜交種及其親本幼根基因組DNA；

(2)以第(1)步提取的基因組DNA為模板，用EST-SSR引物HELI2進行PCR擴增：

PCR反應體系為10μL，其中包括10×PCR Buffer 1μL，0.2mM dNTPs，DNA模板100ng，引物各5μM，0.5U Taq DNA聚合酶，無菌超純水補齊至10μL；

擴增程序為：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35個循環(huán)；72℃終延伸5min；PCR產(chǎn)物保存于10℃；

發(fā)明人經(jīng)過多次試驗后發(fā)現(xiàn)，針對本發(fā)明的發(fā)明目的，以及專門設計的特異性引物，擴增程序中將退火溫度設置為55℃時，擴增效果最好，最終檢測的結果更加貼近與實際情況，故而將本發(fā)明的退火溫度設定為55℃。除此之外，與現(xiàn)有的其他類似擴增程序相比，發(fā)明人針對合力二進行品種純度鑒定的要求，將預變性和變性溫度提高到95℃，使得變性效果更好，同時將72℃延伸時間縮短，每個循環(huán)縮短了40s，使得整個鑒定過程更快，且對結果沒有任何不良影響。

(3)擴增產(chǎn)物檢測：5μL擴增產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液混合，之后經(jīng)丙烯酰胺質量體積比為8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，180v恒定電壓電泳1.5h，銀染顯色進行帶型統(tǒng)計；

其中所采用的非變性聚丙烯酰胺凝膠中丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺的質量比為29∶1；

所采用的上樣緩沖液選自10×甘油凝膠上樣液；

(4)根據(jù)特異譜帶的擴增結果鑒定“黃瓜砧木合力二”雜交種的純度，判定標準為：

母本具有177bp特異譜帶,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；父本具有159bp特異譜帶,其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；雜交種具有159bp和177bp兩條特異譜帶；

根據(jù)上述鑒定結果，可以換算黃瓜砧木合力二品種純度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N為待測砧木種子數(shù)目，n為單獨具有父本譜帶特征或單獨具有母本譜帶特征或既不同于“黃瓜砧木合力二”譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數(shù)目。

上述方法中發(fā)明人并沒有采用常規(guī)的葉片提取基因組DNA的方式，而是選用了幼根提取這樣就大大縮短了材料生長時間，這是由于發(fā)明人經(jīng)過多次試驗后發(fā)現(xiàn)，針對本發(fā)明的發(fā)明目的，選取幼根可提取出適合純度鑒定的基因組DNA，與葉片無差別甚至更加準確，但選取幼根會大大縮短材料準備時間，較之采用葉片提取基因組DNA的方式縮短了7天，同時提取幼根更加方便快捷。

利用上述方法，即可實現(xiàn)對黃瓜砧木合力二品種純度的快速檢測，能夠不受栽培措施和環(huán)境條件的影響；無器官、組織及發(fā)育特異性，該方法在植株生長的任何時期均可進行鑒定，同時將最低檢測時限從葉片期降低到了幼根期，大大縮短了待測植株的培育時間；多態(tài)性豐富、共顯性遺傳：能夠將雜交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開來；對DNA質量要求不高且需要量少；成本較低、操作簡單；該方法在苗期即可進行鑒定，節(jié)省大量人力、物力和土地資源；重復性和穩(wěn)定性較好；快速高效：一周之內即可完成種子純度鑒定工作；準確性高：該方法從基因組水平上揭示子代與親本間的遺傳差異，克服了田間表型鑒定帶來的誤差；應用推廣前景廣闊：可以快速、準確檢測“黃瓜砧木合力二”雜交種純度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明雜交種“黃瓜砧木合力二”種子檢測特征引物的PCR電泳圖譜，

其中，P1為“黃瓜砧木合力二”母本；F1為多組“黃瓜砧木合力二”F1雜交種；P2為“黃瓜砧木合力二”父本，

結果顯示：“黃瓜砧木合力二”F1雜交種擁有分別來自父、母本的177bp和159bp的兩條帶；

圖2為不同PCR退火溫度對“黃瓜砧木合力二”商品種子樣品的純度檢測結果的影響電泳圖譜；

其中，P1為“黃瓜砧木合力二”母本；F1為“黃瓜砧木合力二”F1雜交種；P2為“黃瓜砧木合力二”父本，

結果顯示，最佳退火溫度在55℃時，最易區(qū)分黃瓜砧木合力二雜交種純度；

圖3為不同DNA模板量對“黃瓜砧木合力二”商品種子樣品的純度檢測結果的影響電泳圖譜，

其中，P1為“黃瓜砧木合力二”母本；F1為“黃瓜砧木合力二”F1雜交種；P2為“黃瓜砧木合力二”父本，

結果顯示，DNA模板量從100ng至1000ng均可用于“黃瓜砧木合力二”商品種子樣品的純度檢測。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領域現(xiàn)有技術；下數(shù)實施例中的百分比除特殊注明外，均為重量百分比。

實施例1 黃瓜砧木合力二品種幼根基因組DNA的獲取

具體操作方法如下：

(1)將“黃瓜砧木合力二”親本與F1種子放入鋪有潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中，30℃黑暗培養(yǎng)3d后取幼根；

其中，該品種在雜交制種過程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉來完成雜交過程，最后收獲母本上的F1代種子；

(2)每個離心管中放入一個幼根，加入60-65℃預熱的500μL提取緩沖液，放入鋼珠4粒，于破碎機上將材料打碎，60-65℃水浴20-30min；

其中所述的提取緩沖液為2×CTAB提取液，其配比如下：

高溫滅菌，冷卻至室溫，加2mL巰基乙醇，室溫保存，

(3)上步獲得的液體經(jīng)10000rpm/min離心10min，取上清于另一離心管，加入等體積(500μL)苯酚：氯仿：異戊醇(體積比為25:24:1)混合液；

(4)上步混合液經(jīng)10000rpm/min離心10min，取上清液于另一離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(體積比為24:1)混合溶液；

(5)上步混合液經(jīng)10000rpm/min離心10min，取上清溶液于另一離心管中，加入400μL異丙醇混勻；

(6)上步混合液經(jīng)12000rpm/min離心15min，棄上清，固體物質用70％乙醇洗滌，晾干；

(7)向上述固體中加入200μL ddH₂O回溶，加入1μLRNA酶37℃水浴30min，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

實施例2 PCR擴增

以上述獲得的RNA酶解混合物為模板，利用HELI2引物進行PCR擴增：

PCR反應體系為10μL，其中包括10×PCR Buffer 1μL，0.2mM dNTPs，引物各5μM，0.5U Taq DNA聚合酶，模板100ng，無菌超純水補齊至10μL；

根據(jù)本發(fā)明針對性設置擴增程序為：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35個循環(huán)；72℃終延伸5min；PCR產(chǎn)物保存于10℃。

實施例3 擴增產(chǎn)物檢測

5μL擴增產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液混合，之后經(jīng)丙烯酰胺質量體積比為8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，180v恒定電壓電泳1.5h，銀染顯色進行帶型統(tǒng)計；

所采用的上樣緩沖液選自10×甘油凝膠上樣液；

其中所述的12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠配方(100mL)如下：

其中所采用的30％丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺配置過程如下：

丙烯酰胺29g甲叉雙丙烯酰胺1g蒸餾水定容至100mL 4℃避光保存，保質期一個月；

所采用的10╳TBE配置過程如下：

Tris Base 27g，硼酸13.75g，0.5M/L EDTA 10mL，蒸餾水定容至250mL，調pH至8.3；

所采用的10％過硫酸銨(APS)以過硫酸銨0.1g和蒸餾水1mL的比例現(xiàn)用現(xiàn)配。

電泳緩沖液為1×TBE，電泳結束后，凝膠顯色采用銀染方法，具體過程如下：

1.水洗：ddH₂O水洗2次，每次1min；

2.染色：用1‰AgNO₃浸泡，平行搖動10-15min；

3.水洗：倒掉顯色液，ddH₂O水洗2次，每次1min；

4.顯影：在盤中加入顯色液(每升顯色液中含有16g氫氧化鈉和8mL甲醛，余量為純凈水)，然后平行搖動直至顯影清楚；

5.終止：用終止液(每升終止液中含有7.5g碳酸化鈉，余量為純凈水)浸泡2min，后加入ddH₂O水清洗1-2次；最后用相機照相保存。

實施例4 鑒定“黃瓜砧木合力二”雜交種的純度

根據(jù)特異譜帶的電泳結果鑒定“黃瓜砧木合力二”雜交種的純度，判定標準為：

母本具有177bp特異譜帶；父本具有159bp特異譜帶；雜交種具有159bp和177bp兩條特異譜帶；

根據(jù)上述鑒定結果，可以換算黃瓜砧木合力二品種純度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N為待測西瓜種子數(shù)目，n為單獨具有父本譜帶特征或單獨具有母本譜帶特征或既不同于“黃瓜砧木合力二”譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數(shù)目。

實驗例

以2015年生產(chǎn)的黃瓜砧木合力二種子為例，收獲F1代種子后馬上將F1代種子進行催芽萌發(fā)，大約2d后取幼根提取砧木基因組DNA，利用本發(fā)明的黃瓜砧木合力二分子標記進行純度鑒定，4d即可獲得的種子純度結果；

利用常規(guī)鑒定方法即田間種植形態(tài)鑒定：需到海南進行加代純度鑒定，生長周期約為60天左右，且受到多種惡劣天氣影響，可能需多次重復播種鑒定，鑒定時間不好估計。具體比較如下表：

可見與常規(guī)鑒定方法相比較，利用該分子標記法鑒定黃瓜砧木合力二雜交種子純度快速高效、操作簡單、重復性好、成本較低。

<110>李興盛

<120>一種利用分子標記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法

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<212>DNA

<213>人工序列

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