本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體地說，是一種基于二聚體突變引物建立的熒光定量PCR方法定量檢測曲霉菌并同步進行基因分型的方法。

背景技術(shù)：

曲霉菌包括132個種和18個變種，占空氣中真菌的12％左右，是通過空氣傳播的常見霉菌，早在1848年就被視為感染根源，不僅會影響人和動物的健康，，還會給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失。

近年來，隨著在器官、骨髓和造血干細胞移植，HIV，腫瘤放化療等所導(dǎo)致的免疫力低下患者增多，條件致病菌——曲霉菌引起的侵襲性真菌感染逐年升高，臨床上最常見的是煙曲霉(A.fumigatus)，黃曲霉(A.flavus)，土曲霉，黑曲霉(A.niger)，雜色曲霉(A.versicolor)，等，其中黃曲霉的致病率占90％。

雖然已有大量的抗真菌藥物上市，但缺乏早期的快速準(zhǔn)確的檢測曲霉菌的實驗室方法，致使臨床曲霉病的病死率居高不下(>30％)，若未及時治療，病死率可達90％以上。而臨床上對曲霉菌病的治療費用昂貴，許多患者會放棄治療。故一種早期快速準(zhǔn)確的診斷曲霉菌的實驗室診斷方法，可以有效降低曲霉病病死率和醫(yī)療負擔(dān)。

傳統(tǒng)的曲霉菌檢測方法有培養(yǎng)法、影像學(xué)檢查、組織病理學(xué)檢查等方法，如大部分實驗室需要根據(jù)真菌的菌落表現(xiàn)特征以及顯微鏡下特征性的分子孢子頭和足細胞來鑒定，過程需要7～14天。傳統(tǒng)的檢測方法存在檢測時間長，陽性率低等缺陷。另外也有一些非傳統(tǒng)的檢測方法，如乳膠凝集法、半乳甘露聚糖法等，乳膠凝集法存在檢測敏感度低及假陽性率高等問題；眾多學(xué)者對半乳甘露聚糖法的特異性和靈敏性高低存在爭論。隨著技術(shù)的發(fā)展，PCR方法進入到臨床檢測領(lǐng)域，特別是實時熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)技術(shù)的應(yīng)用，不僅可以早期準(zhǔn)確檢測，還可以進行定量和分型檢測。

Real-time PCR分為內(nèi)摻式染料技術(shù)和探針技術(shù)兩類。內(nèi)摻式染料技術(shù)采用的染料一般為溴化乙啶、YO-PRO 1和SYBR Green。其原理是利用游離DNA染料不發(fā)射熒光，而與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光值大大增強，從而進行DNA定量。并且還可通過熒光信號監(jiān)測產(chǎn)物解鏈溫度差異，進行熔解曲線分析，根據(jù)不同DNA產(chǎn)物會產(chǎn)生不同的熔解曲線，而實現(xiàn)基因分型。其優(yōu)勢在于能夠監(jiān)測任何雙鏈DNA，只需設(shè)計普通引物，使檢測方法簡化，成本低。但也正是由于染料能夠與任何雙鏈DNA結(jié)合，因此其也能和非特異性產(chǎn)物如引物二聚體、非特異擴增產(chǎn)物、雙鏈模板等結(jié)合，產(chǎn)生非特異熒光信號，降低了特異性，故不適于臨床檢測。

探針技術(shù)采用了基于熒光淬滅原理或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的探針，包括TaqMan探針、Amplifluor探針、分子信標(biāo)、蝎型探針等。這些探針均是在與模板互補的同一寡核苷酸鏈上，分別標(biāo)記熒光基團和淬滅基團，每一次擴增中通過水解或者雜交等方式破壞兩者之間的FRET，從而發(fā)出與擴增產(chǎn)物數(shù)等量的熒光信號，故其特異性高，定量準(zhǔn)確，因而廣泛應(yīng)用于科研和臨床診斷中。但這些探針屬于多標(biāo)記探針，其合成難度和成本較高，制約了其推廣應(yīng)用。不少研究人員試圖采用單標(biāo)記探針來降低合成難度和成本，如雜交探針(hybridization probes)和熒光置換探針(displacing probes)^[12]，取得了較好效果。但為防止探針與靶序列雜交引起自身延伸而被破壞，仍然需要在探針末端磷酸化來阻斷其延伸，因此，并非真正意義的單標(biāo)記探針技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種對4種曲霉菌同步定量和基因分型的二聚體突變熒光引物定量PCR方法。

基于二聚體突變引物技術(shù)建立的熒光定量PCR方法的工作原理：

將熒光報告基團標(biāo)記在一條引物的5’端，稱為上游引物，淬滅基團標(biāo)記在與熒光引物互補的寡核苷酸鏈的3’端上，稱為上游引物互補鏈，在上游引物互補鏈序列中，人為設(shè)計一個堿基突變；另外還設(shè)計一條和靶基因另一端互補的引物，稱為下游引物；將三種寡核苷酸鏈加入PCR反應(yīng)體系，無靶基因時，兩者將相互結(jié)合形成二聚體，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)，不會發(fā)射熒光；一旦存在靶基因，由于熒光引物與靶基因完全互補，而上游引物互補鏈存在1個突變堿基，在較高溫度下，熒光引物與靶基因的親和力大于與上游引物互補鏈間的親和力，從而優(yōu)先和靶基因結(jié)合，在PCR體系中發(fā)揮普通引物引導(dǎo)延伸的功能，標(biāo)記的熒光基團隨引物整合在新生PCR產(chǎn)物中起探針的指示作用，所有新生PCR產(chǎn)物均被熒光基團標(biāo)記，此時，F(xiàn)RET被破壞，反映PCR產(chǎn)物量的熒光信號可被實時定量檢測；通過熒光信號監(jiān)測產(chǎn)物解鏈溫度差異，進行熔解曲線分析，實現(xiàn)基因分型。

上述技術(shù)方案的原理：將熒光報告基團標(biāo)記在引物上，而淬滅基團標(biāo)記在與熒光引物互補的寡核苷酸鏈上，即兩條互補的寡核苷酸只分別標(biāo)記了相應(yīng)的淬滅或者報告基團。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計可巧妙地回避對淬滅鏈末端進行封閉，因為它雖與引物互補，而3’端已被淬滅基團阻斷，而PCR不能從5’端延伸，所以不需要對5’端進行磷酸化阻斷；而引物僅5’端標(biāo)記了熒光報告基團，引物與靶基因結(jié)合后，可從3’端延伸完成靶基因復(fù)制進行定量；擴增完成后由于引物標(biāo)記有熒光基團，新生的DNA產(chǎn)物將被熒光基團示蹤，如果擴增的DNA有堿基差異或長度差異，進行熔解曲線分析時，可以將不同序列的產(chǎn)物按熔解溫度差異區(qū)分出來，實現(xiàn)基因分型(結(jié)構(gòu)和工作原理見圖1)。

這樣的設(shè)計實現(xiàn)了真正的單標(biāo)記結(jié)構(gòu)，故合成、純化簡單且成本低，克服了普通多標(biāo)記探針法成本高的難題。是一種高通用性、高特異性和靈敏性、操作簡單、價廉的新型real-time PCR技術(shù)，不但具有探索性和創(chuàng)新性，還具有臨床應(yīng)用價值，可望產(chǎn)生良好的社會效益和經(jīng)濟效益。故我們成功的將這種方法應(yīng)用于曲霉菌的檢測中去，實現(xiàn)了定量檢測和基因分型。

本發(fā)明利用生物信息學(xué)分析尋找適合曲霉菌(煙曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌和土曲霉菌)定量和分型的序列，采用PRIMER EXPRESS 2.0軟件設(shè)計可同時定量和分型的一對引物及標(biāo)記猝滅基團的互補鏈。提取DNA后，以最適的體系和循環(huán)條件在熒光定量PCR儀上進行擴增，同時本發(fā)明采用取黑曲霉菌DNA構(gòu)建定量的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。最終通過分析擴增曲線和溶解曲線，實現(xiàn)對4種曲霉菌同時定量和分型。

具體包括以下步驟：

(1)生物信息學(xué)分析尋找適合曲霉菌定量和分型的序列設(shè)計引物和互補鏈序列

在GenBank數(shù)據(jù)庫獲取得4種曲霉菌(煙曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌和土曲霉菌)基因組序列的登錄號，選擇5.8srRNA、28srRNA基因、ITS區(qū)的DNA序列，通過核酸分析軟件DNAman尋找出適合定量和分子分型的DNA區(qū)域(圖2)。PRIMER EXPRESS 2.0軟件設(shè)計可同時定量和分型的一對引物：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

上游引物互補鏈：GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'

(SEQ ID No.3)，引物中堿基以斜體標(biāo)記的序列是人為設(shè)計堿基突變，使引物和互補鏈不完全匹配。

進一步地，本發(fā)明的熒光報告基團可供選擇的有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，熒光淬滅基團有BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcy1。

(2)真菌培養(yǎng)和DNA提取

從廣東省菌種保存中心購買曲霉菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株：煙曲霉菌(ATCC 36607)，黑曲霉(ATCC 16888),黃曲霉(ATCC 16883)和土曲霉(ATCC 16792)，沙堡弱培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。

(3)構(gòu)建定量的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

用普通PCR法擴增黑曲霉菌的分型和定量序列，純化DNA，pMD-18T質(zhì)粒TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。測序鑒定后，對陽性克隆菌進行增菌繁殖，純化獲取大量重組質(zhì)粒作為DNA模板，為real-time PCR方法的建立提供可靠的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

上游引物序列：5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物序列：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

(3)Real-time PCR體系和循環(huán)參數(shù)

擴增體系為：

循環(huán)條件為：

(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和建立曲霉菌real-time PCR分子分型的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線圖譜

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍倍比稀釋成10⁷-10¹copies/ml濃度梯度，計算機自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線圖譜的建立：定量檢測擴增完成后，進行熔解曲線分析。同時對4種標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測，進行熔解曲線分析，獲取它們自身特異的熔解曲線圖譜，建立真菌分型的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線圖譜。從左至右代表黑曲霉(A.niger)，黃曲霉(A.flavus)，煙曲霉(A.fumigatus)，土曲霉(A.terreus)，解鏈溫度分別為：82.42℃，83.90℃，84.35℃，85.81℃(見圖4)。

在本發(fā)明的一個實施例中，采用上述法對曲霉菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和白假絲酵母菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、志賀菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及傷寒沙門菌提取DNA后用建立的方法進行檢測，分析Real-time PCR檢測的特異性，結(jié)果顯示具有很好的特異性。

在本發(fā)明的另一個實施例中，通過對3個系列標(biāo)準(zhǔn)品(1×10⁴～1×10¹²copies/ml)和一種濃度臨床樣品重復(fù)做5個平行管，定量結(jié)果計算SD和CV，進行批內(nèi)重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示具有很好的重復(fù)性。

本發(fā)明還提供一種對煙曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于擴增適合曲霉菌定量和分型的序列的引物，其中：

上游引物：5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)，

下游引物：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)，

上游引物互補鏈：5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3)，互補鏈中堿基以斜體標(biāo)記的序列是人為設(shè)計堿基突變，使上游引物和互補鏈不完全匹配。

所述的試劑盒，上游引物5’端標(biāo)記的熒光報告基團可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一種，上游引物互補鏈3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TMRQ、Lowa Black^TMFQ、Dabcy1中的任意一種。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述試劑盒在用于檢測和基因分型煙曲霉菌、黑曲霉菌、黃曲霉菌和土曲霉菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明基于上述設(shè)計方案，可利用一對引物——一條含有報告熒光集團的上游引物，一條和上游互補的淬滅熒光基團的引物、一條普通下游引物，在同一PCR反應(yīng)體系中，同時對4種曲霉菌定量檢測和基因分型。該法的各項技術(shù)指標(biāo)經(jīng)評價都達到臨床要求，方法具有靈敏度高、特異性好、檢測速度快、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點，可用于臨床診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后判斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有較高的臨床診斷價值，適于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1是基于二聚體突變引物技術(shù)建立的熒光定量PCR方法工作原理圖；

i:二聚體熒光突變引物與模板DNA，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用，熒光基團被抑制；ii:變性時，包括二聚體熒光突變引物的所有雙鏈DNA解鏈,FRET也被破壞；iii:退火時，引物復(fù)性優(yōu)先與完全互補的靶基因結(jié)合；iv:產(chǎn)物延伸階段；v:再次變性；熒光基團摻入新生鏈,此時FRET消失熒光信號被檢測到，同時可進行熔解曲線分析。

圖2是對曲霉菌定量和分型序列和引物位置的示意圖；

圖3是不同濃度標(biāo)本熒光定量PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4是4種曲霉菌基因分型標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線圖譜；

熔解曲線從左至右代表黑曲霉A.niger(82.42)，黃曲霉A.flavus(83.90)，煙曲霉A.fumigatus(84.35)，土曲霉A.terreus(85.81)，括弧數(shù)值代表熔解溫度。

圖5是顯示特異性和重復(fù)性熒光擴增圖；

左圖：除陽性黑曲霉菌對照有熒光擴增曲線外，白假絲酵母菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、志賀菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌均無擴增曲線。右圖：1×10⁴～1×10²copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)品5次重復(fù)熒光擴增曲線。

圖6是4株臨床菌株測定的擴增曲線和溶解曲線圖；

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實施例1】4種曲霉菌的定量和基因分型檢測

擴增體系的準(zhǔn)備：

(1)所需試劑：PCR-mix buffer(Takara)，模板DNA

(2)引物混合液：為各2.0μM的三條引物組成的混合液

1.真菌培養(yǎng)和DNA提取

將標(biāo)準(zhǔn)菌株煙曲霉菌(ATCC 36607)，黑曲霉(ATCC 16888),黃曲霉(ATCC 16883)和土曲霉(ATCC 16792)，利用沙堡弱培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。

2.構(gòu)建定量的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

用普通PCR法擴增黑曲霉菌DNA序列：

上游引物序列為：5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1)；

下游引物序列為：5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。

擴增條件和體系同Real-time PCR。

將擴增產(chǎn)物純化(Axygen PCR產(chǎn)物純化試劑盒)，pMD-18T質(zhì)粒TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α(參考Takara pMD-18T vector說明書步驟)。測序(華大基因測序)鑒定后，對陽性克隆菌進行增菌繁殖，純化獲取大量重組質(zhì)粒作為后續(xù)real-time PCR方法的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

3.Real-time PCR

以提取的各菌株DNA和前面所制作的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，按照下面體系和循環(huán)條件進行擴增：

擴增體系為：

循環(huán)條件為：

4.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍倍比稀釋成10⁷-10¹copies/ml濃度梯度，計算機自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實驗所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線R值大于0.99，具有優(yōu)秀的線性，見圖3：從左至右代表的濃度為1×10⁷～1×10¹copies/ml。

5.基因分型結(jié)果判定

PCR循環(huán)擴增產(chǎn)物后，不同曲霉菌DNA序列的熔解溫度不同，示蹤的熒光基團解離后，熒光值發(fā)生改變，從而4種不同曲霉菌的DNA序列會得到不同的熒光曲線，本法基因分型結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，4種曲霉菌基因分型熔解曲線見圖4。

【實施例2】對本方法進行特異性和重復(fù)性分析

特異性：采用本法對曲霉菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和白假絲酵母菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、志賀菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及傷寒沙門菌提取DNA后用建立的方法進行檢測，分析Real-time PCR檢測的特異性，擴增曲線見圖5左。

重復(fù)性：批內(nèi)重復(fù)性通過對3個系列標(biāo)準(zhǔn)品(1×10⁴～1×10²copies/ml)和1.5×10³濃度臨床樣品重復(fù)做5個平行管，定量結(jié)果計算SD和CV。

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒1×10²～1×10⁴copies/ml，SD分別：0.707,0.1845，0.3172，CV分別為：4.79％，5.83％，4.94％，擴增曲線見圖5右。

臨床樣品濃度為1.5×10³copies/ml，SD：0.1283，CV：6.25％，

本法特異性和重復(fù)性均較好。

【實施例3】4株臨床菌株的測定

根據(jù)上述描述的方法，我們從臨床搜集了經(jīng)生化驗證的四株不同類型的曲霉菌進行檢測。擴增曲線和溶解曲線的結(jié)果如圖6所示，本發(fā)明可同步的定量檢測4種不同類型的曲霉菌。

圖6左：擴增曲線從左至右分別是黃曲霉、煙曲霉、黑曲霉、土曲霉；

圖6右：熔解曲線從左至右代表黑曲霉，黃曲霉，煙曲霉，土曲霉。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南醫(yī)學(xué)院

<120> 對4種曲霉菌同步定量和基因分型的二聚體突變熒光引物定量PCR方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

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<212> DNA

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